nội dung của bài gồm có: Khái niệm chung về sinh học phân tử, Phương pháp tách chiết acide nucleic, Phương pháp tách chiết ARN, Phương pháp điện di, Phương pháp ly tâm, Phương pháp sắc ký, Phương pháp lai phân tử, Mẫu dò và các phương pháp đánh dấu, Kỹ thuật Western blot, Phương pháp PCR.
1 Trường ĐH Nông Lâm Huế Khoa Sinh học CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ Lớp: Nuôi Trồng Thủy Sản 46 Sinh viên thực hiện: 1. Cung Đình Đạt 2. Nguyễn Lương Mãn 3. Nguyễn Quốc Đạt A 4. Hoàng Văn Đại 5. Phạm Thị Hoài 6. Đỗ Viết Bi 7. Diệp Thị Vinh 2 Nội dung: Khái niệm chung về sinh học phân tử Phương pháp tách chiết acide nucleic Phương pháp tách chiết ARN Phương pháp điện di Phương pháp ly tâm Mẫu dò và các phương pháp đánh dấu Phương pháp lai phân tử Phương pháp sắc ký Kỹ thuật Western blot Phương pháp PCR 3 1 Khái niệm chung về sinh học phân tử 1. Định nghĩa: Ta gặp các nội dung của sinh học phân tử trong nhiều môn khoa học thuộc lĩnh vực khoa học sự sống đặc biệt là di truyền học và sinh hóa học Ta gặp các nội dung của sinh học phân tử trong nhiều môn khoa học thuộc lĩnh vực khoa học sự sống đặc biệt là di truyền học và sinh hóa học Sinh học phân tử (molecular biology) là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay các hiện tượng sinh vật ở mức độ phân tử. tìm hiểu liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA, RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối tương tác này tìm hiểu liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA, RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối tương tác này 4 1 Phương pháp tách chiết acide nucleic Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy cùng với enzyme protease. Kết quả là giải phóng ADN ở trạng thái tự do vào môi trường Bước 1: Phá bỏ tế bào và màng nhân Dùng máy nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy cùng với enzyme protease. Kết quả là giải phóng ADN ở trạng thái tự do vào môi trường Bước 3: kết tủa acide nucleic Trong môi trường có nồng độ muối và ethanol cao ở nhiệt độ thấp thì acide nucleic bị kết tủa. Dùng máy ly tâm để thu nhận acide nucleic và làm tinh sạch chúng Bước 2: Loại bỏ tạp chất Mẫu được lắc mạnh trong hỗn hợp phenol và chioroform. Sau đó dùng máy ly tâm tách protein ra khỏi hỗn hợp. 5 Quy vtrinhf tách chiết ADN MẪU Mẫu mất hoạt tính enzyme Quy trình tách chiết ADN Dịch Bã ( bỏ đi) Bã ( bỏ đi) Dịch Tủa ARN Tủa ( acide nucleic tổng số Dung dịch ADN Cố định mẫu bằng N2 Nghiền với hỗn hợp phenol – tris SDS Lọc Để ở 4oC trong 24 giời Lọc Cho vào ngâm trong dd alcol 96o + acetat 1 M ở 24oC, trong 24 giời Ly tâm 3000g/10’ NaCl 0,3 M + cetavlon ở 4oC, trong 30’ Ly tâm 3000g/10’ Dịch ( bỏ đi) 6 Phương pháp tách chiết ARN 2 - Bước 1: Phá bỏ màng tế bào Nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy, gây biến tính protein và chất khử làm mất hoạt tính ARN-ase nội bào, sẽ tách các protein ra khỏi ARN. - Bước 2: Tách protein ra khỏi hỗn hợp bằng cách xử lý phenol- chlorofform và ly tâm. - Bước 3: Kết tủa ARN bằng ethanol rồi thu nhận qua ly tâm. 7 Quy trình tách chiết ARN Mẫu Cố định mẫu bằng N2 lỏng Mẫu mất hoạt tính ezyme Nghiền với hỗn hợp chất tẩy Lọc Dịch Bã ( bỏ đi) Phenol-chlorofrom Ly tâm 3000g/10’ Dịch Tủa( bỏ đi) cho vào ngâm trong dd ancol 96o + axetat Na 1 M ở 24oC, trong 24 giờ Ly tâm 3000g/10’ Tủa ARN Dịch( bỏ đi) 8 Từ ARN thu được được nói trên, tiếp tục tách thành các loại ARN khác nhau như sau: Tủa ARN NaCl 0,3% Sắc ký cột oligo-T-celluase mARN hấp thụ trên cột rARN + Tarn không được hấp thụ Phản hấp thụ alcol96oC , ở 20oC, trong 2 giờ mARN Kết tủa Ly tâm 3000g/10’ Tủa Dịch( bỏ đi) NaCl, 4oC, 2 giờ Dịch Ly tâm 3000g/10’ Dịch tARN Tủa rARN Điện di Điện di Các loại tARN Các loại rARN 9 PHƯƠNG PHÁP ĐiỆN DI 3 Mục đích: Phân tích định tính và và thu nhận mẫu acid nucleic Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của acide nucleic nói chung và nucleotit nói riêng. Chúng đều mang điện tích âm và, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ chuyển về cực dương, tuy nhiên khả năng di chuyển còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau. Công thức tính khả năng di chuyển: Log U = Log Uo – Kr.C Hiện nay có 2 phương pháp điện di: điện di cứng và điện di ngang 10 Điện di gel agarose - Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước 0,5 – 20 kb. - Điện di theo phương nằm ngang độ phân giải thay đổi khi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi. - Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi, nhận ethydium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acide và sẽ phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Điện di trên gel agarose của DNA bộ gen tế bào. [...]