Aflatoxin thuộc nhóm các chất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vinấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa nhiều ở Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra aflatoxin. Aflatoxin thường nhiễm trên các loại thực phẩm thiết yếu cho người và vật nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám … Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấy từ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin . Dùng các chất chỉ thị sinh học theo dõi trong suốt 1015 năm, người ta nhận thấy rằng ngay từ lúc còn là bào thai, con người đã tiếp xúc với aflatoxin và sẽ tiếp xúc liên tục trong suốt cuộc đời sau này. Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp có thể gây chết người. Nhiễm độc mạn thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan. Nhiễm độc mạn tính tác động đến yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến .
BỘ CÔNG THƯƠNG Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM Phân tích hóa lý thực phẩm GVHD: Nguyễn Thị Hải Hòa Đề tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG CÁC HẠT CÓ DẦU Danh sách nhóm STT Họ tên MSSV Nguyễn Phạm Huỳnh Như 2005140379 Nguyễn Phạm Như Quỳnh 2005140472 Nguyễn Ngọc Tuấn 2005140695 Lê Thị Bích Phượng 2005140438 I Khái quát Aflatoxin • Aflatoxin sinh từ loại nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus • Có nhiều sản phẩm nông nghiệp như: ngô, lạc, lúa mạch, lúa mì, hạt bông,… I Khái quát Aflatoxin • Hiện nay, phát khoảng 16 loại aflatoxin B1 độc • Aflatoxin độc tố tích luỹ thể người gia súc, nguồn có nguy cao gây ung thư mạnh (nhất ung thư gan tổn thương thận) II.Một số kỹ thuật xác định aflatoxin Kỹ thuật xác định aflatoxin Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao Kỹ thuật sắc ký mỏng sắc ký lỏng ghép khối phổ Kỹ thuật sắc ký mỏng Sắc ký lớp mỏng hiệu suất (TLC) cao (HPTLC) III Phương pháp định lượng Aflatoxin Các bước tiến hành: Lấy mẫu Tách chiết Xác định aflatoxin Tinh làm giàu mẫu Lấy mẫu Mẫu lấy phải đại diện cho lô hàng Phải lấy mẫu nhiều vị trí khác lô hàng Đồng mẫu Lượng dùng để phân tích thường khoảng 20-100 gam Chiết mẫu Chiết aftoxin với dung môi hữu như: đicloromethan, benzen, acetonitril, aceton, cloroform hay methanol Thông thường sử dụng để chiết aflatoxin hỗn hợp cloroform-nước methanol-nước hay acetonitril - nước Thêm dung môi n-hexan để tách chất béo Chiết mẫu Quá trình chiết thực nhiệt độ phòng cách lắc thông thường khoảng 30 phút hay dùng máy khuấy tốc độ cao 1-3 phút IV Phương pháp xác định aflatoxin cột lực miễn dịch: Nguyên tắc Aflatoxin mẫu chiết methanol Sau làm cột sắc ký lực miễn dịch tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid (TFA) xác định máy sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang Thiết bị • Máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1100 Cột sắc ký lỏng Inertsil ODS-3V- 150 4mm Máy quang phổ huỳnh quang, Vicam series • Cân phân tích 04 số lẻ: AB-204S (Mettler Toledo) • Máy lọc nước siêu 631 RF, Sartorius • Máy xay mẫu khô A10-S9, IKA 2000 vòng/phút • Máy lắc mẫu • Bơm chân không bể siêu âm Dụng cụ - hóa chất Hóa chất ₋ Cột sắc ký lực miễn dịch aflatoxin ₋ Dung dịch chiết mẫu methanol : nước (70:30) ₋ Dung dịch acetonitril : nước ( 10:90 ) ₋ Dung dịch pha động acetonitrile : nước (25:75) dung môi lọc qua phin lọc 0,45um, rung siêu âm đuổi khí Hóa chất ₋ ₋ ₋ ₋ Dung dịch chuẩn gốc Aflatoxin B1,B2,G1,G2 pha acetonitril: benzene ( 2:98) Các hóa chất khác: Nước cất siêu sạch,Methanol,Acetonitrile,NaCl, Trifluro acetic acid (TFA), n-Hecxane Các dung môi sử dụng đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC Các hóa chất khác phải đạt mức độ phân tích Dụng cụ • Các dụng cụ thủy tinh xác bình định mức, pipet, loại class A • Micropipet loại 0,5 ÷ 10 µl, 10 ÷ 100 µl, 100 ÷ 1000 µl Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu Xác định Aflatoxin hệ thống sắc ký lỏng Tạo dẫn xuất Aflatoxin Chuẩn bị dung dịch mẫu Chuẩn bị mẫu Cân 25g mẫu thêm vào 5g NaCl cho vào bình tam giác có nút , sau thêm 125ml dung dịch chiết ( methanol: nước = 70:30) vào bình lắc máy lắc ngang 60 phút Cuối lọc qua giấy lọc thô Chuẩn bị mẫu Lấy 15ml dung dịch lọc pha với 30ml nước cất cho dung dịch qua cột sắc kí lực với vận tốc khoảng 6ml/phút Rửa cột sắc kí lực lần