Nghiên cứu sản xuất rượu brandy từ quả bần chua (Sonneratia caseolaris)

2. Mục tiêu nghiên cứu và nội dung nghiên cứu 2.1. Mục tiêu Sản xuất thành công rượu brandy từ quả bần chua ở quy mô lên men 350 lmẻ. 2.2. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu lên men rượu brandy từ quả bần chua với quy mô 350l mẻ. 2. Nghiên cứu chưng cất thu hồi với quy mô 20lmẻ. 3. Phân tích một số thành phần (axit, fusel, aldehyde, methanol, furfurol) trong rượu brandy. 4. Nghiên cứu nâng cao chất lượng rượu brandy từ quả bần chua trên cơ sở nghiên cứu làm giảm hàm lượng các chất: aldehyde, methanol và furfurol. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Rượu brandy Từ “ brandy” được dùng để chỉ sản phẩm rượu thu được từ chưng cất rượu vang hoặc nước trái cây lên men. Ở một số nước brandy là từ chỉ dược dùng cho các sản phẩm chưng cất từ rượu nho. Tuy nhiên, ở Hoa kì và nhiều nước khác, nước quả lên men của các loại trái cây khác cũng được sử dụng để sản xuất brandy. Các loại trái cây có thể là đào,mơ, mâm xôi, anh đào,… Nhưng về mặt thương mại thì brandy nho vẫn giữ vai trò quan trọng nhất (Tsakirisvà cs, 2013). Sau khi được chưng cất, rượu brandy được ủ trong thùng gỗ sồi một thời gian dài làm cho nó có màu hổ phách. Thời gian ủ ít nhất là sáu tháng đến một năm, sau đó nó được giảm nồng độ bằng cách pha thêm nước cất (Tsakiris và cs, 2013). Độ cồn của rượu brandy thường từ 40 60%.

LỜI CẢM ƠN

Một chặng đường học tập và nghiên cứu tại Bộ môn CNSH – Vi sinh, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội sắp qua Trong suốt quãng thời gian ấy, em không chỉ học được nhiều ki thức và bài học bổ ích mà còn nhận được sự dạy dỗ nhiệt tình của các thầy cô.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đoàn Văn Thược, người đã

tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình em thực hiện luận văn của mình.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths Trần Hữu Phong, Ths.

Hoàng Thị Lệ Thương cùng các thầy cô giáo, cán bộ công nhân viên cùng

các anh chị và các bạn đang học tập và nghiên cứu tại Bộ môn CNSH- Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại Học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè cùng các thầy cô, đồng nghiệp trong trường THPT Hưng Nhân (Thái Bình) đã luôn động viên, giúp đỡ và là nguồn động lực cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 10 năm 2015

Học viên

Vũ Thị Hằng

CÁC TỪ VIẾT TẮT

BYT : Bộ Y Tế

ĐHBK : Đại học Bách Khoa

ĐHSP : Đại Học Sư Phạm

ĐHQG : Đại Học Quốc Gia

HPLC : High-performance liquid chromatography(Sắc kí lỏng hiệu năng cao)MERD : Mangrove Ecosystems Research DivisionNXB : Nhà xuất bản

OD : Optical Density

QCVN : Quy chuẩn Việt Nam

UNESCO : United Nations Educational, Scientific and Cultural - Organization

UV : Ultra Violet

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

TB : Trung bình

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng furfurol

Hình 3.1 Ngâm đường với tỉ lệ 2 quả: 1 đường

Hình 3.2 Rửa sạch, bỏ cuống và để chờ chín

Hình 3.3 Quả mốc và thối hỏng

Hình 3.4 Giấm chín quả trong thùng xốp

Hình 3.5 Quả bần chua sau 2 tuần chiết dịch

Hình 3.6 Tiến hành loại bỏ bã

Hình 3.7 Lọc dịch quả, bỏ bã

Hình 3.8 Cho dịch quả vào thùng lớn để lên men

Hình 3.9 Động thái lên men rượu từ quả bần chua

Hình 3.10 Hàm lượng một số chất trong rượu brandy bần chua

chưa qua xử lý và đã qua xử lý

Hình 3.11 Hàm lượng furfurol trong các mẫu rượu khi bổ sung than hoạt tính

Hình 3.12 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất rượu brandy từ quả bần chua 49

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Rượu brandy là một loại rượu mạnh được làm từ nước ép quả hoặc thịtquả và vỏ quả lên men Độ cồn của brandy luôn từ 40 % - 60% Công nghệsản xuất brandy có từ lâu đời ở các nước châu Âu có khí hậu ôn đới, mỗi quốcgia có một loại brandy nổi tiếng đặc trưng cho mình Nó được đặc trưng bởinguyên liệu sản xuất, nguồn nước, tiểu vùng khí hậu và đặc biệt là công nghệsản xuất (Vũ Thị Kim Phong, 2011).

Việt Nam là quốc gia gắn liền với nền văn minh lúa nước, rượu ViệtNam chủ yếu được sản xuất từ gạo và các nguyên liệu tinh bột Tuy nhiên, khinền nông nghiệp mở rộng, diện tích cây ăn quả tăng lên cùng với nhu cầu vềrượu trái cây ngày một cao đã thúc đẩy sản xuất rượu hoa quả phát triển Sảnxuất rượu brandy từ trái cây là một trong những phương án đưa khoa học,công nghệ vào đời sống, nâng cao thu nhập cho người dân Dù vậy, để đạthiệu quả, đem lại lợi nhuận cao thì phải tìm được nguồn nguyên liệu dồi dào,

rẻ tiền và có thể phát triển sản xuất trên quy mô công nghiệp

Bần chua tên khoa học là Sonneratia caseolaris (L.), thuộc họ Bần

Sonneratiaceae, bộ Sim Myrtales, là một loài cây gỗ cao, mọc ở khu vực rừngngập mặn ven biển, phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Ở Việt Nam, cây bầnchua phân bố từ Bắc tới Nam Đây là một loài cây có vai trò to lớn trong việcbảo hộ, lấy gỗ và bảo tồn sinh thái biển (Phan Nguyên Hồng , 1999) Quả bầnkhi chín có vị chua của phần thịt quả, vị chát của phần hột, chứa hàm lượngpectin cao và các chất chống oxy hóa, đồng thời mang nhiều đặc điểm riêngkhác phù hợp để sản xuất rượu mạnh (Mahadlek, 2012) Hiện nay, một sốnước đã tiến hành sản xuất nước uống, làm mứt, làm kẹo từ quả bần chua.Tuy nhiên, hầu như chỉ sản xuất trên quy mô hộ gia đình nhỏ lẻ và chỉ sử

dụng rất ít số lượng quả, còn phần lớn quả bần vẫn lãng phí, chưa được tậndụng để phát triển kinh tế.

Do đó, việc sản xuất rượu từ quả bần là một hướng đi khả quan, có thểtạo ra sản phẩm mới, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, đem lại hiệu quảkinh tế cao, phù hợp với xu hướng phát triển chung của Việt Nam cũng nhưcủa thế giới Nhiều nghiên cứu sản xuất rượu từ trái bần chua được tiến hànhnhưng vẫn chỉ ở mức thí nghiệm và chất lượng rượu thu được chưa cao Đểđem lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần phát triển bền vững cây bần chua thìviệc nâng cao chất lượng rượu từ quả bần và ứng dụng vào thực tiễn sản xuấttrên quy mô công nghiệp là điều cần thiết

Từ những lý do trên, tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu sản xuất rượu brandy từ quả bần chua (Sonneratia caseolaris)”.

