Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại viện khoa học hình sự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài : KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN Học viên: Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Hà HÀ NỘI - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN – PGS – – nghiên cứu Viện Khoa học hình sự, Lãnh đạo Tôi xin ch Trung Tâm toàn thể – – 11 năm 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ M CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Một số vấn đề giám định gen ti thể .6 1.2 Khái niệm giám định gen ti thể 1.3 Cơ sở khoa học thực tiễn 1.3.1 Ti thể hệ gen ti thể .7 1.3.2 Cơ sở khoa học giám định gen ti thể .10 1.4 Dị chất (heteroplasmy) ti thể .15 1.5 Vùng thị ADN ti thể (vùng có tính đa hình cao) phương pháp giám định ADN ti thể 15 Tình hình nghiên cứu nước lĩnh vực liên quan đến đề tài 17 2.1 Tình hình nghiên cứu nước 17 2.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 NG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 22 1.1 Thiết bị 22 1.1.1 Th 22 23 1.2 Hóa chất 23 Phương pháp nghiên cứu 23 2.1 Phương pháp làm mẫu 24 2.2 Phương pháp nghiền mẫu 24 2.3 Phương pháp tách chiết ADN ti thể 24 2.4 Phương pháp tinh ADN ti thể .25 2.5 Phương pháp định lượng ADN ti thể 25 2.6 Phương pháp PCR 25 2.7 Phương pháp tinh sản phẩm PCR, gắn BigDye 26 2.8 Phương pháp chạy điện di, giải trình tự ADN ti thể 26 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.9 Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu xương người 26 2.9.1 Tối ưu hóa nồng độ chelex 100TM 26 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 28 Kết nghiên cứu 28 1.1 Kết tách chiết ADN ti thể .28 đến năm): 28 từ đến 10 năm): 29 1.2 Kết tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu xương người 30 1.2.1 Kết tối ưu hóa nồng độ Chelex 100TM 30 31 .32 1.3.1 Làm mẫu xương 32 1.3.2 Nghiền mẫu xương 32 1.3.3 Tách chiết ADN ti thể từ xương chelex 100™ 33 1.3.4 Tách chiết ADN ti thể từ xương tách hữu 33 1.3.5 Tách chiết ADN ti thể từ xương Kit Prepfiler 34 1.3.6 Tinh ADN sử dụng kit DNA IQTM System 36 1.3.7 Định lượng ADN sử dụng kit Human DNA Quantification 36 1.3.8 Chuẩn bị chạy phản ứng Nested PCR nhân bội sản phẩm ADN .37 1.3.9 Phản ứng Sequencing (gắn Big Dye) .38 1.3.10 Chuẩn bị mẫu cho điện di giải trình tự .38 1.3.11 Giải trình tự máy ABI 310 39 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận: 43 Kiến nghị: 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 47 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - ADN : Axit deoxyribonucleic - ARN : Axit ribonucleic - CSĐT : Cảnh sát điều tra - DTT : Dithiothreitol (tên hoá chất) - KHHS : Khoa học hình - PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng nhân bội gen) - PrK : Proteinaza K - STR : Short tandem repeat (đoạn lặp lại ngắn) - TS : Tiến sĩ - VNTR : Variable number of tenderm repeat (đoạn lặp có độ dài trung bình) -X -R : xương : Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Số hiệu bảng Tên Bảng 1.1 3.1 Trang 12 Kết định lượng phương pháp tách chiết 28 mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm) 3.2 Kết định lượng phương pháp tách chiết 30 mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 5-10 năm) 3.3 Kết định lượng tối ưu hoá nồng độ chelex 31 mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm) 3.4 Kết định lượng tối ưu hoá thể tích d/d hạt từ đối 32 với mẫu răng, xương(thời gian chôn cất từ 5-10 năm) HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Ti thể tế bào người 1.2 Cấu trúc hệ gen ti thể người 11 1.3 Phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ti thể 14 inheritance (maternal) Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA : Giám định gen 90 20 không khắc phục hạn chế phương pháp huyết học trước mà giải vụ án bế tắc trước đó, vụ án mà ADN chứng Tính ưu việt giám định gen truy nguyên cá thể người, xác định huyết thống cha-con, xác định hài cốt… giám định gen tách chiết ADN nhân máu, lông, tóc, tế bào niêm mạc miệng Tuy nhiên, công tác giám định kỹ thuật hình nói chung đặc biệt giám định ADN hình nói riêng, đối tượng giám định thường mẫu vật nhiều biến tính không nguyên vẹn nhiều mảnh xương gẫy vỡ lẫn môi trường tự nhiên thời gian dài, với mẫu vật ADN nhân tế bào không tồn tại, để giải yêu cầu điều tra đặt xác định tung tích nạn nhân, đòi hỏi phải tiến hành giám định ADN ti thể Năm 2003 Viện Khoa học hình (KHHS) viện trợ máy giải trình tự nhằm nâng cao lực giám định