các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử.ppt

nội dung của bài gồm có: Khái niệm chung về sinh học phân tử, Phương pháp tách chiết acide nucleic, Phương pháp tách chiết ARN, Phương pháp điện di, Phương pháp ly tâm, Phương pháp sắc ký, Phương pháp lai phân tử, Mẫu dò và các phương pháp đánh dấu, Kỹ thuật Western blot, Phương pháp PCR.

Trường ĐH Nông Lâm Huế

Khoa Sinh học

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC

PHÂN TỬ

Lớp: Nuôi Trồng Thủy Sản 46 Sinh viên thực hiện:

Nội dung:

Khái niệm chung về sinh học phân tử

Phương pháp tách chiết acide nucleic Phương pháp tách chiết ARN

Phương pháp điện di

Phương pháp ly tâm

Mẫu dò và các phương pháp đánh dấu

Phương pháp lai phân tử Phương pháp sắc ký

Kỹ thuật Western blot Phương pháp PCR

1 Khái niệm chung về sinh học phân tử

1 Định nghĩa:

Ta gặp các nội dung của sinh học phân tử trong nhiều môn

khoa học thuộc lĩnh vực khoa học sự sống đặc biệt là di truyền học và sinh hóa học

Ta gặp các nội dung của sinh học phân tử trong nhiều môn

khoa học thuộc lĩnh vực khoa học sự sống đặc biệt là di truyền học và sinh hóa học

Sinh học phân tử

(molecular

biology) là môn

khoa học nghiên

cứu giới sinh vật

hay các hiện tượng

sinh vật ở mức độ

phân tử

tìm hiểu liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA, RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối tương tác này

tìm hiểu liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA, RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối tương tác này

1 Phương pháp tách chiết acide nucleic

Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân

Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy

cùng với enzyme protease Kết quả là giải phóng

ADN ở trạng thái tự do vào môi trường

Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân

Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy

cùng với enzyme protease Kết quả là giải phóng

ADN ở trạng thái tự do vào môi trường

Bước 3: kết tủa acide nucleic

Trong môi trường có nồng độ muối và ethanol cao ở nhiệt

độ thấp thì acide nucleic bị kết tủa Dùng máy ly tâm để

thu nhận acide nucleic và làm tinh sạch chúng

Bước 2: Loại bỏ tạp chất

Mẫu được lắc mạnh trong hỗn hợp phenol và

chioroform Sau đó dùng máy ly tâm tách protein

ra khỏi hỗn hợp.

Quy vtrinhf tách chiết ADN

MẪU Mẫu mất hoạt tính enzyme Quy trình tách chiết ADN

Bã ( bỏ đi) Dịch

Tủa ( acide nucleic tổng số

Quy trình tách chiết ARN

Mẫu

Cố định mẫu bằng N 2 lỏng

Mẫu mất hoạt tính ezyme

Nghiền với hỗn hợp chất tẩy Lọc

mARN hấp thụ trên cột rARN + Tarn không được hấp thụ

Phản hấp thụ alcol96oC , ở 20oC, trong 2 giờ

PHƯƠNG PHÁP ĐiỆN DI 3

Mục đích: Phân tích định tính và và thu nhận mẫu acid

nucleic

Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của acide nucleic nói chung

và nucleotit nói riêng Chúng đều mang điện tích âm và,

dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ chuyển về cực

dương, tuy nhiên khả năng di chuyển còn phụ thuộc nhiều

Điện di gel agarose

- Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân

tách những đoạn có kích thước 0,5 – 20 kb

- Điện di theo phương nằm ngang độ phân giải thay đổi khi

nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi.

- Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhận ethydium bromide Chất

này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acide

và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại.

Điện di trên gel agarose của DNA bộ gen tế bào.

Điện di trên gel polyarylamide

-Độ phân giải cao.

methylene , ethydium bromide, protein xanh coomassie,

nhuộm nitrate bạc.

trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng nhau, SDS-page ( phân tách protein).

PHƯƠNG PHÁP LY TÂM

4

- Ly tâm phân đoạn bằng CsCl là phương pháp đang được sử dụng

phổ biến hiện nay để nghiên cứu nhiều vần đề về acide nucleic

- Siêu ly tâm trên một gradient liên tục CsCl.trong quá trình ly tâm

dd CsCl đậm đặc sẽ tự động hình thành 1 gradient tỷ trọng tăng dần

từ miệng tới đáy ống Các nucleotide có tỷ trọng khác nhau sẻ tách

thành các lớp khác nhau trong ống nghiệm

- Ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp ly tâm trên gradient

saccharose để phân tách một hỗn hợp có kích thước chênh lệch

nhau lớn.

Tách các chất qua quá trình sắc ký.

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

6

6.1 Khái niệm:

- Lai phân tử là sự bắt cặp trở lại của 2 mạch đơn phân tử

AND trong điều kiện nhiệt độ giảm từ từ, kết hợp với điều kiện thí nghiệm thích hợp.Nếu trong điều kiện nhiệt độ giảm xuống đột ngột thì sự bắt cặp không diễn ra.

6.2 Đặc điểm của lai phan tử:

- Đặc hiệu tuyệt đối: là sự bắt cặp chỉ xãy ra giữa 2 mạch có trình tự hoàn toàn bổ sung nhau.

- Các trình tự bổ sung có thể là AND hoặc ARN dẫn đến sự

hình thành các phân tử AND,ARN-ARN hoặc lai

AND-ARN.

6.3 Các yếu tố ảnh hưởng:

- Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ AND và thời gian phản

ứng, nhiệt độ, độ dài phân tử, lực ion trong môi trường….