2 Mục tiêu nghiên cứu và nội dung nghiên cứu

2.1 Mục tiêu

Sản xuất thành công rượu brandy từ quả bần chua ở quy mô lên men

350 l/mẻ

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu lên men rượu brandy từ quả bần chua với quy mô 350l/ mẻ

2 Nghiên cứu chưng cất thu hồi với quy mô 20l/mẻ

3 Phân tích một số thành phần (axit, fusel, aldehyde, methanol, furfurol) trongrượu brandy

4 Nghiên cứu nâng cao chất lượng rượu brandy từ quả bần chua trên cơ sởnghiên cứu làm giảm hàm lượng các chất: aldehyde, methanol và furfurol

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Rượu brandy

Từ “ brandy” được dùng để chỉ sản phẩm rượu thu được từ chưng cấtrượu vang hoặc nước trái cây lên men Ở một số nước brandy là từ chỉ dượcdùng cho các sản phẩm chưng cất từ rượu nho Tuy nhiên, ở Hoa kì và nhiềunước khác, nước quả lên men của các loại trái cây khác cũng được sử dụng đểsản xuất brandy Các loại trái cây có thể là đào,mơ, mâm xôi, anh đào,…Nhưng về mặt thương mại thì brandy nho vẫn giữ vai trò quan trọng nhất(Tsakiris và cs, 2013)

Sau khi được chưng cất, rượu brandy được ủ trong thùng gỗ sồi mộtthời gian dài làm cho nó có màu hổ phách Thời gian ủ ít nhất là sáu thángđến một năm, sau đó nó được giảm nồng độ bằng cách pha thêm nước cất(Tsakiris và cs, 2013) Độ cồn của rượu brandy thường từ 40 - 60%

1.1.1 Lịch sử phát triển rượu brandy

Rượu brandy được ra đời từ một thương nhân người Hà Lan gốc Đứctên là Den Helkenwijk, người chuyên buôn rượu chát từ Pháp sang Hà Lan

Do việc vận chuyển và việc bảo quản rượu vang khá khó khăn nên ông đãsáng chế ra phương pháp chưng cất cách thủy rượu vang chát, tạo nên mộtloại rượu có nồng độ mạnh hơn và ít hơn về thể tích

Quốc gia khai sinh ra rượu brandy là Pháp Hai loại rượu brandy nổitiếng nhất của Pháp là Cognac và Armagnac Tên gọi của các loại rượu nàybắt nguồn từ 2 vùng đất miền Tây Nam nước Pháp: Cognac, Armagnac Tạiđây có trồng giống nho trắng nổi tiếng để sản xuất rượu brandy Giống nhonày nếu đem trồng ở nơi khác thì không sản xuất được loại rượu brandy ngonnhư ở Cognac và Armagnac Chính phủ Pháp đã đăng ký tên Cognac vàArmagnac như là một sỡ hữu độc nhất cho hai vùng trên

Hiện nay, brandy được sản xuất ở nhiều nơi trên thế gới Brandy nổitiếng ở Tây Ban Nha có nguồn gốc từ khu vực Jeres, tại đây rượu brandyđược ủ lâu năm trong các thùng gỗ sherry Các loại rượu brandy ở Nam Mỹđược biết đến nhiều nhất là Piso, chủ yếu từ nho Muscat của Peru Tại Chile,brandy được làm từ nhiều giống nho khác nhau và được chưng cất trong nồi.Brandy Ý được sản xuất từ rượu vang trong vùng và chưng cất bằng thiết bịcất dạng cột Brandy Đức được gọi là weinbrandy “rượu đốt cháy”, làm từvang nhập khẩu (Tsakiris và cs, 2013).

1.1.2 Phân loại rượu brandy

Brandy có 3 loại chính : Brandy nho, brandy từ nho và brandy hoa quả

Brandy nho: làm từ nước ép nho đã lên men, không chứa thịt và vỏ quả

nho Loại rượu này thường có thời gian lưu trữ khá dài trong thùng gỗ sồi đểmùi, vị rượu trở nên ngon hơn Rượu nho brandy được sản xuất ở nhiều nơitrên thế giới

Brandy từ bã nho (pomace brandy): là loại brandy được làm từ thịt quả,

vỏ, thân và phần còn lại của quả nho sau khi đã ép lấy nước, do đó có vị gắtnên phải thời gian ủ khá dài Loại rượu này thường có thời gian lưu trữ trongthùng gỗ tối thiểu nên có hương vị nồng đậm và có mùi vị đặc trưng của loạinho được chế biến đã bị mất đi ở brandy ủ lâu năm trong thùng gỗ

Brandy hoa quả: là tên gọi chung cho các loại rượu brandy được làm từ

nước trái cây lên men trừ nho Những loại trái cây được sử dụng nhiều để làmrượu Brandy là: táo, mận, mơ, đào, anh đào, Các rượu này thường khôngmàu và được uống lạnh hoặc bỏ đá vào để uống

1.1.3 Tình hình sản xuất rượu brandy

Trên toàn cầu, lượng rượu mạnh được sản xuất khoảng 20 tỷ lít thìrượu brandy chiếm khoảng 2 tỷ lít, đứng thứ 5 về lượng sản xuất trongdòng rượu mạnh (Tsakiris và cs, 2013).

Theo tổ chức nghiên cứu thị trường Euomonitor International thì sảnlượng rượu brandy không ngừng tăng trong những năm gần đây Ước tínhtrong vòng 5 năm 2013 - 2018 sẽ tăng khoảng 10% sản lượng(http://www.drinksint.com/news/fullstory.php/aid/5217/The_Brandy_Report:_Introduction 1_12_.html)

Trong năm 2014, doanh thu toàn cầu từ các nhà xuất khẩu rượu brandylên tới US $ 4025742000, tăng 52% về giá trị so với năm 2010 và tăng 6.5%

kể từ năm 2013

Trong số các nước xuất khẩu rượu brandy 15 quốc gia xuất khẩu brandylớn nhất trong năm 2014 là : Mexico: 1205268000 $ (29.9% tổng xuất khẩurượu brandy), Vương quốc Anh: 418.685.000 $ (10.4%), Trung Quốc:

353682000 $ (8.8%), Đức: 228327000 $ (5.7%), Pháp: 209825000 $ (5.2%),Hồng Kông: 174329000 $ (4,3%), Hoa Kỳ: 151682000 $ (3.8%), Hàn Quốc:

133749000 $ (3.3%), Italy: 128039000 $ (3.2%), Tây Ban Nha: 93882000 $(2.3%), Malaysia: 73300000 $ (1.8%), Hy Lạp: 69562000 $ (1.7%), Singapore:

1.1.4 Công nghệ sản xuất rượu brandy

1.1.4.1 Vi sinh vật trong lên men rượu

1.1.4.1.1 Nấm men

Trong các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men thì nấm men cóvai trò quan trọng trong việc chuyển hóa đường thành rượu và tạo hương vịcho rượu

Tế bào nấm men là tế bào nhân thực, cấu trúc cơ bản giống tế bào độngvật, thực vật Cấu trúc tế bào nấm men chia thành hai phần: phần thành tế bào

và phần nội bào

Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm Thành tế bào đa số tế bàonấm men cấu tạo bởi mannan và glucan, một số nấm men có thành chứamannan và kitin Trong thành tế bào nấm men có chứa 10% là protein, trong

số đó có một phần là các enzym Trên thành có một số lượng nhỏ lipit(Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002; Herman, 2001)

Màng tế bào của tế bào nấm men cấu tạo gồm 3 tầng, thành phần chủyếu là protein (chiếm 50% khối lượng khô), lipit (40%) và một ítpolysaccharide Phần steroid trong tế bào nấm men khi được chiếu tia tửngoại có thể chuyển hóa thành vitamin D2 Chính cấu tạo đặc trưng của thành

tế bào đã giúp cho tế bào nấm men sống được trong môi trường có hàm lượngcồn cao (18 - 20%) (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002; Khaing và cs, 2008)

Nấm men sinh trưởng nhanh, các tế bào thường tách rời nhau, đa sốchúng sinh sản bằng cách nảy chồi Chúng cũng sinh sản hữu tính bằngbào tử

Nấm men có khả năng sinh trưởng trong môi trường có hàm lượngđường tương đối cao (dưới 30% sinh trưởng tốt, ở nồng độ cao hơn vẫn có thể

sống nhưng sinh trưởng chậm) Chúng phát triển tốt nhất trong điều kiện nhiệt

Có rất nhiều chủng nấm men phù hợp với tiêu chuẩn sản xuất rượu,nhưng tùy thuộc vào điều kiện sản xuất và nguồn nguyên liệu mà người ta lựachọn các chủng khác nhau Một ví dụ điển hình của chủng nấm men đáp ứng

được các tiêu chí trên trong sản xuất rượu brandy là Candida tropicalis NM2.

