Liệu pháp miễn dịch nói chung và liệu pháp miễn dịch tế bào nói riêng nhắm đến việc kích hoạt hệ miễn dịch của người bệnh, thúc đẩy đáp ứng miễn dịch với ung thư, cho phép khả năng tự nh
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VŨ THANH BÌNH
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA TẾ BÀO TUA
TRONG VIỆC ĐỊNH HƯỚNG TẾ BÀO TIÊU DIỆT
CẢM ỨNG BỞI CYTOKINE TIÊU DIỆT
TRÚNG ĐÍCH UNG THƯ
Ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số ngành: 62420104
Khóa học năm: 2015
Xác nhận của Cán bộ hướng dẫn:
TS Phạm Văn Phúc
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VŨ THANH BÌNH
ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA TẾ BÀO TUA TRONG VIỆC ĐỊNH HƯỚNG TẾ BÀO TIÊU DIỆT CẢM ỨNG BỞI CYTOKINE TIÊU DIỆT TRÚNG
ĐÍCH UNG THƯ
Ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số ngành: 62420104
Khóa học năm: 2015
Người hướng dẫn khoa học: TS BS Lê Tấn Đạt
TS Phạm Văn Phúc
Tp HCM, năm 2016
Trang 3Phần 1: Tiểu luận tổng quan
1 Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong trên toàn thế giới (Jemal et al., 2008) Nhiều bệnh nhân bị ung thư không thể chữa trị bằng các liệu pháp truyền thống Phẫu thuật, xạ trị và hóa trị có nhiều tác dụng phụ và thường không loại bỏ hoàn toàn tế bào ung thư nên bệnh có khả năng tái phát sau vài năm (Bretthauer, 2010; Ishikura, 2012; Videtic, 2012) Các nghiên cứu cho thấy nhiều loại bướu đặc chứa một quần thể tế bào có các đặc điểm tương tự tế bào gốc, chúng có vai trò khởi phát cũng như duy trì khối u và chính là nguyên nhân dẫn đến sự di căn và gây tử vong cho bệnh nhân ung thư, quần thể tế bào này là tế bào gốc ung thư (TBGUT) (Al-Hajj, Wicha, Benito-Hernandez, Morrison, & Clarke, 2003; Clarke, 2005)
Khoa học kĩ thuật ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống của mọi người ngày càng nâng cao, đặt ra yêu cầu cao hơn trong hoạt động nghiên cứu điều trị bệnh Liệu pháp miễn dịch nói chung và liệu pháp miễn dịch tế bào nói riêng nhắm đến việc kích hoạt hệ miễn dịch của người bệnh, thúc đẩy đáp ứng miễn dịch với ung thư, cho phép khả năng tự nhiên của cơ thể nhận diện tốt hơn và cuối cùng tiêu diệt các tế bào ung thư Liệu pháp miễn dịch là một chiến lược đầy hứa hẹn trong việc điều trị nhiều loại ung thư với mục đích thiết lập sự kiểm soát ung thư về lâu dài Việc kết hợp các liệu pháp truyền thống như phẫu thuật, hóa trị và xạ trị với liệu pháp miễn dịch là một hướng đi mới trong điều trị ung thư để giảm số bệnh nhân tử vong vì ung thư Do các đáp ứng miễn dịch rất đặc hiệu nên có thể sử dụng trong điều trị ung thư để loại bỏ khối u mà không tác động lên các tế bào bình thường Liệu pháp miễn dịch nhắm đến việc tăng cường đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với khối u (miễn dịch chủ động) hay cung cấp các kháng thể hoặc các
tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên khối u (miễn dịch thích ứng-adoptive immnunotherapy) (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2012; Dougan & Dranoff, 2012; Rescigno, Avogadri, & Curigliano, 2007; Smith, Oertle, & Prato, 2014; Vanneman & Dranoff, 2012)
Trang 4Tế bào tua (dendritic cell – DC) là tế bào miễn dịch có chức năng trình diện kháng nguyên Chúng có khả năng hoạt hóa tế bào T trợ giúp CD4 trinh nguyên và tế bào T gây độc CD8 (cytotoxic T lymphocyte – CTL) chưa được cảm ứng Đây được xem là một hướng tiếp cận liệu pháp miễn dịch chủ động, nghĩa là liệu pháp dựa vào tế bào DC được