nước cất với vận tốc 6ml/phút, rửa giải aflatoxin 2ml methanol Cuối thổi khô dung dịch mẫu aflatoxin khí nitơ Tạo dẫn xuất Aflatoxin Hòa tan mẫu aflatoxin 200 µl n-hecxan thêm vào 50 µl trifluro acetic acid, để nhiệt độ phòng phút Tiếp đến cho vào mẫu 2ml dung dịch acetonitril : nước ( 10 :90), lắc mạnh, để yên cho tách lớp Dùng syringe để lấy lớp nước lọc qua phin lọc 0,45 um Cuối đưa vào máy HPLC Chuẩn bị dung dịch chuẩn Pha dung dịch chuẩn gốc từ 10ppb từ dung dịch chuẩn mẹ, lấy 2ml dung dịch chuẩn 10ppb thổi khô khói nitơ Dung dịch dùng để tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid Xác định Aflatoxin hệ thống sắc ký lỏng Chọn bước sóng kích thích 360nm, bước sóng phát xạ 440nm Tốc độ dòng 1,2ml/phút Cột sắc ký Inertsil – ODS- 3V(RP18) Thể tích tiêm mẫu 20 µl Thời gian chạy sắc ký 15 phút Thời gian lưu aflatoxin khoảng – 15 phút Tính kết Nồng độ aflatoxin ( ug/kg): Caflatoxin= • Trong : m: khối lượng cân (g) Cc : nồng độ chuẩn ( ppb) Sm: Diện tích peak mẫu SC : Diện tích peak chuẩn V : thể tích cuối để đo [...]... được lọc qua phin lọc 0,45um, rung siêu âm đuổi khí Hóa chất ₋ ₋ ₋ ₋ Dung dịch chuẩn gốc Aflatoxin B1,B2,G1,G2 pha trong acetonitril: benzene ( 2:98) Các hóa chất khác: Nước cất siêu sạch,Methanol,Acetonitrile,NaCl, Trifluro acetic acid (TFA), n-Hecxane Các dung môi sử dụng đều đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC Các hóa chất khác phải đạt được mức độ phân tích Dụng cụ • Các dụng cụ thủy tinh chính xác như... ký lỏng Inertsil ODS-3V- 150 4mm Máy quang phổ huỳnh quang, Vicam series 4 • Cân phân tích 04 số lẻ: AB-204S (Mettler Toledo) • Máy lọc nước siêu sạch 631 RF, Sartorius • Máy xay mẫu khô A10-S9, IKA 2000 vòng/phút • Máy lắc mẫu • Bơm chân không và bể siêu âm 3 Dụng cụ - hóa chất Hóa chất ₋ Cột sắc ký ái lực miễn dịch aflatoxin ₋ Dung dịch chiết mẫu methanol : nước (70:30) ₋ Dung dịch acetonitril :... Tinh sạch và làm giàu mẫu • • Trên cột IAC, kháng thể đặc hiệu với aflatoxin được gắn lên pha rắn Cho dịch chiết chứa aflatoxin đi qua cột sắc ký, aflatoxin sẽ liên kết đặc hiệu với kháng thể đã gắn trên pha rắn và bị giữ lại Các tạp chất theo dòng dung dịch ra khỏi cột Rửa các tạp chất còn lại trên cột Rửa giải aflatoxin bằng một thể tích nhỏ dung môi Tinh sạch và làm giàu mẫu Hạn chế : Một trong... dẫn xuất với trifluro acetic acid Xác định Aflatoxin trên hệ thống sắc ký lỏng Chọn bước sóng kích thích là 360nm, bước sóng phát xạ là 440nm Tốc độ dòng 1,2ml/phút Cột sắc ký Inertsil – ODS- 3V(RP18) Thể tích tiêm mẫu 20 µl Thời gian chạy sắc ký là 15 phút Thời gian lưu của aflatoxin khoảng 5 – 15 phút 4 Tính kết quả Nồng độ aflatoxin ( ug/kg): Caflatoxin= • Trong đó : m: khối lượng cân... cho dung dịch qua cột sắc kí ái lực với vận tốc khoảng 6ml/phút Rửa cột sắc kí ái lực 2 lần bằng nước cất với vận tốc 6ml/phút, và rửa giải aflatoxin bằng 2ml methanol Cuối cùng thổi khô dung dịch mẫu aflatoxin bằng khí nitơ Tạo dẫn xuất Aflatoxin Hòa tan mẫu aflatoxin bằng 200 µl n-hecxan rồi thêm vào 50 µl trifluro acetic acid, rồi để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Tiếp đến cho vào mẫu 2ml dung dịch... phút Thời gian lưu của aflatoxin khoảng 5 – 15 phút 4 Tính kết quả Nồng độ aflatoxin ( ug/kg): Caflatoxin= • Trong đó : m: khối lượng cân (g) Cc : nồng độ chuẩn ( ppb) Sm: Diện tích peak mẫu SC : Diện tích peak chuẩn V : thể tích cuối cùng để đo ... • Các dụng cụ thủy tinh chính xác như bình định mức, pipet, loại class A • Micropipet các loại 0,5 ÷ 10 µl, 10 ÷ 100 µl, 100 ÷ 1000 µl 4 Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu Xác định Aflatoxin trên hệ thống sắc ký lỏng Tạo dẫn xuất Aflatoxin Chuẩn bị dung dịch mẫu Chuẩn bị mẫu Cân 25g mẫu thêm vào 5g NaCl cho vào bình tam giác có nút , sau đó thêm 125ml dung dịch chiết ( methanol: nước = 70:30) vào bình rồi... aflatoxin bằng một thể tích nhỏ dung môi Tinh sạch và làm giàu mẫu Hạn chế : Một trong các bất lợi chủ yếu của cột IAC là giá thành Làm sạch mẫu bằng cột IAC IV Phương pháp xác định aflatoxin bằng cột ái lực miễn dịch: 1 Nguyên tắc Aflatoxin trong mẫu được chiết bằng methanol Sau đó được làm sạch bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch và tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid (TFA) rồi xác định trên máy sắc ký lỏng