Theo Jeyaram và cs (2008), C tropicalis được tìm thấy ở nước biển,

các loại tảo biển, thực vật rừng ngập mặn, mật ong, hoa quả, Đây là loài cókhả năng lên men tốt trong môi trường có các loại đường glucose, saccharose,maltose, galactose, trehalose, raffinose Chúng có khả năng đồng hóa nhiềuloại sản phẩm khác nhau: galactose, maltose, trehalose, succinate, D - xylose,arabinose, D - manitol, D - glucitol, cellobiose, citrate, glycerol, lactate,ribitol, … Chủng nấm men này có khả năng chịu nhiệt tốt, có thể sinh trưởng

ở nhiệt độ từ 40 – 42 °C C tropicalis lên men tốt trong khoảng pH rộng: 3.5

- 6.5 Chúng được sử dụng để sản xuất xylitol từ D - xylulose Hình thức sinhsản của chủng nấm men này chủ yếu là nảy chồi , bên cạnh đó có thể có nhiềusợi nấm giả gồm các tế bào dài dính với nhau bởi một điểm nhỏ và dễ rờinhau (Agarwal và cs, 2011; Horitsu và cs, 1992)

Cũng theo nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Hồng Duyên (2014) thì

C.tropicalis NM2 có hình ovan (hoặc hình trứng), kích thước trung bình: 1.5

-4 x -4 -7 µm Đặc biệt, bên cạnh những tế bào có hình thái điển hình còn cónhững tế bào dị hình - hình dạng dài, xuất hiện nhiều trong môi trường lênmen và ảnh hưởng tích cực đến khả năng lên men của chủng.Điều kiện tốtnhất cho C tropicalis NM2 lên men tạo rượu là: hàm lượng đường trong dịchlên men - 220g/l; hàm lượng men giống bổ sung vào dịch quả khoảng 0.5 x

106 tế bào/ml, nhiệt độ 30 °C, pH = 3.5

1.1.4.1.2 Một số vi sinh vật khác trong lên men rượu

Trong quá trình lên men rượu, ngoài nấm men còn có sự tham gia củanhiều nhóm vi sinh vật khác:

- Nấm mốc: có vai trò phân hủy hồ tinh bột thành đường Một số chủng

nấm mốc được sử dụng trong sản xuất như: Aspergillusoryzae, A.flavus, A.usami…

- Vi khuẩn: Trong quá trình lên men thường xuất hiện nhiều nhóm vikhuẩn, bao gồm cả những loài mong muốn và những loài không mong muốngây hỏng rượu Những loài vi khuẩn mong muốn là những loài tạo được cho

rượu hương vị đặc trưng, như loài Oencoccus oenos (vi khuẩn lactic) và nhiều các chủng thuộc giống Lactobacillus và giống Pediococcus Ngược lại có một

số vi khuẩn làm hỏng vang và làm cho vang có mùi khó chịu như một số loài

Lactobacillus (Hoàng Thị Lệ Thương, 2010).

1.1.4.2 Quá trình lên men rượu

Quá trình lên men rượu là quá trình chuyển hóa đường thành rượu, giảiphóng CO2 dưới tác dụng của các enzym do nấm men tạo ra, trong điều kiện

kị khí Quá trình này luôn kèm theo sự hình thành các sản phẩm phụ và giảiphóng năng lượng

Cho đến nay, các nhà khoa học đã thiết lập được sơ đồ cho toàn bộ quátrình lên men gồm 5 giai đoạn, có thể tóm tắt theo phương trình tổng quát :

C6H12O6 + 2 ADP + 2 H3PO4  2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP + H2O

Trong quá trình sản xuất rượu thường phải bổ sung saccharose vào dịchlên men do hàm lượng đường này trong dịch quả không nhiều Khi đó, việcchuyển hóa saccharose thành glucose và fructose là nhờ enzym invectase củanấm men tạo ra, quá trình lên men tạo rượu lại diễn ra bình thường.

Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra được hơn 50 loại enzym tham gia vàoquá trình chuyển hóa đường thành rượu vừa nêu trên (Nguyễn Thành Đạt, 2011).1.1.4.2.1 Cơ chế của quá trình lên men rượu

Trong quá trình lên men rượu, 1 phân tử glucose sẽ tạo thành 2 phân tửpyruvate Quá trình đó tạo ra ATP và NADH Hai phân tử pyruvate sau đó bịbiến đổi thành acetaldehyt và tạo hai CO2 Sau đó, nhờ H+ từ NADH,acetaldehyt chuyển thành etanol (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cơ chế quá trình lên men rượu

(nguồn: Pretorius, 2000)

1.1.4.2.2 Quá trình tạo sản phẩm trung gian

Quá trình lên men rượu là một quá trình phức tạp, gồm 1 chuỗi cácphản ứng chuyển hóa Do đó, tất yếu tạo ra các sản phẩm bậc 2 và các sảnphẩm phụ Các sản phẩm này đóng vai trò quan trọng đối với giá trị cảm quancủa sản phẩm

R Dupui đã nghiên cứu và chỉ ra rằng: Khi lên men 180 gam đường thìthu được 83.6g CO2 + 87.4g C2H5OH + 0.4g dầu fusel + 0.6g glyxerin + 0.3gaxit lactic + 0,1g axetaldehyde

Trên thực tế lượng ethanol tạo thành luôn thấp hơn tính toán lý thuyết(thường chỉ đạt 90 - 95%), khoảng 5% đường tiêu hao cho các sản phẩm phụ

và 1% đường được nấm men sử dụng cho quá trình sinh sản và phát triển

Trong quá trình lên men cũng tạo thành dầu fusel Đó là tập hợp một sốrượu bậc cao như: propylic, amylic, izobutylic,…Thành phần và số lượngrượu bậc cao phụ thuộc vào chủng nấm men và nguyên liệu, điều kiện lênmen Hàm lượng dầu fusel thường không đáng kể, nhưng lại có vai trò quantrọng trong việc tạo hương thơm đặc trưng cho sản phẩm

Hương và vị của rượu brandy phụ thuộc vào hàm lượng, thànhphần, tỉ lệ giữa các sản phẩm phụ chủ yếu là este thơm với rượu bậc cao

và tỉ lệ giữa sản phẩm phụ với rượu ethanol Tuy nhiên quá trình hìnhthành và thành phần các sản phẩm phụ lại phụ thuộc và các điều kiện lênmen như: hàm lượng đường, pH, nhiệt độ, nấm men,…Đây cũng là nhữngyếu tố giúp nhà sản xuất có thể định hướng việc tạo sản phẩm phụ làmtăng chất lượng của brandy

1.1.4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo rượu

* Ảnh hưởng của oxy

Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi Trong điều kiện có oxy, nấmmen sử dụng đường làm nguồn năng lượng tăng sinh khối Hàm lượng oxyphù hợp cho sinh trưởng và phát triển của nấm men là 6.5 – 7.5 mg/l Khi môitrường thiếu oxy thì nấm men lại tiến hành chuyển hóa đường thành rượu.