sử dụng nhằm tạo các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt của khối u và tạo ra đáp ứng tế bào T gây độc tiêu diệt tế bào ung thư (Barth et al., 2010; Gilboa, 2007; Kalinski & Okada, 2010; Lesterhuis et al., 2011; Steinman, 2012) Trên thế giới, nghiên cứu điều trị ung thư vú bằng tế bào tua đã tiến đến bước thử nghiệm lâm sàng; tuy nhiên, hiệu quả đẩy lùi căn bệnh ung thư còn thấp vì những lý do sau: (i) DC cần nguồn kháng nguyên ung thư chuyên biệt và quan trọng trong việc cảm ứng tế bào hiệu quả tiêu diệt khối u, trong khi khía cạnh này dù rất nỗ lực nhưng các nhà khoa học chỉ mới xác định được một số ít kháng nguyên ung thư; (ii) DC là tế bào trình diện kháng nguyên nên chúng chỉ có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch kháng u mà không có chức năng thực hiện trực tiếp công việc này, nên với hệ miễn dịch bị ức chế trong cơ thể bệnh nhân ung thư gây ra bởi chính các cơ chế bảo vệ của tế bào ung thư và/hay từ chính các phương pháp điều trị như hóa trị, xạ trị làm các tế bào miễn dịch trở nên dung nạp, đây là nguyên nhân dẫn đến hiệu quả của liệu pháp DC vẫn còn thấp Vì vậy việc kết hợp liệu pháp sử dụng DC và các tế bào miễn dịch kháng u khác ngày càng có ý nghĩa không chỉ
về mặt nghiên cứu mà còn trên mặt thực tiễn lâm sàng
Liệu pháp miễn dịch thích ứng là liệu pháp cá thể hóa tiêm truyền các tế bào miễn
dịch kháng u của bệnh nhân được nuôi cấy ex vivo để tiêu diệt tế bào ung thư, đây là một
hướng liệu pháp tiềm năng trong điều trị ung thư Liệu pháp miễn dịch thích ứng là một trong những phương pháp hiệu quả nhất trong sử dụng hệ thống miễn dịch của cơ thể để điều trị ung thư (Ma et al., 2012) Một loại tế bào lympho T giết tự nhiên (natural killer T lymphocyte – NKT) được gọi là tế bào tiêu diệt được cảm ứng bởi cytokine (cytokine-induced killer cell – CIK) cho thấy các kết quả đáng khích lệ trong các nghiên cứu lâm sàng tự thân và ghép dị cá thể Tế bào CIK có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư, chúng là loại tế bào có thể nuôi cấy và biệt hóa dễ dàng hơn so với các loại tế bào miễn dịch khác Bên cạnh đó, thời gian và hiệu quả cũng như lượng tế bào thu được cũng cao hơn so với
Trang 5tế bào tiêu diệt được hoạt hóa bởi lymphokine (lymphokine-activated killer) Vì thế, CIK trở thành một ứng viên đầy tiềm năng trong việc điều trị bệnh ung thư Tuy nhiên cho đến nay, tại Việt Nam vẫn chưa có phương pháp hay quy trình nào liên quan đến CIK được công bố Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra được phương pháp áp dụng hiệu quả liệu pháp tế bào CIK trong điều trị ung thư vú trên mô hình chuột
Đề tài này đặt ra một giả thuyết rằng liệu việc kết hợp đồng nuôi cấy DC và CIK
có phải là một hướng tiếp cận hiệu quả trong điều trị ung thư hay không? Hướng kết hợp này có các lợi điểm như điều trị trúng đích ung thư và ít gây tác dụng phụ hay không? Cơ
sở của giả thuyết trên là việc kết hợp một loại tế bào miễn dịch có chức năng trình diện kháng nguyên chuyên biệt và một loại tế bào miễn dịch có chức năng tiêu diệt tế bào ung thư mang các đặc tính tăng sinh mạnh và khả năng gây độc tế bào mạnh có thể kết hợp các lợi điểm từ từng loại tế bào, đồng thời khắc phục được những hạn chế của chính chúng khi được đồng nuôi cấy với nhau