Southern blot

Southern blot

Lai trong pha rắn

Lai trong pha rắn

Lai trong pha lỏng

Lai trong pha lỏng

Northern blot

Northern blot

Sơ đồ của kỷ thuật lai southern blot :

( Phân tích AND bằng kỹ thuật southern blot)

Trạng thái của các phân tử trong các pha rắn, lỏng và khí:

MẪU DÒ VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU

7

7.1.1 Khái niệm:

Mẫu dò là một bản sao của một trình tự xác định,

được đánh dấu để giúp dễ dàng nhận biết trong kỹ thuật

phân tử.

7.1 Mẫu dò:

7.1.2 Nhưỡng đặc tính cơ bản của mẫu dò:

-Tính chuyên biệt: Mẫu dò là một bản sao nên chỉ có

thể sử dụng để lai với gel đó.

-Độ nhạy: Mẫu dò là một phân tử đánh dấu nên ohair

dễ được phát hiện và định lượng.

7.1.3 Các tác nhân đánh dấu mâu dò:

-Đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ.

-Đánh dấu bằng phương pháp hóa học.

7.2 Các phương pháp đánh dấu.

7.2.1 Phương pháp Nick - translation

Nguyên tắc: sử dụng AND ase I để cắt phân tử AND ở

những vị trí khác nhau để tạo ra những lỗ thũng phân

bố ngẫu nhiên trên cả 2 mạch Kết quả là tạo ra phân tử

AND được đánh dấu trên suốt chiều đà phân tử.

7.2.2 Phương pháp Random priming ( thiết lập mồi ngẫu

nhiên)

Mô tả phương pháp: Mẫu dò được gây biến tính bằng

nhiệt độ cao, sau đó làm lạnh đột ngột Sau đó thêm vào

phản ứng 1 hỗn hợp các oligonucleotide nhân tạo

Kết quả: mạch mới được tổng hợp cũng trở thành mạch

được đánh dấu.

7.2.3 phương pháp đánh dấu các oligonucleitide

Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch

đơn, sau đó được đánh dấu ở dầu 5’ nhờ ezyme

T4-polynucleotide kinase với sự có mặt của một nucleotide

-Cho phép phân tách các phân tử protein có

khối lượng khác nhau.

-SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên

kết với mạch peptide.

-Các phân tử protein chuyển động trong điện

trường từ cực âm sang cực dương

-Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân

tách riêng biệt các phân tử protein có khối

lượng phân tử khác nhau

Phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể:

- Có tính đặc hiệu rất cao.

- Dùng để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein

- Kháng thể được sản xuất khi đưa kháng nguyên vào

động vật thí nghiệm và được tinh sạch từ máu động vật

sau khi gây nhiễm

- Những kháng thể đa dòng có khả năng nhận biết một

số kháng nguyên

- kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương

tác với một kháng nguyên nhất định

- Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme để phát hiện

protein đặc hiệu thông qua kỹ thuật Western blot

- Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng

nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết

Kỹ thuật Western blot và ELISA dựa trên phản ứng liên kết kháng

nguyên-kháng thể:

PHƯƠNG PHÁP PCR

8

-Phương pháp PCR (polymerase chain reaction – phản

ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Millin và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là phương pháp tạo

dòng in vitro không cần sự có mặt của tế bào

-Mục đích phương pháp: Để nhân DNA nhiều lần trong ống nghiệm

-Để thực hiện được phương pháp này cần có:

- Phân tử DNA cần nhân lên.

- Hai DNA mồi (primers), mỗi mồi gồm khoảng 20 đôi base, hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tử DNA cần nhân lên: mồi ngược và mồi xuôi.

- 4 loại nucleotid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).

- Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt

độ cao, enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn

Phương pháp PCR thực hiện qua nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn (bước):

- Giai đoạn biến tính

- Giai đoạn lai ghép

- Giai đoạn tổng hợp DNA

Sau mỗi chu kỳ, giai đoạn tổng hợp cần được tăng thêm 1-2 giây vì lượng mồi, nguyên liệu giảm dần, trong khi lượng

khuôn lại tăng lên.

Ở chu kỳ cuối, giai đoạn này cần được kéo dài thêm vài phút

để hoàn tất các mạch đang được tổng hợp dở dang.

Một chu kỳ gồm 3 bước nói trên và sẽ được lặp đi lặp lại

nhiều lần Sau 30 chu kỳ lặp lại như vậy sẽ tạo được 10^6 bản sao so với số lượng ban đầu

Sơ đồ phản ứng PCR

Các chỉ riêu ảnh hưởng của PCR :

+ ADN mẫu

+ Enzyme

+ Mồi

+ Nhiệt độ

Trong đó A,T,G,C là số lượng nucleotide trong oligonucleotide

Mồi là chỉ tiêu qua trọng để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao.

công thức ước tính nhiệt độ: Tm = 4(G + C) + 2(A + T)

+ Dung dịch đệm

+ Số lượng chu kỳ

Ưu điểm: của PCR là chỉ cần thời gian ngắn vài giờ đã cho một lượng lớn DNA.

Ứng dụng PCR:

-Tách nhanh chóng, chính xác từng gen hoặc từng đoạn gen riêng biệt.

-là kỹ thuật nền cho các nghêin cứu di truyền phân

tử như xác định trình tự, lai phân tử, phát hiện đột biến v.v.

-Để xác định sự có mặt của gen trong tế bào.

-Tạo mẫu dò.

-Khôi phục gen của các sinh vật cổ.

-Nghiên cứu biểu hiện gen.

-Chẩn đoán nhờ phát hiện các gen đột biến, định lượng gen.

Sơ đồ phản ứng chuỗi AND plymerase ( PCR):

Thank you for listening

!