Vì vậy, trong quá trình lên men để đạt hiệu suất tạo rượu tối đa và hạnchế quá trình tạo sản phẩm phụ, người ta phải hạn chế tối đa sự có mặt củaoxy trong giai đoạn lên men

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển củanấm men và chất lượng rượu Nấm men có thể tồn tại ở nhiệt độ từ 4 -45°C nhưng nó sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở 28 - 30 °C (NguyễnQuang Thảo, 2002)

Nhiệt độ càng thấp thì nấm men sinh trưởng càng chậm, thời gian lênmen càng kéo dài, tuy nhiên lại hạn chế được sự nhiễm khuẩn Ngược lại,nhiệt độ càng cao thì nấm men sinh sản nhanh hơn, thời gian lên men ngắnhơn, nhưng khả năng nhiễm khuẩn sẽ rất cao

Bên cạnh đó, nhiệt độ còn ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng rượubrandy Theo những nghiên cứu của Peuch (1987) khi lên men ở điều kiệnnhiệt độ lạnh thì hương, vị của rượu sẽ có mùi vị của trái cây và tươi hơn,hàm lượng axit bay hơi cũng thấp hơn và hàm lượng glyxerol cũng sẽ tăngcao hơn Nhiều tác giả cho rằng: nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men tạorượu là 28 - 32 °C (Hoàng Văn Hải, 2006; Lương Đức Phẩm, 2009; Mateo và

động tốt ở pH trên 3.5 Vì vậy, để hạn chế quá trình tạp nhiễm và tạo điềukiện cho sự phát triển của nấm men, nâng cao chất lượng rượu, trong thực tếsản xuất người ta luôn duy trì pH ở mức 3.2 - 4 (Batten, 1989) Điều chỉnh

pH của dịch lên men, các nhà sản xuất thường sử dụng: axit citric, NaHCO3,CaCO3,…(Hoàng Liên Hương, 2005) pH thấp quá hoặc cao quá cũng sẽ ảnhhưởng đến đến cấu trúc protein của nhiều loại enzyme tham gia trực tiếp vàoquá trình lên men rượu và làm giảm khả năng xúc tác của enzyme

* Ảnh hưởng của hàm lượng đường

Đường là nguyên liệu của quá trình lên men Hàm lượng đường phùhợp cho quá trình lên men rượu là 16 - 22%, hàm lượng đường 28% ức chếquá trình lên men (Đặng Tất Thành, 2006) Điều này có ý nghĩa quan trọngtrong việc xác định nguyên liệu và bổ sung đường vào dịch lên men Bêncạnh đó, tỷ lệ các loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng tới tốc độ vàhiệu suất lên men Nấm men chủ yếu lên men đường đơn và các loại đườngkhử Theo kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đối với chủng nấm men

C.tropicalis thì đường glucose là loại đường phù hợp nhất cho sinh trưởng và

phát triển của nấm men, sau đó là fructose và saccharose,…(Đinh Thị HồngDuyên, 2014)

* Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Trong quá trình lên men, nồng độ cồn tăng dần sẽ ức chế hoạt độngsống của nấm men, kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzyme tham giachuyển hóa đường thành rượu Các loại nấm men khác nhau thì khả năng chịuđựng nồng độ rượu cũng khác nhau Khả năng sống sót của nấm men phụthuộc nhiều vào nhiệt độ và nồng độ rượu có trong dịch lên men Tuy nhiên,khả năng chịu đựng lượng ethanol của vi khuẩn, nấm mốc kém hơn nhiều sovới nấm men (Yansong và cs, 2001) Điều này có ý nghĩa quan trọng với quátrình sản xuất vì khi quá trình lên men kị khí bắt đầu xảy ra thì ethanol hình

thành sẽ kìm hãm sự phát triển của nấm mốc, vi khuẩn sau đó ức chế hoạtđộng của các loại nấm men dại, nhường môi trường cho nấm men hoạt động(Bùi Ái, 2002).

* Ảnh hưởng của hàm lượng men giống

Nấm men chính là đối tượng tiến hành quá trình lên men tạo rượu Hàmlượng tế bào nấm men trong dịch lên men có ảnh hưởng lớn tới quá trình lênmen tạo rượu và chất lượng sản phẩm rượu Nếu hàm lượng này thấp thì thờigian nhân giống và lên men sẽ bị kéo dài, dễ bị nhiễm khuẩn Ngược lại, hàmlượng men giống cao thì thời gian lên men ngắn hơn và ít bị nhiễm khuẩn do

sự áp đảo của nấm men Tuy nhiên, nếu hàm lượng men giống quá cao sẽ làmthay đổi môi trường lên men, không có lợi cho quá trình lên men và chấtlượng sản phẩm Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì hàm lượng men giốngtrong dịch lên men chỉ nên có từ 4 - 10 triệu tế bào/1 ml dịch lên men là phùhợp (Nguyễn Xuân Thành, 2006; Đặng Tất Thành, 2006)

* Ảnh hưởng của axit hữu cơ

Thành phần và hàm lượng của một số axit hữu cơ trong dịch lên menảnh hưởng tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm men và chất lượng sản phẩmrượu Axit hữu cơ làm giảm độ pH, có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn.Tuy nhiên, sự ảnh hưởng ở đây không phải do hàm lượng tổng số mà là dothành phần mà hàm lượng một số loại axit hữu cơ Axit béo, axetic, butyric,propionic đều có ảnh hưởng đáng kể tới quá trình lên men tạo rượu(Brockmann và cs, 1948)

* Ảnh hưởng của nitơ

Nitơ là một trong những nguyên tố đại lượng cấu tạo nên tế bào, cầnthiết cho hoạt động của tế bào Đối với tế bào nấm men cũng vậy, nitơ cầnthiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Từ các hợp chất chứanitơ, nấm men sẽ tổng hợp được axit amin và protein cần thiết cho mình

Đa số nước quả có hợp chất nitơ đủ để cung cấp cho hoạt động của nấmmen Tuy nhiên, trong một số trường hợp, hàm lượng axit amin chỉ đủcung cấp cho 4, 5 ngày lên men Do đó, khi nhân giống nấm men người tathường bổ sung thêm lysin, arginin, hoặc (NH4)2SO4 ở nồng độ 0.6% (tínhtheo nitơ) để tăng khả năng sinh sản của nấm men (Nguyễn Đình Thưởng

và cs, 2002)

* Ảnh hưởng của các chất khử trùng

Khả năng khử trùng của SO2 đã được biết đến từ lâu và hiện nay vẫnđược sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu SO2 có khả năng diệt trùng rất tốtđối với nhiều loại vi khuẩn nhưng nấm men lại có khả năng phát triển và lênmen trong môi trường có hàm lượng SO2 cao Tuy nhiên, hàm lượng SO2 lạilàm kéo dài thời gian lên men SO2 làm tăng lượng aldehyde và glyxerol trongquá trình lên men, vì vậy việc sử dụng trong quá trình sản xuất cũng cần sựtính toán phù hợp Thông thường, người ta sử dụng SO2 với hàm lượng 75 -

110 ppm làm chất diệt khuẩn Nồng độ SO2 tối đa cho phép trong dịch lênmen không vượt quá 490 ppm (Nguyễn Quang Hào, 2002; Nguyễn QuangThảo, 2002)

* Ảnh hưởng của các loại muối khoáng và vitamin

Muối khoáng và vitamin rất cần thiết cho hoạt động sống của nấm men.Việc bổ sung các loại muối khoáng vào dịch lên men là rất quan trọng, nguồnmuối khoáng cần thiết cho quá trình lên men bao gồm: Mg, K, I2, Ca, Fe, S, P.Tuy nhiên sự dư thừa các nguyên tố khoáng có thể kìm hãm quá trình lên menrượu Do vậy, việc bổ sung muối khoáng vào dịch lên men phải có sự tínhtoán, tùy thuộc vào từng loại nấm men và nguồn nguyên liệu (Nguyễn QuangHào, 2002)

Một số loại vitamin cũng có tác dụng tốt cho quá trình lên men Sự cómặt của một số axit amin và các vitamin còn có tác dụng tăng cường hoạt hóa

một số loại enzyme trong quá trình lên men rượu (Nguyễn Thành Đạt, 2011;Nguyễn Quang Hào, 2002).