Kết quả của nghiên cứu này là minh chứng rõ nét nhất cho thấy hiệu quả của liệu pháp miễn dịch kết hợp trong điều trị ung thư trên mô hình cận lâm sàng, làm cơ sở thúc đẩy nhiều nghiên cứu liên quan nhằm mục tiêu ứng dụng vào thực tế điều trị cho bệnh nhân với hiệu quả đáp ứng cao
Phần 2: Đề cương luận án
2 Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu xuyên suốt của đề tài là nhằm giải quyết được câu hỏi liệu việc kết hợp với DC có định hướng cho tế bào CIK tiêu diệt trúng đích ung thư, hiệu quả và ít tác dụng phụ hay không? Đề tài hướng đến giải quyết các mục tiêu sau:
2.1 Khảo sát hiệu quả tiêu diệt trúng đích tế bào ung thư in vitro bằng các liệu
pháp DC, CIK và kết hợp DC/CIK
2.2 Xác định cơ chế tác động và vai trò của DC trong việc định hướng tế bào
CIK tiêu diệt tế bào ung thư vú in vitro
2.3 Nghiên cứu được hiệu quả điều trị của liệu pháp DC-CIK đồng loại trên mô
hình chuột mang khối u vú
Trang 63 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1 Đối tượng
Dòng tế bào ung thư vú chuột 4T1 được sử dụng để thiết lập dòng tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc điều trị ung thư doxorubicin
Dòng tế bào thường (nguyên bào sợi chuột) được phân lập từ chuột BALB/c khỏe mạnh bằng phương pháp nuôi cấy sơ cấp biểu bì Nguyên bào sợi được tăng sinh trong môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh/nấm Tế bào được sử dụng từ lần cấy chuyền thứ 3-7, đồng thời được lưu trữ trong ni tơ lỏng đến khi có nhu cầu sử dụng
Chuột BALB/c khỏe mạnh, cân nặng 25-30 gram, 8-10 tuần tuổi được sử dụng để thu nhận các nguồn tế bào máu đơn nhân để nuôi cấy tế bào CIK và DC, và được gây mô hình mang khối u vú được thiết lập từ dòng tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc
3.2 Phương pháp
3.2.1 Phương pháp chọn lọc tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc và tạo
chuột mô hình mang khối u vú được hình thành từ tế bào 4T1 kháng thuốc
- Dòng tế bào ung thư vú chuột 4T1 được mua từ ngân hàng dòng tế bào ATCC (Manassas, VA, Hoa Kỳ), và nuôi trong môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) và 1x kháng sinh/nấm (Gibco) Tế bào được nuôi ở 37°C, 5% CO2 Thay môi trường mới mỗi 2 ngày
- Chuẩn bị hóa chất kháng u: hòa tan 1 mg doxorubicin (Sigma-Aldrich) trong 1
ml ethanol vô trùng
- Thu nhận tế bào 4T1: tế bào được tách bởi 0,25% trypsin/EDTA Sau đó rửa 2 lần với PBS để loại trypsin thừa
- Chọn lọc tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc: tế bào 4T1 được nuôi ở các lô thí nghiệm khác nhau về nồng độ doxorubicin (tương ứng 1 µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,25 µg/mL; 0,1 µg/mL và 0,05 µg/mL) Ủ tế bào trong 24 giờ, đo đường cong tăng trưởng, thời gian nhân đôi tế bào thông qua chỉ số tế bào (cell index-CI)
Trang 7Chọn lọc các tế bào từ lô thí nghiệm có sự kháng doxorubicin cao nhất, tiến hành nuôi cấy ổn định các tế bào này trong môi trường có bổ sung nồng độ thuốc tương ứng (đến lần cấy chuyền thứ 3) và sử dụng chúng làm nguồn tế bào cho các thí nghiệm tiếp theo
- Tạo được dòng tế bào ung thư vú kháng thuốc mang gen chỉ thị huỳnh quang
gfp, bằng cách sử dụng lentivirus Đánh giá và chọn lọc dòng tế bào mang gen