ADN Viện, chuyển giao công nghệ chuyên gia có giới thiệu phương pháp giám định ADN ti thể với số hóa chất thiết bị phụ trợ họ sản xuất, sau tiếp cận với phương pháp giám định ADN ti thể chưa trang bị hoàn chỉnh, thiếu qui trình chuẩn trước đòi hỏi ngày cấp thiết công tác điều tra phá án, phòng giám định gen Viện KHHS vừa làm, vừa học thực thành công số vụ giám định ADN ti thể kết nhiều không ổn định chưa có qui trình phù hợp từ khâu Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA xử lý mẫu đến tách chiết, tinh ADN ti thể Tham khảo số phương pháp tách chiết ADN ti thể nước nhận thấy có phương pháp tách chiết tận thu ADN ti thể, bảo đảm chất lượng cho phản ứng nhân gen (PCR) giải trình tự, xong không phù hợp với điều kiện chất lượng mẫu vật gửi giám định ADN ti thể nước ta thời gian tính, giá thành C , phương pháp tách chiết ADN ti thể thực Viện KHHS - Bộ không cho kết ổn định phương pháp Công an ứng dụng tự phát mang tính chất thăm dò , chưa đồng có tính rủi ro cao, chưa trở thành quy trình chuẩn để áp dụng rộng rãi, yêu cầu giám định ADN ti thể từ mẫu xương người nhằm giải vụ án ngày cao[16] Theo thống kê phòng thí nghiệm giám định gen Viện KHHS cho thấy năm 2004 có yêu cầu, năm 2005 có yêu cầu, năm 2006 có 12 yêu cầu, năm 2007 có 14 yêu cầu 17 yêu cầu 20 yêu cầu năm 2012 22 yêu cầu với số lượng ngày nhiều 10 năm , : “Tối ƣu hoá phƣơng pháp tách chiết ADN phục vụ công tác từ răng, xƣơng ngƣời – ” : Đề tài hoàn thành đưa phương pháp tách chiết ADN ti thể hoàn chỉnh từ mẫu xương người , tối ưu t phù hợp với điều kiện phßng thÝ nghiÖm hiÖn cã t¹i ViÖn KHHS Góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể từ mẫu xương, người quy trình chuẩn áp dụng để giám định ADN ti thể phục vụ giải vụ án hình Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA yêu cầu dân hoàn thiện hoá tính pháp lý quy trình giám định ADN hình Hoàn thiện sở lý luận giám định ADN nói chung ADN ti thể nói riêng phục vụ cho công tác thực tiễn nghiên cứu giảng dạy Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu thực nghiệm phương pháp tách chiết ADN ti thể khác mẫu răng, xương thu từ 02 hài cốt người 1-5 năm từ 5-10 năm - ADN tổng số bao gồm ADN nhân ADN ti thể, khuôn khổ hạn hẹp đề tài, đặt mục tiêu tập trung tối ưu hoá phương pháp tách chiết ADN ti thể, để thu lượng ADN ti thể có chất lượng cao nhất, thu từ 02 hài cốt người 1-5 năm từ 5-10 năm, với tổng số 12 mẫu nghiên cứu bột xương phục vụ cho trình thực nghiệm - Quá trình nghiên cứu tiến hành phòng thí nghiệm Viện KHHS Nội dung nghiên cứu Tham khảo tài liệu, dựa nguyên lý tách chiết ADN; nghiên cứu phương pháp tách chiết sử dụng đề xuất phương pháp tách chiết có tính ưu việt khác để tiến hành thử nghiệm 12 mẫu xương hài cốt gửi giám định Sử dụng phương pháp: + Phương pháp 1: sử dụng chelex 100™ nồng độ khác (5%, 10% 20%) + Phương pháp 2: sử dụng hỗn hợp Phenol-clofom-izoaminalcohol theo tỉ lệ 25:24:1 + Phương pháp 3: sử dụng kit tách chiết Prepfiler (ABI System - Mỹ) với tỉ lệ Nguyễn Xuân Quyền 10µl, 15µl 20µl Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA Bảng 3: Kết định lượng ADN ti thể từ mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 5-10 năm) tách chiết Chelex 20%, 10% 5% 49 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA Bảng 4: Kết định lượng ADN ti thể từ mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 5-10 năm) tách chiết kit Prepfiler với thể tích magnetic 10 µl, 15 µl 20 µl 50 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA /xương (thời gian chôn c 51 - 5% Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA 2: - 52 10% Tối ưu hoá phươ 3: từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA /xương (thời gian c 53 20% Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA hợp phenol-clorofom-izoaminalcohol theo tỉ lệ 24:25:1 54 quy trình hữu sử dụng hỗn Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA với dung dịch hạt từ margetic 10µl 55 sử dụng Kit Prepfiler Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA /xương với dung dịch hạt từ margetic 15µl 56 sử dụng Kit Prepfiler Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA /xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm) với hạt từ margetic 20µl 57 sử dụng Kit Prepfiler Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA hợp phenol-clorofom-izoaminalcohol theo tỉ lệ 24:25:1 58 quy trình hữu sử dụng hỗn Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA với hạt từ margetic 10µl 59 sử dụng Kit Prepfiler Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA với hạt từ margetic 15µl 60 sử dụng Kit Prepfiler Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA với hạt từ margetic 20µl 61 sử dụng Kit Prepfiler Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA 20% (3) 62 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA dụng Kit Prepfiler với hạt từ margetic 20µl (1), 15µl (2) 63 10µl (3) [...]