1.1.4.3 Quy trình sản xuất rượu brandy

Rượu brandy đã được sản xuất từ lâu đời, quy trình sản xuất có một số

sự khác biệt giữa các vùng sản xuất và loại nguyên liệu Tuy nhiên, các quytrình sản xuất rượu brandy từ hoa quả (Đinh Thị Hồng Duyên, 2014; Akubor

và cs, 2003; Tsakiris và cs, 2013) đều theo một trình tự chung như sau:

1.1.4.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Rượu brandy hoa quả có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệukhác nhau: nho, dứa, cherry, chuối, táo,…Nguồn nguyên liệu có ảnh hưởnglớn đến chất lượng và hương vị rượu brandy

Nguyên liệu làm brandy thường có độ đường tương đối cao, dễ chếbiến, chứa ít hoặc không chứa các chất không mong muốn Quả được lựachọn, loại bỏ những quả sâu, dập nát, rửa sạch, để khô

1.1.4.3.2 Chế biến dịch lên men

Tùy thuộc vào loại quả mà có các phương pháp chế biến dịch lên menkhác nhau

Quả sau khi được lựa chọn sẽ có thể được bóc vỏ, loại bỏ hạt…Sau đó,tiếp tục ép hoặc xay lấy dịch và chế biến thành dịch lên men Có khi người ta

bổ sung thêm đường vào dịch cho đạt hàm lượng đường lên men tốt nhất, rồibảo quản lạnh trong thời gian ngắn hoặc trực tiếp lên men

Trong quá trình chế biến dịch lên men người ta thường bổ sung chấtchống nhiễm SO2 vào dịch lên men, hoặc điều chỉnh pH môi trường lên men.Người ta cũng có thể bổ sung thêm chất khoáng, đạm, hoặc enzyme phân giải(chủ yếu là phân giải pectin),…(Nguyễn Quang Thảo, 2002)

1.1.4.3.3 Lên men

Dịch quả sau khi được chế biến thành dịch lên men với các đặc tínhphù hợp về pH, độ đường…người ta tiến hành cấy giống nấm men sau đó tạođiều kiện yếm khí để nấm men tiến hành chuyển hóa đường thành rượu

Thời gian lên men, điều kiện lên men, lượng tiếp giống… của quá trìnhlên men tùy thuộc vào công nghệ lên men, thiết bị lên men và nguồn nguyênliệu lên men.

Quá trình lên men gồm hai giai đoạn: lên men chính và lên men phụ.Trong giai đoạn lên men chính, nấm men sẽ chuyển hóa hầu hết đường thànhrượu, giai đoạn này thường diễn ra ở nhiệt độ cao hơn Giai đoạn lên menphụ, nhiệt độ được hạ thấp hơn và quá trình lên men vẫn tiếp diễn, đồng thời

tế bào nấm men, một số chất lơ lửng… kết lắng nhanh xuống đáy, tạo khảnăng tách dịch dễ dàng, giúp nâng cao chất lượng, hương vị sản phẩm Hiệnnay đa phần các nhà máy sản xuất rượu cao độ chỉ lên men một giai đoạn: giaiđoạn lên men chính Sau đó, dịch lên men được đem đi xử lý, tách cặn và chovào nồi chưng cất để thu dịch cồn

1.1.4.3.4 Chưng cất

Sau khi quá trình lên men kết thúc, người ta thu dịch lên men để tiếnhành chưng cất rượu Mục đích của giai đoạn này là thu được lượng rượu vớinồng độ cao hơn và tách một số tạp chất không mong muốn Dịch chưng cấtcũng có thể bổ sung một số hóa chất như : NaOH, muối sunfit, KMnO4,… đểgiảm bớt một số chất không mong muốn (andehyde, axit,…) Tuy nhiên, cũng

có khi người ta cho toàn bộ sản phẩm sau lên men chuyển sang chưng cất

Tùy theo quy mô, kĩ thuật và thiết bị mà quá trình chưng cất rượu cóthể khác nhau Có thể tiến hành chưng cất thủ công hoặc dùng nhiều thiết bịchưng cất: chưng cất phân đoạn, chưng cất phân đoạn liên tục, chưng cất phânđoạn bán liên tục (Nguyễn Đình Thưởng và cộng sự, 2002)

Quá trình chưng cất thu hồi sản phẩm chịu tác động lớn của thiết bịchưng cất, nhiệt độ chưng cất và kĩ thuật thu hồi sản phẩm

1.1.4.3.5 Hoàn thiện sản phẩm và bảo quản

Sau khi chưng cất xong rượu có thể được sử dụng ngay Tuy nhiênthông thường người ta tiếp tục hoàn thiện sản phẩm để làm giảm một số chấtkhông mong muốn và tăng hương vị màu sắc cho sản phẩm rượu brandy

Các biện pháp thường sử dụng là: pha rượu, ủ rượu, bổ sung chất tạomàu, tạo hương, tàng trữ…

Rượu sản phẩm sau khi chưng cất và hoàn thiện sẽ được đóng thùng,đóng chai…thành rượu thương phẩm hoặc có thể bảo quản ở những điều kiệnthích hợp tùy địa phương (Trần Phi, 1995)

1.1.4.4 Tiêu chuẩn chất lượng rượu brandy

Mỗi dòng rượu brandy có đặc trưng riêng Sự khác biệt đó không chỉ

do nguyên liệu mà còn do nguồn nấm men và kĩ thuật sản xuất Hương vịrượu brandy là nhờ các thành phần như este, aldehyde,…với nồng độ nhấtđịnh còn sót lại sau quá trình chưng cất dịch quả lên men thu rượu

Mỗi quốc gia lại có những tiêu chuẩn riêng đối với rượu brandy Ở ViệtNam, tiều chuẩn rượu brandy được BYT quy định tại QCVN 06- 3:2010/BYTđối với các sản phẩm đồ uống có cồn (Phụ lục)

Tiêu chuẩn này có sự sai khác với một số nước Tuy nhiên, brandy làmột sản phẩm đồ uống lên men tự nhiên nên tiêu chuẩn về hàm lượng một sốchất trong rượu không quá khắt khe (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chất lượng rượu brandy, theo tiêu chuẩn

chất lượng Brandy 366 (1987 - 07) của Ecuador

(được dịch từ tiêu chuẩn của Tây Ban Nha) (Đinh Thị Hồng Duyên, 2014)

Nâng cao chất lượng rượu brandy chính là quá trình hoàn thiện sảnphẩm sau chưng cất để tạo được loại rượu có chất lượng và giá trị cao hơn.Mục đích của quá trình này là làm giảm một số chất không mong muốn ảnhhưởng không tốt tới chất lượng sản phẩm như: làm giảm lượng aldehyde,methanol, một số axit hữu cơ gây chua, loại bỏ thành phần furfurol ra khỏirượu,… tăng các giá trị về thẩm mỹ, hương vị.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng: các chất có trong rượu sau quá trìnhchưng cất phụ thuộc nhiều vào chủng nấm men, quá trình lên men và quátrình chưng cất

