Aflatoxin thuộc nhóm các chất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vinấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa nhiều ở Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra aflatoxin. Aflatoxin thường nhiễm trên các loại thực phẩm thiết yếu cho người và vật nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám …Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấy từ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin . Dùng các chất chỉ thị sinh học theo dõi trong suốt 1015 năm, người ta nhận thấy rằng ngay từ lúc còn là bào thai, con người đã tiếp xúc với aflatoxin và sẽ tiếp xúc liên tục trong suốt cuộc đời sau này. Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp có thể gây chết người. Nhiễm độc mạn thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan. Nhiễm độc mạn tính tác động đến yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến .
BỘ CÔNG THƯƠNG Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM Khoa Công nghệ thực phẩm BÀI TIỂU LUẬN Đề Tài: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG CÁC HẠT CÓ DẦU GVHD: Nguyễn Thị Hải Hòa Tháng năm 2016 Tháng năm 2016 DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM Tên MSSV MỤC LỤC Lời mở đầu Aflatoxin thuộc nhóm chất chuyển hóa có độc tính cao, tiết từ vinấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa nhiều Việt Nam thích hợp cho loại vi nấm phát triển mạnh sản xuất aflatoxin Aflatoxin thường nhiễm loại thực phẩm thiết yếu cho người vật nuôi gạo, ngô, lạc, đậu, cám … Người bị nhiễm aflatoxin ăn phải loại ngũ cốc có aflatoxin ăn sản phẩm thịt, cá, trứng, sữa lấy từ động vật nuôi thức ăn nhiễm aflatoxin Dùng chất thị sinh học theo dõi suốt 10-15 năm, người ta nhận thấy từ lúc bào thai, người tiếp xúc với aflatoxin tiếp xúc liên tục suốt đời sau Nhiễm độc aflatoxin gây loạt triệu chứng cấp tính mạn tính Nhiễm độc cấp gây chết người Nhiễm độc mạn thường biểu ăn ngon, chậm lớn, tổn thương gan Nhiễm độc mạn tính tác động đến yếu tố di truyền tương ứng với kiểu gây ung thư, quái thai đột biến Ảnh hưởng quan trọng dẫn đến việc phải kiểm soát gắt gao hàm lượng aflatoxin thực phẩm khả gây ung thư tế bào gan nguyên phát Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) xếp aflatoxin vào nhóm I: chất gây ung thư cho người Do độc tính aflatoxin, có 99 quốc gia giới (trong có Việt Nam) đưa tiêu chuẩn giới hạn aflatoxin thực phẩm đồng thời quy định, hướng dẫn phương pháp phân tích xác định chúng Và khuôn khổ cáo báo xin giới thiệu quy trình định lượng Aflatoxin cột sắc ký lực miễn dịch kết hợp hệ thống sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang I Khái quát aflatoxin Aflatoxin có tên từ nấm mốc sinh chúng (Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus) Có thể tìm thấy nhiều sản phẩm nông nghiệp như: ngô, lạc, lúa mạch, lúa mì, hạt bông,… Hiện nay, nhà khoa học phát khoảng 16 loại aflatoxin khác nhau: Aflatoxin B1, B2, B2a, B3, G1, G2a, M1, GM2, P1, Q1, RO, RB1, RB2, AFL, AFLH, AFLM chất bắt nguồn từ methoxy, ethoxy acetoxy Quan trọng Aflatoxin B1 ghi nhận hợp chất xuất tự nhiên, chất lại sản sinh trình trao đổi chất, dẫn xuất Trong đó, Aflatoxin ký hiệu “B” chúng phát huỳnh quang màu xanh (blue) tia UV, ký hiệu “G” cho màu xanh lục (green) ánh sáng tia UV, ký hiệu “M” tìm thấy sữa bò ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxin Chúng hợp chất phân cực, khối lượng phân tử thấp, chịu hóa chất tính chất lý học, sinh học Aflatoxin độc tố tích luỹ thể người gia