Tối ưu hóa phương pháp tách chiết adn tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định adn tại viện khoa học hình sự bộ công an

Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 141 : Giám định gen không chỉ khắc phục được nh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu /

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu /

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Đề tài :

KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

Học viên:

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14 Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Hà

HÀ NỘI - 2013

HÀ NỘI - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu /

LỜI CẢM ƠN

Trung Tâm và toàn thể

11 năm 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu /

M 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1 Một số vấn đề về giám định gen ti thể 6

6

1.2 Khái niệm về giám định gen ti thể 7

1.3 Cơ sở khoa học và thực tiễn 7

1.3.1 Ti thể và hệ gen ti thể 7

1.3.2 Cơ sở khoa học của giám định gen ti thể 10

1.4 Dị chất (heteroplasmy) trong ti thể 15

1.5 Vùng chỉ thị ADN ti thể (vùng có tính đa hình cao) và các phương pháp giám định ADN ti thể 15

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về lĩnh vực liên quan đến đề tài 17 2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

NG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

22

1.1 Thiết bị 22

1.1.1 Th 22

23

1.2 Hóa chất 23

2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.1 Phương pháp làm sạch mẫu 24

2.2 Phương pháp nghiền mẫu 24

2.3 Phương pháp tách chiết ADN ti thể 24

2.4 Phương pháp tinh sạch ADN ti thể 25

2.5 Phương pháp định lượng ADN ti thể 25

2.6 Phương pháp PCR 25

2.7 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR, gắn BigDye 26

2.8 Phương pháp chạy điện di, giải trình tự ADN ti thể 26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu /

2.9 Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng và xương người 26

2.9.1 Tối ưu hóa nồng độ chelex 100TM 26

27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 28

1 Kết quả nghiên cứu 28

1.1 Kết quả tách chiết ADN ti thể 28

1 đến 5 năm): 28

từ 5 đến 10 năm): 29

1.2 Kết quả tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu răng và xương người 30

1.2.1 Kết quả tối ưu hóa nồng độ Chelex 100TM 30

31

32

1.3.1 Làm sạch mẫu răng và xương 32

1.3.2 Nghiền mẫu răng và xương 32

1.3.3 Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng chelex 100™ 33

1.3.4 Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng tách hữu cơ 33

1.3.5 Tách chiết ADN ti thể từ xương và răng bằng Kit Prepfiler 34

1.3.6 Tinh sạch ADN sử dụng bộ kit DNA IQTM System 36

1.3.7 Định lượng ADN sử dụng bộ kit Human DNA Quantification 36

1.3.8 Chuẩn bị và chạy phản ứng Nested PCR nhân bội sản phẩm ADN 37

1.3.9 Phản ứng Sequencing (gắn Big Dye) 38

1.3.10 Chuẩn bị mẫu cho điện di giải trình tự 38

1.3.11 Giải trình tự trên máy ABI 310 39

41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận: 43

2 Kiến nghị: 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu /

- ARN : Axit ribonucleic

- CSĐT : Cảnh sát điều tra

- DTT : Dithiothreitol (tên hoá chất)

- KHHS : Khoa học hình sự

- PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng nhân bội gen)

- PrK : Proteinaza K

- STR : Short tandem repeat (đoạn lặp lại ngắn)

- TS : Tiến sĩ

- VNTR : Variable number of tenderm repeat (đoạn lặp có độ dài trung bình)

- X : xương

- R : răng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu /

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm)

28

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 5-10 năm)

30

mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm)

31

với mẫu răng, xương(thời gian chôn cất từ 5-10 năm)

32

HÌNH

inheritance (maternal)

14

Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công

tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 141

:

Giám định gen

không chỉ khắc phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học trước đây mà còn giải quyết được những vụ án bế tắc trước đó, những vụ án mà ADN là bằng chứng duy nhất Tính ưu việt của giám định gen là truy nguyên được cá thể người,

tách chiết ADN nhân trong máu, lông, tóc, tế bào niêm mạc miệng Tuy nhiên, trong công tác giám định kỹ thuật hình sự nói chung và đặc biệt là giám định ADN hình sự nói riêng, đối tượng giám định thường là những mẫu vật đã ít nhiều biến tính không còn nguyên vẹn nhiều khi chỉ là một chiếc răng hoặc một mảnh xương gẫy vỡ lẫn trong môi trường tự nhiên một thời gian dài, với những mẫu vật như vậy ADN nhân tế bào hầu như không còn tồn tại, để giải quyết các yêu cầu điều tra đặt ra là xác định tung tích nạn nhân, đòi hỏi phải tiến hành giám định ADN ti thể Năm 2003 Viện Khoa học hình sự (KHHS) được viện trợ một máy giải trình tự nhằm nâng cao năng lực giám định ADN tại Viện, khi chuyển giao công nghệ các chuyên gia có giới thiệu về phương pháp giám định ADN ti thể với một số hóa chất và thiết bị phụ trợ do họ sản xuất, sau khi được tiếp cận với phương pháp giám định ADN ti thể mặc dù chưa được trang bị hoàn chỉnh, thiếu qui trình chuẩn nhưng trước đòi hỏi ngày càng cấp thiết của công tác điều tra phá án, phòng giám định gen Viện KHHS

