Caenorhabditis elegans động vật mô hình nghiên cứu Sinh học phân tử Lê Thọ Sơn1* Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, Thành phố Hà Nội, Việt Nam Biên tập viên: Vương Văn Thu, University of Toronto *Mọi thắc mắc xin liên hệ: sonacademiasinica@gmail.com Từ khóa: Caenorhabditis elegans; Chức gen; GFP; RNAi; Chuyển gen Abstract To explore the biological principles, biologists have been using different model organisms such as E coli, yeast, Drosophila, mice, human cells, Arabidopsis, maize and so on Since none of them is perfect and appropriate for various types of research, biologists have to select suitable models for their specific reseearch focuses This paper introduces Caenorhabditis elegans (C elegans), a tiny round-worm species, as an organismal model, and its fundamentally biological characters Since the first genetics studies by Sydney Brenner in 1963, C elegans has become commonly used for research on functional genetics, cell and developmental biology, evolution and bio-medication This paper reports four biological breakthroughs from C elegans, including apoptosis, green fluorescence protein, RNA interference and aging Additionally, we also present our research on Caenorhabditis biodiversity and the effects of females on males' behaviors using C elegan Tóm tắt Để hiểu nhiều quy luật sống sinh vật, người sử dụng nhiều mô hình khác E coli, nấm men, ruồi dấm, chuột, tế bào người, Arabidopsis, ngô, v.v Vì mô hình lý tưởng phù hợp với dạng nghiên cứu khác nên nhà sinh vật học cần chọn mô hình phù hợp với mục tiêu nghiên cứu chuyên biệt Bài báo giới thiệu Caenorhabditis elegans - loài giun tròn nhỏ, đặc điểm Kể từ nghiên cứu di truyền học Sydney Brenner năm 1963, giun C elegans sử dụng nhiều nghiên cứu di truyền chức năng, tế bào, sinh học phát triển, tiến hóa sinh học y sinh Bài báo trích dẫn bốn khám phá sinh học bắt nguồn từ C elegansbao gồm: chế tự huỷ diệt tế bào (apoptosis), kìm hãm biểu gen cách phân hủy RNA (RNAi), protein phát huỳnh quang (GFP) lão hóa Những nghiên cứu nhóm chúng tôi, ứng dụng C elegans nghiên cứu đa dạng sinh học loài thuộc chiCaenorhabditis ảnh hưởng giới lên hành vi giới đực, trình bày Lịch sử Caenorhabditis elegans loài giun tròn sống tự môi trường đất với kích thước trưởng thành khoảng mm Năm 1963, Sydney Brenner bắt đầu ý tưởng nghiên cứu tính chất di truyền phát triển tế bào thần kinh C elegans Năm 1974, Brenner nghiên cứu sinh học phân tử sinh học phát triển C elegans kể từ C elegans sử dụng rộng rãi nghiên cứu sinh học (1) Sự phát triển tập tính giun Caenorhabditis elegans Cơ thể giun C elegans dài khoảng mm độ tuổi trưởng thành Phần thể cấu tạo dạng “hai ống” lồng vào nhau: ống ruột, lớp biểu bì cu-tin hệ thống Cơ thể chia thành ba phần: đầu, thân đuôi Trong quần thể có lưỡng tính đực Thông thường lưỡng tính chiếm áp đảo đực chiếm khoảng 0.2% Con lưỡng tính cấu tạo 959 tế bào (2) đực 1003 (3) Cơ thể gồm có hệ thống tế bào soma, tế bào sinh sản tế bào thần kinh Dưới kính hiển vi nhìn xuyên thấu vào quan bên thể giun (Hình 1) Hình 1: Cấu trúc thể giun lưỡng tính giun đực C elegans.1-phần đầu;2-cơ quan sinh dục; 3ruột; 4-đuôi; 5-hợp tử phôi; 6-âm hộ; 7-cơ quan tạo lưu trữ tinh trùng; 8-trứng; 9-gai giao hợp 