James và cs (1959) đã nghiên cứu quá trình lên men chưng cất rượubrandy với mười bốn chủng nấm men khác nhau và khẳng định: hoạt độngcủa một số chủng nấm men làm giảm lượng aldehyde trong rượu Một sốnghiên cứu khác thì cho thấy ảnh hưởng của quá trình lên men đến hàm lượngmethanol trong rượu (nấm men, pH, thời gian lên men,…) và chỉ ra phươngpháp chưng cất phân đoạn giúp giảm đáng kể lượng methanol và một số chấtkhông mong muốn trong rượu (Nikícevíc và cs, 2005)

Ngoài ra, quá trình chưng cất cũng ảnh hưởng đến thành phần các chấttrong rượu brandy Hầu hết các hợp chất dễ bay hơi như andehyt, este, rượubậc cao,… có hàm lượng giảm dần trong quá trình chưng cất Tuy nhiên, hàmlượng furfurol lại tăng dần vào giai đoạn cuối của quá trình chưng cất(Guymon, 1974; Yuping Zhao và cs, 2014) Đây cũng chính là cơ sở cho quátrình nghiên cứu và sản xuất, để xác định thời điểm thích hợp để thu hồi rượuthành phẩm có hàm lượng các chất không mong muốn thấp nhất, nhưng vẫngiữ được hương vị đặc trưng của rượu brandy

Người ta còn có thể bổ sung một số chất như: kiềm, muối sunfit,KMnO4,… để làm giảm một số chất không mong muốn trong rượu nhưaldehyde, axit,…trong rượu

Tolbert và cs (1943) đã nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đếnmột số chất trong rượu brandy và đưa ra kết luận: ở nồng độ 0.5g/100ml rượu50% (v/v), than hoạt tính làm giảm axit, furfurol và tanin trong rượu Ở nồng

độ cao hơn, nó có tác dụng giảm acetaldehyde và rượu bậc cao trong brandy

Bên cạnh đó, để hoàn thiện sản phẩm rượu brandy người ta còn tiếnhành pha chế và lưu trữ trong thùng gỗ sồi một thời gian nhất định Việc lưutrữ rượu trong thùng gỗ sồi không chỉ làm tăng hương vị và ổn định rượu màcòn tạo cho brandy có màu hổ phách đặc trưng, góp phần tăng giá trị cảmquan của rượu

1.2 Bần chua

Loài bần chua hay một số nơi còn gọi là bần sẻ, thủy liễu, bằng lăng tía,

lậu…Có tên gọi khoa học là Sonneratia caseolaris (L.) Engl; tên tiếng

Anh: Apple Mangrove, Crabapple Mangrove Ngoài ra loài này còn có 1 số tên đồng nghĩa như: Sonneratia rubra Oken, Sonneratia acida L.F, Rhizophora

1.2.1 Đặc điểm sinh thái, cấu tạo

Bần chua là loài cây ưa sáng và mọc ở nơi có nước mặn hay nước lợ,chúng được coi là loài tiên phong để phát triển rừng ngập mặn ven biển bờcác bãi bồi ven sông Loài cây này được đánh giá là có khả năng sinh trưởng

ở vùng có lượng mưa hàng năm tương đối cao, nhiệt độ trung bình từ 20 –

27oC, pH từ 6.0 - 6.5

Cây bần chua được mô tả đặc điểm hình thái bởi nhiều tác giả: Toble

và cs, 1923; Grant, 1938; Walsh,1967 (dẫn theo Saberi, 1992); Selvam, 2007;Giesen và đồng sự, 2007 (dẫn theo Baba và cs, 2013) Các tác giả đều thốngnhất mô tả cây bần chua là loài cây gỗ rừng ngập mặn cỡ trung bình, cao từ

10 - 20m, có khi cao đến 25m Cây phân nhiều cành, tán rộng, rễ hô hấp hìnhchông Lá đơn, mọc đối, hoa lưỡng tính, màu lục ở ngoài, màu tím hồng ởmặt trong Quả mọng nhiều nạc, hình cầu dẹt, vỏ nhẵn, đài đồng trưởng, chiathuỳ trải dài trên gốc quả Quả có hình tròn ở phần đầu, vỏ quả dày, chứanhiều hạt Khi còn non quả cứng và có vị chát, khi chín quả mọng, thịt quảmềm, có vị chua và mùi thơm đặc trưng (Baba và cs, 2013)

Khi chín quả rụng và trôi nổi theo nước thủy triều, hạt sống lâu và pháttán mạnh trên các bãi bồi Muốn trồng cây bần không cần gieo hạt (mặc dùhạt quả bần chín khi gieo có thể mọc mầm trên 90%) Chỉ cần nhổ những câybần con mọc sắn trong tự nhiên (rất nhiều) để trồng (Phan Nguyên Hồng vàcộng sự, 1995; Kathiresan, 2001)

Quả bần xanh cứng, chứa hàm lượng tanin lớn nên có vị chát mạnh.Khi chín quả mềm ra, có mùi thơm, vị chát giảm, các axit hữu cơ hìnhthành nhiều, hàm lượng pectin 11% ở dạng trong suốt (Đinh Thị HồngDuyên, 2014)

1.2.2 Phân bố

Bần chua là loài cây rừng ngập mặn nhiệt đới, phân bố khá phổ biến vàrộng rãi tại các bãi bồi cửa sông và là loài tiên phong.Trong số 30 nước córừng ngập mặn trên thế giới thì bần chua phân bố ở 14 nước (UNI -UNESCO, 2002) Người ta tìm thấy loài này ở các nước và khu vực : BanglaĐét, Brunây, Campuchia, Trung Quốc (đảo Hải Nam), Ấn Độ, Indonexia,

Malayxia, Myanma, Philippin, Singapo, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam,Đông Bắc Australia, Vanuatu và Maldives

Việt Nam có bờ biển trải dài, nằm trong vùng nhiệt đới của nửa bán cầuBắc Cây bần chua mọc hoang và được trồng ở rừng ngập mặn ven biển từBắc vào Nam nơi có nhiều bùn và bãi bồi Ở miền Bắc cây mọc thành rừnggần như thuần loài ven biển và vùng cửa sông như ở Hải Phòng, Thái Bình,Nghệ An, Hà Tĩnh…Ở miền Nam cây bần chua là thành phần chính của rừngngập mặn tự nhiên ven biển và chúng mọc dày đặc ven sông rạch ở đồng bằngsông Cửu Long

1.2.3 Một số thành phần cơ bản trong quả bần chua

Nguyên liệu là yếu tố quan trọng quyết định đến chất lượng rượubrandy Thành phần cơ bản của quả bần chua đã được nhiều tác giả nghiêncứu Trong đó phải kể đến Đinh Thị Hồng Duyên, người đã xác định thànhphần hóa học cơ bản của quả bần chua với mục đích sản xuất rượu brandyquy mô phòng thí nghiệm Kết quả thu được hàm lượng các chất trong 100gquả tươi như sau: Carbohydrat - 27.2g; đường tổng - 4,86g; đường khử -4.38g, tanin - 7.2%, pH = 3.9 Ngoài ra, tác giả cũng xác định hàm lượng dầubéo trong hạt quả bần là 7.8%, trong thịt quả bần là 3.3% (Đinh Thị HồngDuyên, 2014)

Với những kết quả phân tích được, tác giả đã đưa ra kết luận: quả bầnchua làm nguyên liệu sản xuất rượu brandy là hoàn toàn phù hợp

1.2.4 Tình hình trồng và khai thác bần chua

Trong dân gian, cây bần chua được người dân sử dụng để tăng thêmhương vị cho các món ăn và cũng là bài thuốc dân gian chữa một số bệnhnhư: cầm máu, chữa viêm tấy, giải nhiệt Trên thế giới, người ta sử dụng bần

chua làm chất chống oxy hóa và các tế bào độc hại Ở Ấn Độ, người ta dùngdịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết, dùng lá giã ra,thêm tí muối, làm thuốc đắp lên các vết thương va chạm và vết thương nhẹ(Perry và cs, 1980).Ở Malaixia, người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc chữa bítiện, dùng bần chín để trị các kí sinh trùng trong ruột (giun, sán); ăn bần chín