súc, nguồn có nguy cao gây ung thư mạnh (nhất ung thư gan tổn thương thận) Giới hạn tối đa cho phép độc tố vi nấm Aflatoxin B1 thực phẩm nói chung 5µg/kg Giới hạn tối đa cho phép hàm lượng tổng độc tố vi nấm aflatoxin (B1,B2,G1.G2) thực phẩm nói chung 15µg/kg II Một số kỹ thuật xác định aflatoxin Xác định aflatoxin kỹ thuật sắc ký mỏng Xác định aflatoxin kỹ thuật sắc ký mỏng (TLC): Phương pháp sử dụng lần vào năm 1960 Người ta sử dụng mỏng tráng silica gel để xác định aflatoxin Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy mỏng chloroform: methanol choloroform: aceton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi làm tăng khả hòa tan aflatoxin Phương pháp xác đinh lượng aflatoxin từ - 4.10-4µg (0,3 – 0,4 mg).Nhược điểm phương pháp phụ thuộc người phân tích Khi so sánh mẫu thực mẫu chuẩn có sai lệch kết từ 20 - 30% Ưu điểm: + Chỉ cần lượng mẫu để phân tích + Có thể phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối chứng điều kiện phân tích + Tất hợp chất mẫu phân tích định vị sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao (High ferformane thin layer chromatography - HPTLC): Do khiếm khuyết phương pháp sắc kí lớp mỏng đơn khâu chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao khía cạnh sau: đưa mẫu lên mỏng cách tự động, cải thiện đồng lớp hấp phụ, chạy mỏng dung môi có kiểm soát Quá trình đưa mẫu vào mỏng tự động hóa, vết định vị trí đo lường độ huỳnh quang vết máy densitometers Sử dụng kỹ thuật làm tăng tính thuyết phục phương pháp TCL phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu Xác định aflatoxin kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector UV detector huỳnh quang sắc ký lỏng ghép khối phổ Phương sắc ký lỏng HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng lĩnh vực quan trọng đại hoá học Nó ứng dụng rộng rãi hầu hết ngành khoa học công nghiệp liên quan tới hoá học: Phân tích định tính định lượng, điều chế chất tinh khiết, xác định số hoá lý, nghiên cứu trình động học xúc tác; Trong luyện kim, địa chất, điện, than, dầu mỏ, y dược, nông nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trường… Chính thế, hàng năm giới công bố tới vài ba nghìn công trình liên quan tới sắc ký Đối với nước ta, phương pháp sắc ký xâm nhập hàng chục năm áp dụng rộng rãi Phương pháp sử dụng hai pha pha động pha tĩnh, dựa hấp thụ tia tím (UV) xác định cường độ huỳnh quang Các chất có chất khác bị tách theo thời gian khác cột tách Mẫu phân tích tách Chloroform nước, ly tâm chất tách làm qua silicagel, pha tĩnh thường sử dụng cột nhồi silicagel micromet pha động sử dụng bezen: Acetonitril: axitformic Sau aflatoxin phát nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát phương pháp 0,3 ppb cho aflatoxin III Phương pháp định lượng Aflatoxin Lấy mẫu - Mẫu lấy từ sản phẩm cần phân tích phải đại diện cho lô sản phẩm Do lượng độc tố cần phát hàm lượng thấp phân bố không đồng sản phẩm, nên việc lấy mẫu cần phải có phương pháp thích hợp - Thông thường, tùy theo loại thực phẩm khối lượng thực phẩm cần phân tích, việc lấy mẫu thực từ nhiều vị trí khác với lượng khác Các lượng gộp lại thành mẫu - Lượng dùng để phân tích thường khoảng 20-100 gam, tùy vào loại thực phẩm hàm lượng aflatoxin cao hay thấp mẫu Chuẩn bị mẫu 2.1 Chiết mẫu - Phần lớn mẫu cần phân tích đưa vào máy đo trực tiếp lượng aflatoxin mà cần phải qua giai đoạn chiết chúng khỏi mẫu loại bỏ tạp chất Quá trình chiết phụ thuộc nhiều vào đặc tính hóa lý chất đồng tan với aflatoxin Do aflatoxin tan dung