1-phần đầu; 2-cơ quan sinh dục; 3-ruột; 4-đuôi; 5-hợp tử phôi; 6-âm hộ; 7-cơ quan tạo lưu trữ tinh trùng; 8-trứng; 9-gai giao hợp Giun C elegans sống khoảng 20 ngày Giun phát triển qua bốn giai đoạn ấu trùng (ấu trùng L1, L2, L3, L4), trưởng thành, sinh sản, lão hóa, chết Giun chuyển sang trạng thái sống tiềm sinh vài tháng giai đoạn L2 thiếu thức ăn, mật độ cá thể đông nhiệt độ thấp (Hình 2) Hình 2: Vòng đời phát triển giun C elegans nhiệt nhiệt độ 20 oC C elegans có chu kỳ phát triển ba ngày, thông thường bắt đầu sinh sản từ ngày thứ ngày thứ kể từ sinh Vì có lưỡng tính nên sinh sản tự phối sản xuất khoảng 300 cá thể Vì có đực nên sinh sản giao phối đực lưỡng tính sản xuất vài trăm khoảng 1000 lai Hệ gen gen Kích thước hệ gen 100.272.276 Mb phân bố thành năm cặp nhiễm sắc thể: bốn cặp nhiễm sắc thể thường nhiễm sắc thể giới tính X Tất nhiễm sắc thể có cấu trúc holocentric (các nhiễm sắc thể không phân định rõ tâm động), lưỡng tính có cặp nhiễm sắcc thể giới tính XX đực XO Hệ gen C elegans có đặc trưng chung sinh vật cấu tạo tế bào nhân chuẩn bao gồm khoảng 19.000 gen (3), trình tự nucleotit lặp, yếu tố nhảy (gen nhảy) v.v Khoảng 60-80% gen giun giống với gen người (4) Toàn hệ gen giải trình tự dòng giun đồng hợp tử C elegans N2 Cùng với ưu tiện lợi khác, C elegans sử dụng rộng rãi nhiều nghiên cứu sinh học liên quan tới locus Tiện ích thí nghiệm nghiên cứu gen Hiện cộng đồng nhà khoa học sử dụng giun C elegans đông giới, thông tin liên quan tới nghiên cứu thường có nhiều tham khảo Mọi thông tin thường xuyên cập nhật địa www.WormBase.org Các thư viện RNAi (RNA interference) thư viện biểu ORF (open reading frame expression library - tập hợp dòng vi khuẩn mang cDNA tái tổ hợp) tạo cho hầu hết gen Sự phát triển biệt hoá quan tế bào mô tả chi tiết Kỹ thuật RNAi vi tiêm gen không phức tạp ứng dụng rộng rãi giới Hai kỹ thuật vô cần thiết nghiên cứu chức trực tiếp gen Khi biết trình tự nucleotit vị trí gen, đột biến gen có chủ đích thực cách sử dụng ethyl methanesulfonate (EMS), tia UV transposon (5) Mới phương pháp đột biến gen CRISPR/Cas9 ứng dụng quy trình hóa để gây đột biến gen quan tâm C elegans Phương pháp tóm tắt sau: phức hợp vector mã hóa CRISPR/Cas9 cho gen quan tâm tạo vi tiêm vào giun mẹ lưỡng tính; hệ vector kích hoạt enzyme phiên mã giải mã gây đột biến gen chủ đích tế bào sinh dục giun mẹ; tế bào sinh dục mang gen đột biến phát triển thành giao tử (trứng tinh trùng) thụ tinh cho tạo hợp tử mang gen đột biến thêm nucleotit (6, 7) Vì vòng đời ngắn, lai chéo dòng giun không khó lai có số lượng đông, C elegans sử dụng để xác định tương tác di truyền hai gen cách lai hai đột biến hai gen quan tâm quy định tính trạng Những phát tiêu biểu từ Caenorhabditis elegans Tương tự nhiều sinh vật mô hình khác nấm men, Arabidopsis, ruồi dấm, chuột tế bào người, giun C elegans sử dụng nhiều nghiên cứu sinh học phân tử góp phần tìm nhiều tính chất sống Năm 2002, giải Nobel Y hoc trao cho tác giả phát chế tự hủy diệt tế bào (apoptosis) C elegans (8) Apoptosis tượng "chết chủ động chương trình di truyền điều khiển" tế bào Tế bào thực apoptosis thể đặc điểm DNA nhân bị phân hủy, màng ty thể điện màng tế bào tách khỏi tế bào chất Trong trình phát triển phôi thai giun C