để trị ho và dùng lá bần non nghiền nát để trị các bệnh thiếu máu, giảm tiểucầu và bệnh đậu mùa variole

Trong cuốn “Useful products from mangrove and other coastal plants”Baba và cs (2013) có mô tả: Ở bở biển phía Nam và Tây Nam Sri Lanka,người dân địa phương đã tiêu thụ nước ép trái bần chua (tên địa phương làkirala) Tại Indonexia, trái bần chua được sử dụng để làm siro pedada màunâu, được đóng chai, bán ra thị trường Tại Maldiver, nước ép trái bần chuađược tiêu thụ như một thức uống truyền thống

Ở Việt Nam, người dân thường sử dụng trái bần chua trong các món ănnhư gỏi, canh chua và một số món ăn khác do trái bần có vị chua và chát nhẹvới hương thơm đặc biệt Tại tỉnh Bến Tre, nơi có diện tích bần chua rất lớn,

có gia đình đã phát triển nghề chế biến các sản phẩm từ thứ quả này : bột bầnchua, kẹo bần, mứt bần…nhưng mới dừng lại ở quy mô hộ gia đình nhỏ lẻ

Trong những năm qua, diện tích rừng ngập mặn nói chung và rừng bầnchua nói riêng đang được phục hồi và phát triển Nhờ sự giúp đỡ của Trungtâm Nghiên cứu Hệ sinh thái Rừng ngập mặn - MERD đã trực tiếp phối hợp

để trồng và phục hồi một diện tích rừng ngập mặn lớn từ Bắc vào Nam ViệtNam Từ năm 1995 -2007, trên diện tích rừng ngập mặn ven biển tỉnh TháiBình, dự án đã tiến hành mở rộng 468 ha rừng, trong đó bần chua là loài được

đầu tư với diện tích trồng lớn nhất (Phan Nguyên Hồng và cộng sự, 1995;Phan Nguyên Hồng, 1999).

1.3 Sản xuất rượu brandy từ quả bần chua

Quả bần chu có hương vị đậm đà đặc trưng, pH của dịch quả thấp,thành phần hóa học trong dịch quả thích hợp cho nấm men phát triển (ĐinhThị Hồng Duyên, 2014) Do đó, có thể sử dụng nó làm nguyên liệu sản xuấtrượu brandy Tuy nhiên, quả bần chua chỉ được người dân địa phương sửdụng bần chua để làm một số sản phẩm như nước uống, bột bần, mứt bần…Hiện nay, chưa có cơ sở sản xuất nào khai thác giá trị sản xuất rượu brandycủa quả bần chua

Năm 2014, Đinh Thị Hồng Duyên đã tiến hành nghiên cứu sản xuấtbrandy bần chua với quy mô phòng thí nghiệm và tuyển chọn chủng nấm menphù hợp với lên men quả bần chua Kết quả nghiên cứu đã thu được rượubrandy bần chua có hương vị đặc trưng và đạt chỉ tiêu lý hóa, cảm quan phù

hợp với quy chuẩn kĩ thuật quốc gia (Đinh Thị Hồng Duyên, 2014)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời điểm và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu này được tiến hành từ tháng 4/2014 -10/2015, tại Bộmôn Công nghệ sinh học - Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sưphạm Hà Nội

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Quả bần chua (nguồn từ rừng ngập mặn huyện Tiên Lãng, tỉnh HảiPhòng) dùng để chiết dịch quả lên men, đường saccharose để bổ sung vào

dịch lên men và chủng nấm men Candida tropicalis NM2 được phân lập và

lưu trữtại Bộ môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đạihọc Sư phạm Hà Nội

2.3 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng bao gồm: glucose, saccharose, pepton, K2HPO4,MgSO4.7H2O… đều ở trạng thái tinh khiết và một số loại hóa chất khác:NaOH, H2SO4, NaHSO3, NaHCO3, Na2SO5, HCl, dung dịch iot, dung dịch tinhbột, axit salicylic, axit oxalic, phenolphalein, furfurol, acetinitri,…

2.4 Thiết bị

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng một số thiết bị như: tủ

ấm, tủ sấy (Binder, Đức); nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật); máy so màu(UV- vis, Nhật); máy đo pH (MP200R, Thụy Sĩ); cân phân tích (Pracisa XT

320M, Thụy Sĩ), máy sắc kí lỏng và các dụng cụ thông dụng khác của phòngCNSH - Vi sinh, khoa sinh học, Đại học Sư Phạm Hà Nội.

Ngoài ra chúng tôi còn sư dụng dụng cụ giấm chín quả, thùng lên men,nồi chưng cất rượu

2.5 Môi trường

Môi trường dùng để giữ giống nấm men là Hansen đặc với hàmlượng các chất (g/l): glucose: 50; KH2PO4: 3; MgSO4.7H2O: 2; pepton: 10;agar: 20; pH = 5

Môi trường nuôi cấy nấm men là môi trường Hansen lỏng (không cóagar)

Môi trường nhân giống: Dịch quả bần chua (90%V); đường tổng số :220g/l; pH = 3.6; SO2: 30mg/l và 50mg/l

Môi trường lên men: Dịch quả bần chua (90%V); đường tổng: 220g/l;

pH = 3.6; SO2: 50mg/l

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Phương pháp vi sinh

2.6.1.1 Phương pháp cấy chuyền và bảo quản giống

Giống nấm men được bảo quản trong môi trường thạch ở điều kiện lạnhcần thường xuyên cấy chuyền tránh hiện tượng thoái hóa giống

Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối nấm men, cấy chuyền sangmôi trường thạch trong đĩa Petri hoặc ống nghiệm Giống nấm men sau khicấy chuyền được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C trong thời gian 1 tháng thìđược cấy chuyền lại

2.6.1.2 Phương pháp hoạt hóa tế bào nấm

Các chủng nấm men được bảo quản trong các ống thạch nghiêng cómôi trường Hansen đặc để tránh nhiễm khuẩn và ở trạng thái nghỉ, khi dùngphải hoạt hóa.

Phương pháp hoạt hóa: Lấy một vòng que cấy giống bảo quản, cấychuyền sang bình tam giác có 100ml môi trường nhân giống lỏng, nuôi trênmáy lắc ở 28 °C trong 24 giờ

2.6.1.3 Phương pháp nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3

Nhân giống cấp 1: Môi trường sử dụng là môi trường Hansen lỏng,hàm lượng đường là 150g/l, pH = 5, được hấp thanh trùng để nguội Sau đócấy giống nấm men vào nuôi trong tủ lắc 24 giờ ở 30 0C thu được giống cấp1

Nhân giống cấp 2: Dịch quả có hàm lượng đường là 220g/l, pH = 3.63được khử trùng bằng SO2 với nồng độ 30mg/l, bổ sung 10% (v/v) giống cấp

1, nuôi trong tủ lắc ở nhiệt độ 30 0C Sau 24 giờ thu được giống cấp 2

Nhân giống cấp 3: Cũng dịch quả trên khử trùng bằng SO2 với nồng độ50mg/l, được bổ sung 10% (v/v) giống cấp 2 đem nuôi trong tủ lắc ở 30 0Csau 24 giờ ta thu được giống cấp 3

Sau khi nhân giống xong, tiến hành bổ sung giống vào dịch quả và tiếnhành lên men

2.6.2 Phương pháp hóa lý

2.6.2.1 Phương pháp xác định trị số pH

Trị số pH của dịch nuôi cấy và dịch lên men được xác định bằng máy

đo pH Toledo có kí hiệu là MP 220

2.6.2.2 Phương pháp xác định đường tổng (Lê Thanh Mai và cs, 2006)

Xác định đường tổng trong dịch lên men được đo bằng máy chiếtquang kế cầm tay

Nguyên tắc: Dựa vào chỉ số đo được trên chiết quang kế để biết tỷ lệphần trăm chất khô hòa tan trong dung dịch.