môi phân cực không tan dung môi phân cực cao, nên chúng thường chiết với dung môi hữu dicloromethan, benzen, acetonitril, aceton, cloroform hay methanol Nước có thểđồng tan nhiều dung môi - Hệ thống dung môi thông thường sử dụng để chiết aflatoxin hỗn hợp cloroform-nước methanol-nước hay acetonitril - nước Sự thêm dung môi không phân cực n-hexan để tách chất béo sử dụng - Quá trình chiết thực nhiệt độ phòng cách lắc thông thường khoảng 30 phút hay dùng máy khuấy tốc độ cao 1-3 phút 2.1 Tinh làm giàu mẫu - Quá trình tinh làm giàu mẫu thường sử dụng kỹ thuật chiết xuất pha rắn (Solid Phase Extraction-SPE) + Các pha tĩnh sử dụng thông dụng cột SPE silicagel magnesium silicat ( Florisil) Các pha rắn liên kết với aflatoxin theo chế kỵ nước,do có tính chọn lọc tương đối, phân giải nhiều trường hợp không lý tưởng aflatoxin chiếm tỷ lệ nhỏ so với tạp chất đồng chiết - Cột chiết xuất pha rắn dựa tương tác đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể (cột lực miễn dịch - IAC) + Trên cột IAC, kháng thể đặc hiệu với aflatoxin gắn lên pha rắn Cho dịch chiết chứa aflatoxin qua cột sắc ký, aflatoxin liên kết đặc hiệu với kháng thể gắn pha rắn bị giữ lại Các tạp chất theo dòng dung dịch khỏi cột Rửa tạp chất lại cột Rửa giải aflatoxin thể tích nhỏ dung môi Dịch rửa giải thường sạch, có tạp chất gây nhiễu Cột IAC vừa có tác dụngtinh chế vừa có tác dụng làm giàu aflatoxin + Một bất lợi chủ yếu cột IAC giá thành IAC sử dụng lượng lớn kháng thể nhiều phương pháp hóa miễn dịch khác, giá thành cột sắc ký cao ‘ Làm mẫu cột IAC Phương pháp xác định Aflatoxin cột lực miễn dịch 3.1 Nguyên tắc - Nguyên tắc : Aflatoxin mẫu chiết methanol Sau làm cột sắc ký lực miễn dịch tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid ( TFA) xác định máy sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang + Sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC ) HPLC ngày sử dụng rộng rãi phân tích aflatoxin có nhiều ưu điểm kỹ thuật khả phân giải phát cao, khả tự động hóa Dựa đặc tính phát huỳnh quang aflatoxin, người ta dùng hệ thống sắc ký với đầu dò huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 360 nm, bước sóng phát xạ >420 nm) đầu dò cho độ nhạy cao Đặc tính phát huỳnh quang aflatoxin phụ thuộc vào thành phần dung môi Phương pháp ứng dụng rộng rãi để định lượng Aflatoxin nông sản, thực phẩm 3.2 Thiết bị hóa chất- dụng cụ Thiết bị - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1100 - Cột sắc ký lỏng Inertsil ODS-3V- 150 4mm - Máy quang phổ huỳnh quang, Vicam series - Máy lọc nước siêu 631 RF, Sartorius - Cân phân tích 04 số lẻ: AB-204S (Mettler Toledo) - Máy xay mẫu khô A10-S9, IKA 2000 vòng/phút - Máy lắc mẫu OMS 01 Denley 350 vòng/phút - Bơm chân không bể siêu âm Hóa chất - Cột sắc ký lực miễn dịch aflatoxin (Vicam - USA, lô 1678i sản xuất 07/08) - Dung dịch chiết mẫu methanol : nước ( 70:30) - Dung dịch acetonitril : nước ( 10:90 ) - Dung dịch pha động acetonitrile : nước ( 25:75) dung môi lọc qua phin lọc 0,45um, rung siêu âm đuổi khí - Dung dịch chuẩn gốc Aflatoxin B1,B2,G1,G2 pha acetonitril: benzene ( 2:98) - Các hóa chất khác : : Nước cất siêu sạch,Methanol, Acetonitrile, NaCl, Trifluro acetic acid (TFA), n-Hecxane + Các dung môi sử dụng đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC + Các hóa chất khác phải đạt mức độ phân tích Dụng cụ - Các dụng cụ thủy tinh xác bình định mức, pipet, loại class A - Micropipet loại 0,5 ÷ 10 µl, 10 ÷ 100 µl, 100 ÷ 1000 µl 3.3 Cách tiến hành a) Chuẩn bị mẫu - Cân khoảng 25g mẫu ( đồng ) , thêm vào 5g NaCl cho vào bình tam giác có nút , sau thêm 125ml dung dịch chiết ( methanol: nước = 70:30) vào bình lắc máy lắc ngang 60 phút Cuối lọc qua giấy lọc thô - Lấy 15ml dung dịch lọc pha với 30ml nước cất cho dung dịch qua cột sắc kí lực với vận tốc khoảng 6ml/phút - Rửa cột sắc kí lực lần nước cất với vận tốc 6ml/phút, rửa giải aflatoxin 2ml methanol - Cuối thổi khô dung dịch mẫu aflatoxin khí nitơ b) Tạo dẫn xuất Aflatoxin - Hòa tan mẫu aflatoxin 200 µl n-hecxan thêm vào 50 µl trifluro acetic acid, để nhiệt độ phòng phút + Tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid ( TFA ) để biến đổi AFB1, AFG1 không phát huỳnh quang thành dạng bán acetal AFB2a AFG2a có khả phát huỳnh quang mạnh + Quá trình tạo dẫn xuất với TFA trình chiết lỏng-lỏng với n-hexan để tách chất béo khỏi aflatoxin - Tiếp đến cho vào mẫu 2ml dung dịch acetonitril : nước ( 10 :90), lắc mạnh, để yên cho tách lớp - Dùng syringe để lấy lớp nước lọc qua phin lọc 0,45 um - Cuối đưa vào máy HPLC c) Chuẩn bị dung dịch chuẩn Pha dung dịch chuẩn gốc từ 10ppb dung dịch chuẩn mẹ, lấy 2ml dung dịch chuẩn 10ppb thổi khô khói nitơ Dung dịch dùng để tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid d) Xác định aflatoxin hệ thống sắc ký lỏng - Chọn bước sóng kích thích 360nm, bước sóng phát xạ 440nm - Tốc độ dòng 1,2ml/phút - Cột sắc ký Inertsil – ODS- 3V(RP18) - Thể tích tiêm mẫu 20 µl - Thời gian chạy sắc ký 15 phút - Thời gian lưu aflatoxin khoảng – 15 phút d) Tính kết Nồng độ aflatoxin ( ug/kg) Caflatoxin= Trong : - khối lượng cân (g) - Cc nồng độ chuẩn ( ppb) - Sm : Diện tích peak mẫu - SC Diện tích peak chuẩn - V : thể tích cuối để đo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 Bộ trưởng Bộ Y tế [2] Giáo trình phân tích hóa lý thực phẩm 1, khoa công nghệ thực phẩm,Trường ĐH Công nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh, 2003 [3] http://tdt.edu.vn/images/stories/tapchikhoahocungdung/tckhud12/14-17.pdf [4] Nguyễn Thị Nguyệt Thu – Luận án tiến dĩ dược học « Tách chiết, phân tích Aflatoxin thực phẩm dược liệu cột sắc ký lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu cao « , Đại học dược Hà Nội , 2011 [...]... xuất với trifluro acetic acid d) Xác định aflatoxin trên hệ thống sắc ký lỏng - Chọn bước sóng kích thích là 360nm, bước sóng phát xạ là 440nm - Tốc độ dòng 1,2ml/phút - Cột sắc ký Inertsil – ODS- 3V(RP18) - Thể tích tiêm mẫu 20 µl - Thời gian chạy sắc ký là 15 phút - Thời gian lưu của aflatoxin khoảng 5 – 15 phút d) Tính kết quả Nồng độ aflatoxin ( ug/kg) Caflatoxin= Trong đó : - khối lượng cân... : - khối lượng cân (g) - Cc nồng độ chuẩn ( ppb) - Sm : Diện tích peak mẫu - SC Diện tích peak chuẩn - V : thể tích cuối cùng để đo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế [2] Giáo trình phân tích hóa lý thực phẩm 1, khoa công nghệ thực phẩm,Trường ĐH Công... Công nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh, 2003 [3] http://tdt.edu.vn/images/stories/tapchikhoahocungdung/tckhud12/14-17.pdf [4] Nguyễn Thị Nguyệt Thu – Luận án tiến dĩ dược học « Tách chiết, phân tích Aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao « , Đại học dược Hà Nội , 2011 ...+ Quá trình tạo dẫn xuất với TFA và quá trình chiết lỏng-lỏng với n-hexan để tách các chất béo khỏi aflatoxin - Tiếp đến cho vào mẫu 2ml dung dịch acetonitril : nước ( 10 :90), lắc mạnh, rồi để yên cho tách lớp - Dùng syringe để lấy lớp nước ở dưới rồi lọc qua phin lọc 0,45 um - Cuối cùng đưa vào máy