... dò là một phân tử đánh dấu nên ohair dễ được phát hiện và định lượng 7.1.3 Các tác nhân đánh dấu mâu dò: -Đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ -Đánh dấu bằng phương pháp hóa học 20 7.2 Các phương pháp đánh dấu 7.2.1 Phương pháp Nick - translation Nguyên tắc: sử dụng AND ase I để cắt phân tử AND ở những vị trí khác nhau để tạo ra những lỗ thũng phân bố ngẫu nhiên trên cả 2 mạch Kết quả là tạo ra phân tử AND... trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS -Cho phép phân tách các phân tử protein có khối lượng khác nhau -SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide -Các phân tử protein chuyển động trong điện trường từ cực âm sang cực dương -Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau 22 Phản ứng lai kháng nguyên-kháng... ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể: 24 8 PHƯƠNG PHÁP PCR -Phương pháp PCR (polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Millin và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự có mặt của tế bào -Mục đích phương pháp: Để nhân DNA nhiều lần trong ống nghiệm -Để thực hiện được phương pháp này cần có: - Phân tử DNA cần nhân lên - Hai DNA mồi (primers),... phương pháp ly tâm trên gradient saccharose để phân tách một hỗn hợp có kích thước chênh lệch nhau lớn 12 13 5 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Mục đích: tách acide nucleic - Sắc ký ái lực trên oli go-T-cellulose để tinh sạch mARN - Sắc ký lọc gel dùng để tách các acide nucleic và các nucleotide tự do sau khi tạo mẫu - Sắc ký trao đổi ion trên cột để thu hồi các lượng rất nhỏ ADN - Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp. .. được đánh dấu trên suốt chiều đà phân tử 7.2.2 Phương pháp Random priming ( thiết lập mồi ngẫu nhiên) Mô tả phương pháp: Mẫu dò được gây biến tính bằng nhiệt độ cao, sau đó làm lạnh đột ngột Sau đó thêm vào phản ứng 1 hỗn hợp các oligonucleotide nhân tạo Kết quả: mạch mới được tổng hợp cũng trở thành mạch được đánh dấu 7.2.3 phương pháp đánh dấu các oligonucleitide Các oligonucleotide được tổng hợp... thước mỗi giếng là 5mm2 11 4 PHƯƠNG PHÁP LY TÂM - Ly tâm phân đoạn bằng CsCl là phương pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay để nghiên cứu nhiều vần đề về acide nucleic - Siêu ly tâm trên một gradient liên tục CsCl.trong quá trình ly tâm dd CsCl đậm đặc sẽ tự động hình thành 1 gradient tỷ trọng tăng dần từ miệng tới đáy ống Các nucleotide có tỷ trọng khác nhau sẻ tách thành các lớp khác nhau trong ống... trên gel polyarylamide -Điện di theo phương thẳng đứng -Độ phân giải cao -Phương pháp phát hiện : DNA – phóng xạ tự ghi xanh methylene , ethydium bromide, protein xanh coomassie, nhuộm nitrate bạc -ứng dụng: tinh sạch các oligonucleotit tổng hợp, xác định trình tự DNA, tách các trình tự DNA có kích thước gần bằng nhau, SDS-page ( phân tách protein) Độ nhạy của phương pháp nhuộm trên gel polyacrylamide... nhanh chóng, chính xác từng gen hoặc từng đoạn gen riêng biệt -là kỹ thuật nền cho các nghêin cứu di truyền phân tử như xác định trình tự, lai phân tử, phát hiện đột biến v.v -Để xác định sự có mặt của gen trong tế bào -Tạo mẫu dò -Khôi phục gen của các sinh vật cổ -Nghiên cứu biểu hiện gen -Chẩn đoán nhờ phát hiện các gen đột biến, định lượng gen Sơ đồ phản ứng chuỗi AND plymerase ( PCR): Thank you... blot Lai tại chỗ 17 Sơ đồ của kỷ thuật lai southern blot : ( Phân tích AND bằng kỹ thuật southern blot) 18 Trạng thái của các phân tử trong các pha rắn, lỏng và khí: 19 7 MẪU DÒ VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU 7.1 Mẫu dò: 7.1.1 Khái niệm: Mẫu dò là một bản sao của một trình tự xác định, được đánh dấu để giúp dễ dàng nhận biết trong kỹ thuật phân tử 7.1.2 Nhưỡng đặc tính cơ bản của mẫu dò: -Tính chuyên... Sắc ký trao đổi ion trên cột để thu hồi các lượng rất nhỏ ADN - Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp có độ phân giải rất cao được dùng để tinh sạch các oligonucleotide 14 Tách các chất qua quá trình sắc ký 15 6 PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ 6.1 Khái niệm: - Lai phân tử là sự bắt cặp trở lại của 2 mạch đơn phân tử AND trong điều kiện nhiệt độ giảm từ từ, kết hợp với điều kiện thí nghiệm thích hợp.Nếu trong điều