... nhiều phương pháp tách chiết ADN khác nhau, nhưng qua nghiên cứu chúng tôi thấy chưa có phương pháp nào thật sự tối ưu Đề tài đặt ra là nghiên cứu tối ưu hoá phương pháp tách chiết ADN tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện KHHS nhằm góp phần tạo ra một phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng, xương tối ưu nhất 1.3.2 Cơ sở khoa học của giám định gen ti thể Ngoài phương. .. điện di đồ trên máy ABI 310 từ đó rút ra phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất 4 Đánh giá tổng kết rút ra phương pháp tách chiết tối ưu 5 Hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể đạt tiêu chuẩn trong khuôn khổ đề tài Nguyễn Xuân Quyền 4 Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG THỂ VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN... nhân “sát thủ” Nguyễn Đức Nghĩa đã phải cúi đầu nhận tội, chờ ngày phán xét của pháp luật , m Tối ưu hoá phương pháp tách chiết ADN từ răng, xương người phục vụ công tá – ”, Nguyễn Xuân Quyền 21 Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƢƠNG 2: 1 1.1 Thiết bị 1.1 c - Máy giải trình tự gen 310, 3130... hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA phương T pháp tách chiết bằng chelex 100™ có ưu điểm hơn, phương pháp tách chiết bằng chelex 100 thao tác đơn giản , không phải thực hiện qua nhiều công đoạn, Chelex không phải là hóa chất độc hại gây ung thư như phenol, clorofom, giá thành tách chiết một mẫu bằng chelex 100™ tương đương tách chiết bằng sử dụng... sạch, định lượng ADN, chạy PCR và điện di giải trình tự Nguyễn Xuân Quyền 310, đánh giá, đối chiếu chất lượng 24 Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA để chọn lựa phương pháp tối ưu Các phương pháp tách chiết ứng dụng cho nghiên cứu bao gồm: + phương pháp 1: sử dụng chelex 100™ ở các nồng độ khác nhau (5%, 10% và 20%) + phương. . .Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA * Từ mẫu răng, xương khoảng ( từ 1 năm tới 5 năm) trên cùng một vị trí, sau khi nghiền, bột được chia đều vào 6 ống ependoff 1,5ml để thực hiện đủ cho ba lô nghiên cứu với 3 phương pháp tách chiết: 1 ống sử dụng chelex 100™ 10%, 1 ống sử dụng phương pháp tách chiết hữu cơ sử dụng... khó, những mẫu xương răng cổ, sử dụng nhiều hoá chất thiết bị để tăng số lượng bản sao ADN từ mẫu giám định, nhằm phát hiện bằng những máy móc, thiết bị dùng trong phân tích ADN Các phòng thí nghiệm có ưu thế về nghiên cứu và ứng dụng lĩnh vực giám định Nguyễn Xuân Quyền 17 Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA ADN ti thể... 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA Cấm Ngay lập tức đội trọng án Công an thành phố Hà Nội đã phối hợp với lực lượng Khoa học hình sự đến hiện trường, đưa phần đầu được coi là của nạn nhân về phòng thí nghiệm để thực hiện giám định gen (ADN) Với tinh thần khẩn trương, không quản ngại khó khăn chỉ sau một ngày, các giám định viên đã giám. .. Nghệ An đào mương thoát nước đã phát hiện một bộ xương người chưa rõ tung tích CA TP Vinh, tỉnh Nghệ an đã thu 04 răng từ bộ hài Nguyễn Xuân Quyền 18 Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA cốt gửi Viện KHHS giám định ADN ti thể, qua giám định so sánh với mẹ của nạn nhân xác định được nạn nhân có quan hệ huyết thống theo dòng... cấu trúc ADN trong tế bào Thời gian càng lâu ADN càng biến tính và mai một đi đặc biệt là ADN nhân tế bào Trong những bộ hài cốt lâu năm, ADN Nguyễn Xuân Quyền 9 Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA chỉ tồn tại một lượng không nhiều trong ti thể ở những bộ phận có cấu trúc bền vững như răng, xương cứng ADN tồn tại trong ... có phương pháp thật tối ưu Đề tài đặt nghiên cứu tối ưu hoá phương pháp tách chiết ADN tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện KHHS nhằm góp phần tạo phương pháp tách chiết. .. Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA xử lý mẫu đến tách chiết, tinh ADN ti thể Tham khảo số phương pháp tách chiết ADN. .. block heater - Máy - - ( ) ( ( - ) - ) - ) ) ) - Nguyễn Xuân Quyền ) 22 Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA 1.1 - (Gilson,