Cách tiến hành đơn giản: Nhỏ một giọt dịch lên mặt kính của chiếtquang kế rồi đậy nắp lại, quan sát kết quả hiển thị trên thị trường kính

Tra phụ lục: Bảng chuyển đổi nồng độ chất khô % thành nồng độđường trong dịch nho ép để chuyển đổi °Bx thành nồng độ đường tương ứngtrong dịch quả, tính theo g/l

Kết quả: Hàm lượng chất hòa tan sẽ bằng chỉ số tương ứng trên giảiphân cách, đơn vị đo là °Bx hoặc %

Trong trường hợp nhiệt độ dịch khác 20 °C thì phải dùng phụ lục đểchuyển đổi °Bx đo được về nhiệt độ chuẩn 20 °C rồi mới tra phụ lục

2.6.2.3 Phương pháp xác định độ rượu

Chưng cất một lượng dịch lên men (V1 ml) thu được V2 ml rượu Dùngcồn kế đo độ rượu tạo ra trong V2 thu được giá trị a Từ đó tính được độ rượu

b theo tỉ lệ % (v/v) theo công thức:b = (a x V2):V1

2.6.2.4 Phương pháp xác định axit và este trong rượu (Lê Thanh Mai và cs, 2006)

* Nguyên tắc: Trong rượu chứa rất nhiều loại axit khác nhau, đều tạo

thành trong quá trình lên men, nhưng chủ yếu là axit axetic Vì thế người

ta thường biểu diễn độ axit trong rượu theo axit axetic và tính theo mgtrong 1 lít rượu khan (rượu không chứa nước) Sau khi xác định axit xong,

ta tiếp tục xác định este trên cơ sở:

CH3COOC2H5 + NaOH  CH3COONa + C2H5OH

Xác định lượng NaOH tác dụng với este, ta suy ra lượng este trong rượu

* Dụng cụ: Ống sinh hàn, ống đong, bình tam giác, pipet, buret.

* Hóa chất: NaOH 0,1N, Phenolphalein 0,5%, H2SO4

* Tiến hành: Pha loãng rượu tới 50%, dùng ống hút 100ml vào bình

tam giác 250ml Nối bình với hệ thống làm lạnh ngược, đun sôi 15 phút đểđuổi hết CO2 rồi sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng, cho vào 3 – 4 giọt

phenolphalein rồi dùng NaOH 0,1N chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màuhồng nhạt

X =

V x 6 x 10x100C

Trong đó:

V - lượng natri hidroxit 0,1 N đã tiêu tốn, tính bằng ml;

6 - số mg axit axetic ứng với 1 ml NaOH có nồng độ 0,1 N;

10 - hệ số chuyển thành 1 lít;

100 - hệ số chuyển thành rượu 100% ;

C - hàm lượng rượu trong dịch đem phân tích

Sau khi chuẩn hàm lượng axit ta thêm vào hỗn hợp 5ml NaOH 0,1N rồinối bình với hệ thống làm lạnh ngược và đun sôi trong vòng 1 giờ để tạo điềukiện phản ứng:

CH3COOC2H5 + NaOH  CH3COONa + C2H5OH

Đun xong, đem làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi dùng 5ml H2SO4

0,1N vào bình, sau đó chuẩn lại H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N tớixuất hiện màu hồng nhạt

Hàm lượng este trong rượu được tính như sau:

E =

V x 8.8 x 10 x 100

CTrong đó:

V- lượng NaOH 0,1N tiêu hao khi chuẩn độ lượng H2SO4 dư

8.8 - số mg este etylic ứng với 1 ml NaOH có nồng độ 0,1N

2.6.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng furfurol (Yuan và cs, 1998).

Hàm lượng furfurol trong các mẫu được xác định bằng phương phápsắc kí lỏng (HPLC)

Bước 1: Xây dựng đường chuẩn

Chuẩn bị: Pha động là dung dịch acetonitril 1% Dung dịch chuẩn:furfurol được pha với các nồng độ 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 (mg/l)

Bơm 20µl vào thiết bị HPLC, cột sử dụng là Hypersil DPSC18

Dựa vào diện tích của đỉnh (Bảng 2.1) ta xây dựng được đồ thị chuẩnnồng độ của furfurol (Hình 2.1)

Bảng 2.1 Giá trị diện tích đỉnh của các dung dịch chuẩn furfurol

Hàm lượng furfurol

Dựng đồ thị đường chuẩn nhờ chương trình Microsoft Excel

Hình 2.1 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng furfurol

Bước 2: Tính hàm lượng furfurol trong mỗi mẫu rượu

Bơm 20µl mẫu rượu cần xác định hàm lượng furfurol vào cột chạy mẫucủa thiết bị HPLC sau đó xác định giá trị diện tích đỉnh

Thay giá trị diện tích đỉnh vào phương trình đồ thị chuẩn: y = 64742x +

230394 ta tìm được hàm lượng furfurol (x) trong mẫu rượu cần xác đinh

Nhân giá trị x vừa tìm được với độ pha loãng ta xác định được hàmlượng furfurol trong mẫu rượu ở nồng độ 100% (v/v)

2.6.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde

Hàm lượng aldehyde được phân tích tại Trung tâm Kĩ thuật tiêu chuẩn

đo lường chất lượng 1 và định lượng theo phương pháp TCVN 8009 - 2009

Tiến hành:

Dùng pipet lấy 50 ml phần mẫu thử (có chứa hàm lượng aldehyt nhỏhơn hoặc bằng 30 mg), được quy định về nồng độ 100° hoặc 25 ml sản phẩm

có nồng độ rượu cao và 25 ml nước cho vào bình cầu 750 ml hoặc 1000 ml

có chứa 300 ml nước sôi hoặc nước đã loại khí và 10 ml dung dịch K2S2O5.Đậy nắp bình, xoay bình để trộn và để yên 15 phút

Thêm 10 ml dung dịch phosphat-EDTA (pH phải trong khoảng từ 7.0đến 7.2 Nếu không, chỉnh pH bằng cách thêm axit clohydric hoặc dung dịchnatri hydroxit vào dung dịch K2S2O5 và bắt đầu với phần mẫu thử mới) Đậynắp bình, xoay bình để trộn và để yên thêm 15 phút

Thêm 10 ml axit clohydric (khi cần phân tích một dãy thì kết thúc phépxác định trên phần mẫu thử thứ nhất trước khi bổ sung tiếp axit) và khoảng10ml tinh bột 0.2% mới chuẩn bị

Xoay bình để trộn đều Thêm lượng dung dịch iot 0.1 M chỉ vừa đủ đểphá hủy lượng bisulfit dư và đưa dung dịch đến màu xanh nhạt

Thêm 10 ml dung dịch natri borat và chuẩn độ nhanh lượng bisulfitgiải phóng bằng dung dịch iot 0.05M từ buret 10 ml (hoặc dung dịch iot0.02M) đến điểm kết thúc có màu xanh nhạt như trên, xoay nhẹ bình trong khichuẩn độ, tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời

Cách tính:

Hàm lượng aldehyde, X, tính bằng miligam axetaldehyde (CH3CHO)/lethanol 100° theo công thức sau đây:

c V

V C

44 là khối lượng mol của CH3CHO, tính bằng gam trên mol;

C1 là nồng độ mol của dung dịch iôt, tính bằng mol trên lít;

V1 là thể tích dung dịch iôt chuẩn độ, tính bằng mililit;