chỉ thị mà vẫn không thay đổi tính kháng thuốc
- Chuột cái BALB/c 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, cân nặng 25–30 gram được mua
từ Charles Rivers (Sulzfeld, Đức) Chuột được nuôi trong điều kiện sạch khuẩn, tiến hành thí nghiệm dựa trên Quy tắc thí nghiệm trên động vật (PTN
Tế bào gốc)
- Tạo chuột mô hình mang khối u vú 4T1 kháng thuốc:
+ Tế bào được huyền phù trong dung dịch PBS mật độ 1x106 tế bào/ml
+ Thao tác trong phòng vô trùng, xác định vùng vú của chuột, tiến hành cạo sạch lông, sát khuẩn Chuẩn bị kim tiêm vô trùng, tiêm dưới da 0,1 ml huyền phù tế bào 4T1 kháng thuốc trong PBS vào vùng mỡ vú chuột
+ Theo dõi và ghi nhận kích thước khối u trong 7 ngày ghép tế bào ung thư
3.2.2 Phương pháp thu nhận và biệt hóa tế bào CIK từ gan và lách
chuột và tế bào DC từ tủy xương chuột
- Chuột BALB/c 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, cân nặng 25–30 gram được mua từ Charles Rivers (Sulzfeld, Đức) Giết chuột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ, thu nhận gan, lách, và xương đùi chuột vào lọ đựng mẫu chứa PBS bổ sung 1x kháng sinh/nấm
- Thu nhận và biệt hóa DC:
+ Thao tác trong tủ an toàn sinh học thu nhận tủy xương chuột bằng cách cắt
bỏ hai đầu xương đùi, dùng kim tiêm bơm môi trường RPMI 1640 bổ sung 1x kháng sinh/nấm dội rửa tế bào từ tủy xương Tế bào thu nhận được nuôi trong môi trường có bổ sung 10% FBS ở 37°C, 5% CO2
Trang 8+ Chọn lọc tế bào tủy xương bám dính vào bề mặt nuôi trong 1 giờ Các tế bào bám được cảm ứng tạo DC bằng môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS 1x kháng sinh/nấm và GM-CSF (1000U/ml), IL-4 (500U/ml) Môi trường được thay mới sau 3 ngày Đến D7, bổ sung thêm vào môi trường nuôi dịch ly giải tế bào 4T1 kháng thuốc DC được nuôi thêm hai ngày, sau đó được thu nhận
- Thu nhận và nuôi cấy tế bào CIK:
Tế bào đơn nhân từ gan và lách được thu nhận, bổ sung môi trường RPMI
1640 10% FBS 1x kháng sinh/nấm và IFN-γ (1000 U/ml) ở D0 Sau 24 giờ nuôi, môi trường được bổ sung thêm IL-2 (500 U/ml) và anti-CD3 mAb (50 ng/ml) Môi trường được thay mới sau 3 ngày với chỉ IL-2 được bổ sung CIK được nuôi cấy đến D14 được thu nhận
- Đồng nuôi cấy tế bào DC và CIK:
Tế bào CIK và DC được thu nhận và nuôi cấy theo quy trình trên Sau khi DC được cảm ứng với dịch ly giải tế bào 4T1 kháng thuốc (D9), DC được thu nhận
và đồng nuôi cấy với CIK thêm 5 ngày nữa
Khảo sát tác động của DC lên đặc điểm tế bào CIK với 2 hình thức nuôi cấy: + Đồng nuôi cấy tiếp xúc
+ Đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert)
3.2.3 Phương pháp xét nghiệm apoptosis/necrosis
Nguyên tắc: Annexin V và propidium iodide (PI) là hai thuốc nhuộm giúp phân biệt giữa tế bào bị hoại tử (necrosis) hay chết theo lập trình (apoptosis) Phân tích sự gắn annexin V dựa vào sự chuyển vị của phosphatidylserine từ màng trong ra màng ngoài do sự bất ổn định của màng trong quá trình apoptosis Khi gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang như FITC có thể phát hiện tế bào bị apoptosis trong giai đoạn sớm PI là thuốc nhuộm nhân khi màng tế bào mất đi tính nguyên vẹn, nên khi tế bào bị apoptosis muộn/necrosis thì PI đi vào nhân
+ Tế bào sống: Annexin V- và PI
-+ Tế bào trong giai đoạn apoptosis sớm: Annexin V+ và PI