elegans lưỡng tính 1090 tế bào sinh 131 tế bào tự hủy diệt Người ta tìm khoảng 20 gen liên quan điều hòa trình tự hủy diệt, số đó, bốn gen vô cần thiết ced-3 (CEll Death abnormality), ced-4, ced-9 egl-1 (EGg Laying defective) Các gen taọ protein tương ứng hoạt động tế bào xác định tự hủy diệt CED-3, CED-4 EGL-1 protein kích hoạt apoptosis CED-9 protein chống lại apoptosis 131 tế bào Protein phát huỳnh quang xanh (green fluorescent protein - GFP) sử dụng làm dấu hiệu biểu gen vị trí protein tế bào (được trao giải Nobel Hóa học năm 2008) (9, 10) (Hình 3) Gen GFP phân lập từ loài sứa biển (Aequorea victoria) Protein GFP có 238 amino acid, hấp thụ sóng UV tối ưu bước sóng 450 nm tới 490 nm phát huỳnh quang xanh Tính chất ứng dụng để theo dõi biểu gen (tạm gọi A) protein mã hóa gen (protein A) tế bào sống giun Gen A thao tác gen để gắn gen GFP tạo vector tái tổ hợp A::GFP GFP::A Khi vi tiêm vào giun, vector biểu protein tái tổ hợp phát huỳnh quang xanh Gen áp dụng nghiên cứu biểu mec-7 mã hóa protein βtubulin Hình 3: GFP biểu tế bào 1-tế bào uste; 2-tế bào ruột Nghiên cứu hạn chế biểu gen mức độ RNA (RNA interference, gọi tắt RNAi) trao giải Nobel Sinh-Y học năm 2006 nghiên cứu sử dụng C elegans (11, 12) Kỹ thuật RNAi sử dụng siRNA, phân tử RNA trạng thái mạch kép bổ trợ, có độ dài khoảng 20 nucleotit, tạo từ dsRNA (double strand RNA) phức hợp protein Dicer siRNA với số protein khác PIWI tạo phức hợp RISC (RNA Inducing Silencing Complex) Phức hợp RISC bám vào pre-mRNA và/hoặc mRNA gen mục tiêu vị trí mà phân tử siRNA mạch đơn bám vào theo nguyên tắc bổ trợ Phức hợp RISC cắt phân tử mRNA mục tiêu, kết tế bào thiếu mRNA để tổng hợp đủ lượng phân tử protein mục tiêu (13) Những gen C elegans thành công với tượng RNAi unc-22(UNCoordinatee), fem-1 (FEMinization of XX XO animals), unc-54, hlh-1 (Helix Loop Helix) gen ngoại lai GFP có nguồn gốc từ sứa vi tiêm vào C elegans (11) Gen tham gia vào trình lão hóa phát C elegans Trong nghiên cứu di truyền tuổi thọ, Kenyon sử dụng kỹ thuật RNAi để ức chế biểu gen gen daf-2(abnormal DAuer Formation), dẫn đến kéo dài tuổi thọ giun Thêm vào đó, đột biến nucleotit dẫn đến chức gen daf-2 kéo dài tuổi thọ giun, cho phép giun sống lâu gấp ba lần so với bình thường (14) Các thí nghiệm chứng tỏ gen daf-2 hạn chế tuổi thọ giun Ngược lại đột biến chức gen daf-16 gây rút ngắn tuổi thọ, chứng tỏ daf-16 có chức trì tuổi thọ giun (2) Cả hai gen có gen đồng dạng người liên quan đến đường đồng hóa đường liên quan đến insulin Phát mở ý tưởng người kéo dài tuổi thọ nhờ thay đổi di truyền Ngoài vai trò mấu chốt phát mang tính đột phá kể trên, loài giun thuộc giống Caenorhabditis sử dụng nghiên cứu tiến hóa sinh vật (như nghiên cứu hệ gen) (15, 16); Sinh-Y (như nghiên cứu bệnh Alzaimer đái tháo đường (4, 17) Có khả sử dụng C elegans Việt Nam? Tôi cho C elegans động vật mô hình nghiên cứu dùng nghiên cứu sinh học mức độ quần thể, nhóm cá thể, cá thể, quan, tế bào phân tử Việt Nam C elegans trở thành sinh vật mô hình thực hành cho nhiều chủ đề sinh học, ví dụ thực hành quy luật di truyền Mendel Ngoài trang thiết bị phổ biến cho thí nghiệm liên quan đến sinh học phân tử, thiết bị cần thiết cho nghiên cứu C.elegans thiết bị với "giá thấp" tủ nuôi cấy