đã vừa làm, vừa học thực hiện thành công một số vụ giám định ADN ti thể nhưng kết quả nhiều khi không ổn định do chưa có qui trình phù hợp từ khâu

Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công

tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 142

xử lý mẫu đến tách chiết, tinh sạch ADN ti thể Tham khảo một số phương pháp tách chiết ADN ti thể cả trong và ngoài nước nhận thấy có những phương pháp tách chiết tận thu được ADN ti thể, bảo đảm chất lượng cho phản ứng nhân gen (PCR) và giải trình tự, xong đều không phù hợp với điều kiện chất lượng mẫu vật gửi giám định ADN ti thể ở nước ta hoặc cả về thời

, các phương pháp tách chiết ADN ti thể thực hiện tại Viện KHHS - Bộ

và có tính rủi ro cao, chưa trở thành quy trình chuẩn để áp dụng rộng rãi, trong khi yêu cầu giám định ADN ti thể từ các mẫu răng và xương người nhằm giải quyết các vụ án ngày một cao[16] Theo thống kê tại phòng thí nghiệm giám định gen tại Viện KHHS cho thấy năm 2004 có 4 yêu cầu, năm

2005 có 7 yêu cầu, năm 2006 có 12 yêu cầu, năm 2007 có 14 yêu cầu

lượng ngày một nhiều

10 năm

1 Đề tài hoàn thành sẽ đưa ra phương pháp tách chiết ADN ti thể hoàn

phù hợp với điều kiện phßng thÝ nghiÖm hiÖn cã t¹i ViÖn KHHS

2 Góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể từ các mẫu

dụng để giám định ADN ti thể phục vụ giải quyết các vụ án hình sự cũng

Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công

tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 143

như các yêu cầu dân sự hoàn thiện hoá tính pháp lý của các quy trình giám định ADN hình sự

3 Hoàn thiện cơ sở lý luận về giám định ADN nói chung và ADN ti thể nói riêng phục vụ cho công tác thực tiễn cũng như nghiên cứu và giảng dạy

2 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu thực nghiệm các phương pháp tách chiết ADN ti thể khác nhau trên các mẫu răng, xương thu từ 02 bộ hài cốt người

1-5 năm và từ 5-10 năm

- ADN tổng số bao gồm cả ADN nhân và ADN ti thể, trong khuôn khổ hạn hẹp của đề tài, chúng tôi chỉ đặt ra mục tiêu và tập trung tối ưu hoá phương pháp tách chiết ADN ti thể, để thu được lượng ADN ti thể có chất lượng cao nhất, thu từ 02 bộ hài cốt người

1-5 năm và từ 5-10 năm, với tổng số 12 mẫu nghiên cứu là bột

- Quá trình nghiên cứu được tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện KHHS

3 Nội dung nghiên cứu

Tham khảo tài liệu, dựa trên nguyên lý tách chiết ADN; nghiên cứu các phương pháp tách chiết đang được sử dụng đề xuất 3 phương pháp tách chiết

có tính ưu việt khác nhau để tiến hành thử nghiệm đối với 12 mẫu răng xương

hài cốt gửi giám định

1 Sử dụng 3 phương pháp:

+ Phương pháp 1: sử dụng chelex 100™ ở các nồng độ khác nhau (5%, 10% và 20%)

+ Phương pháp 2: sử dụng hỗn hợp Phenol-clofom-izoaminalcohol theo tỉ

lệ 25:24:1

+ Phương pháp 3: sử dụng kit tách chiết Prepfiler (ABI System - Mỹ) với tỉ

Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công

tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - BCA

Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 144

từ 1 năm tới 5 năm) trên cùng một vị trí, sau khi nghiền, bột được chia đều vào 6 ống ependoff 1,5ml để thực hiện đủ cho ba lô nghiên cứu với 3 phương pháp tách chiết: 1 ống sử dụng chelex 100™ 10%, 1 ống sử dụng phương pháp tách chiết hữu cơ sử dụng hỗn hợp phenol-clorofom-izoamilalcohol theo tỉ lệ 25:24:1 và 1 ống sử dụng bộ kit tách chiết Prepfiler với

là 10µl như vậy trong mỗi lô, cả 3 phương pháp tách chiết đều

được tiến hành trên xương, răng của cùng một người với số lượng và chất lượng như nhau đây là điều kiện cần thiết để đánh giá, so sánh chính xác hiệu quả của từng phương pháp tách chiết, tiến hành thực nghiệm 3 lần Từ đó

năm tới 10 năm) cũng sử dụng phương pháp tách chiết như trên để đánh giá tối ưu được phương pháp tách chiết nào là hiệu quả nhất

định lượng bằng phương pháp Real-time PCR Mỗi lô sau khi tách chiết ADN bằng 3 phương pháp khác nhau sẽ được chạy phản ứng PCR tất cả các mẫu để nhân bội đoạn HVI hoặc HVII

3.Toàn bộ sản phẩm tách chiết bởi các phương pháp khác nhau được so sánh, đánh giá bằng hình ảnh điện di đồ trên máy ABI 310 từ đó rút ra phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất

4 Đánh giá tổng kết rút ra phương pháp tách chiết tối ưu

5 Hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể đạt tiêu chuẩn trong khuôn khổ đề tài