Trang 9-+ Tế bào trong giai đoạn apoptosis muộn và necrosis: Annexin V+ và PI+
3.2.4 Các phương pháp đánh giá đặc điểm tế bào miễn dịch
- Phương pháp flow cytometry:
+ DC được đánh giá khả năng trưởng thành bằng các kháng thể đơn dòng kháng CD14/CD40/CD80/CD83/CD86/HLA-DR
+ CIK được đánh giá khả năng hoạt tính bằng các kháng thể đơn dòng kháng CD3/CD56/NKG2D và perforin/granzyme B
+ Tế bào Treg được kiểm tra trong quần thể tế bào nuôi cấy CIK và quần thể tế bào đồng nuôi cấy CIK/DC bằng các kháng thể đơn dòng kháng CD4 và CD25
- Phương pháp ELISA:
+ Dịch nuôi ở các lô tế bào DC, CIK và đồng nuôi cấy CIK/DC được kiểm tra
sự hiện diện của các loại cytokine IL-12 và IFN-γ do chính các tế bào này tiết
ra
+ Ngoài ra, ở lô tế bào CIK và đồng nuôi cấy CIK/DC cũng được kiểm tra sự hiện diện của các loại cytokine IL-10 và TGF-β do tế bào Treg tiết ra
3.2.5 Phương pháp đánh giá tính gây độc tế bào ung thư in vitro sử
dụng liệu pháp DC, CIK và liệu pháp kết hợp
- Tế bào ung thư 4T1 đã chọn lọc kháng thuốc được nuôi trong đĩa 96 giếng Sau khi ủ 24 giờ, tế bào được xử lý với những nồng độ khác nhau của tế bào hiệu quả (DC, CIK hoặc DC/CIK) trong 48 giờ Tỷ lệ tế bào ung thư:tế bào miễn dịch được khảo sát lần lượt 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 Môi trường được thay mới mỗi 2 ngày
- Khảo sát tác động gây độc tế bào ung thư của tế bào miễn dịch bằng 2 hình thức theo dõi:
+ Đồng nuôi cấy tiếp xúc
+ Đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert)
Trang 10- Khảo sát tác động tiêu diệt trúng đích của tế bào miễn dịch: các lô thí nghiệm tương tự đối với tế bào ung thư, nhưng tế bào đích được thay thế bằng nguyên bào sợi chuột
- Phương pháp đo thực thời dựa vào điện trở:
Phương pháp này sử dụng hệ thống xCelligence được phát triển bởi Roche và ACE Biosciences để ghi nhận sự tăng sinh tế bào thực thời Các tế bào được cấy lên một đĩa 96 giếng đặc biệt (E-plate) với các vi điện cực bằng vàng được bao phủ dưới lớp đáy Về nguyên tắc: càng nhiều tế bào bám dính vào đáy giếng, thì trở kháng của điện cực s càng tăng phản ánh thông qua chỉ số tế bào (cell index-CI), theo các quy tắc sau:
+ Khi không có tế bào, hoặc tế bào không bám dính vào điện cực ở đáy, chỉ số
CI bằng 0
+ Trong cùng điều kiện sinh lý, càng nhiều tế bào bám, chỉ số CI càng lớn + Hơn nữa, sự thay đổi trạng thái tế bào như hình thái, sự bám trải, sức sống s dẫn đến sự thay đổi CI
Điểm ưu việt của hệ thống này chính là khả năng ghi nhận số liệu thực thời chính xác đến từng phút, cho phép theo dõi sự tăng sinh tế bào, sự ảnh hưởng của các tác nhân lên tế bào mà không cần phải can thiệp trực tiếp vào tế bào như các phương pháp khác như MTT, BrdU
Phương pháp này cho phép xác định liệu pháp miễn dịch hiệu quả trong việc tiêu diệt tế bào ung thư 4T1 với tỷ lệ tế bào đích:tế bào miễn dịch tương ứng
3.2.6 Phương pháp đánh giá hiệu quả liệu pháp DC, CIK và liệu pháp
kết hợp trong điều trị mô hình chuột ung thư vú
Mô hình chuột mang khối u vú 4T1 đã chọn lọc kháng thuốc được sử dụng để
đánh giá hiệu quả điều trị in vivo sử dụng liệu pháp DC, CIK và liệu pháp kết hợp
DC/CIK
- Tế bào ung thư 4T1 đã chọn lọc kháng thuốc được chuyển gen chỉ thị (gfp)
được huyền phù trong 0,1 ml dung dịch PBS (1x106
tế bào/ml) Tiêm vô trùng, dưới da huyền phù tế bào vào vùng mỡ vú chuột