ổn định nhiệt độ (16, 20 25 oC), kính hiển vi hệ vi tiêm Vì xét nhiều góc độ, C elegans hoàn toàn số lựa chọn thiết thực để góp phần phát triển nghiên cứu đào tạo khoa học sống Việt Nam Hiện sử dụng số loài giun tròn thuộc chi Caenorhabditis bao gồm cảC elegans hai nghiên cứu độc lập Nghiên cứu thứ tiến hóa sinh vật, bao gồm: phân lập giun Caenorhabditis từ nhiều vùng sinh thái thuộc lãnh thổ Việt Nam xác định đa dạng di truyềnthích nghi sinh thái loài giun Kết nghiên cứu giúp mô lịch sử tiến hóa/chọn lọc giun tròn Caenorhabditis vùng sinh thái Việt nam Nghiên cứu thứ hai tác động giới lên hành vi giới đực nhằm góp phần quản lý tác động chênh lệch giới thụ động xã hội loài người có Việt Nam Hình 4: Nhóm sinh viên làm thí nghiệm C elegans Kết luận Con người sử dụng tuyến trùng giun tròn Caenorhabditis elegans làm sinh vật mô hình nghiên cứu sinh học tìm nhiều quy luật sinh học phục vụ cho hiểu biết ứng dụng đời sống Giun mô hình có ưu thuận lợi cho nghiên cứu nhiều quy luật sinh học mức độ phân tử, đào tạo khoa học sống điều kiện hạn chế kinh phí sở vật chất Việt Nam Tác giả : T.S Lê Thọ Sơn đào tạo thạc sỹ Học viện Gwangju Institute of Science and Technology tiến sỹ Đại học Hanyang, Hàn Quốc năm sau tiến sĩ Học viện Academia Sinica, Đài Loan Tác giả nghiên cứu enzym dehydrogenase tiến hóa kích thước hệ gen sinh vật mô hình C elegans Tài liệu tham khảo: Brenner S (1974) The genetics of Caenorhabditis elegans Genetics 77(1):71-94 Sulston JE (1976) Post-embryonic development in the ventral cord of Caenorhabditis elegans Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 275:287-297 Kemphues K (2005) Essential Genes Wormbook Kaletta T & Hengartner MO (2006) Finding function in novel targets: C elegans as a model organism Nature reviews Drug discovery 5(5):387-398 Kutscher LM & Shaham S (2014) Forward and reverse mutagenesis in C elegans Wormbook Dickinson DJ, Ward JD, Reiner DJ, & Goldstein B (2013) Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination Nature methods 10(10):1028-1034 Friedland AE, et al (2013) Heritable genome editing in C elegans via a CRISPR-Cas9 system Nature methods 10(8):741-743 Lettre G & Hengartner MO (2006) Developmental apoptosis in C elegans: a complex CEDnario Nature reviews Molecular cell biology 7(2):97-108 Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, & Prasher DC (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression Science 263(5148):802-805 10 Huang M & Chalfie M (1994) Gene interactions affecting mechanosensory transduction in Caenorhabditis elegans Nature 367(6462):467-470 11 Fire A, et al (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391(6669):806-811 12 Xu S-Q & Fire A (1996) Fire Lab Vector Kit 13 Grishok A (2005) RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans FEBS letters 579(26):5932-5939 14 Kenyon C, Chang J, Gensch E, Rudner A, & Tabtiang R (1993) A C elegans mutant that lives twice as long as wild type Nature 366(6454):461-464 15 Hodgkin J (2005) Introduction to genetics and genomics Wormbook 16 Wang J, Chen P-J, Wang GJ, & Keller L (2010) Chromosome size differences may affect meiosis and genome size Science 329(293):5989 17 Conradt B & Xue D (2005) Program cell death Wormbook