Tối ưu hóa phương pháp tách chiết adn tổng số từ răng, xương người phục vụ công tác giám định adn tại viện khoa học hình sự bộ công an

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu / BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Đề tài : KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN Học viên: Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Hà HÀ NỘI - 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu / HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN – PGS – – nghiên cứu Viện Khoa học hình sự, Lãnh đạo Tôi xin ch Trung Tâm toàn thể – – 11 năm 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu / M CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Một số vấn đề giám định gen ti thể .6 1.2 Khái niệm giám định gen ti thể 1.3 Cơ sở khoa học thực tiễn 1.3.1 Ti thể hệ gen ti thể .7 1.3.2 Cơ sở khoa học giám định gen ti thể .10 1.4 Dị chất (heteroplasmy) ti thể .15 1.5 Vùng thị ADN ti thể (vùng có tính đa hình cao) phương pháp giám định ADN ti thể 15 Tình hình nghiên cứu nước lĩnh vực liên quan đến đề tài 17 2.1 Tình hình nghiên cứu nước 17 2.2 Tình hình nghiên cứu nước 18 NG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 22 1.1 Thiết bị 22 1.1.1 Th 22 23 1.2 Hóa chất 23 Phương pháp nghiên cứu 23 2.1 Phương pháp làm mẫu 24 2.2 Phương pháp nghiền mẫu 24 2.3 Phương pháp tách chiết ADN ti thể 24 2.4 Phương pháp tinh ADN ti thể .25 2.5 Phương pháp định lượng ADN ti thể 25 2.6 Phương pháp PCR 25 2.7 Phương pháp tinh sản phẩm PCR, gắn BigDye 26 2.8 Phương pháp chạy điện di, giải trình tự ADN ti thể 26 Số hóa Trung tâm Học liệu / 2.9 Tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu xương người 26 2.9.1 Tối ưu hóa nồng độ chelex 100TM 26 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 28 Kết nghiên cứu 28 1.1 Kết tách chiết ADN ti thể .28 đến năm): 28 từ đến 10 năm): 29 1.2 Kết tối ưu hóa phương pháp tách chiết ADN ti thể từ mẫu xương người 30 1.2.1 Kết tối ưu hóa nồng độ Chelex 100TM 30 31 .32 1.3.1 Làm mẫu xương 32 1.3.2 Nghiền mẫu xương 32 1.3.3 Tách chiết ADN ti thể từ xương chelex 100™ 33 1.3.4 Tách chiết ADN ti thể từ xương tách hữu 33 1.3.5 Tách chiết ADN ti thể từ xương Kit Prepfiler 34 1.3.6 Tinh ADN sử dụng kit DNA IQTM System 36 1.3.7 Định lượng ADN sử dụng kit Human DNA Quantification 36 1.3.8 Chuẩn bị chạy phản ứng Nested PCR nhân bội sản phẩm ADN .37 1.3.9 Phản ứng Sequencing (gắn Big Dye) .38 1.3.10 Chuẩn bị mẫu cho điện di giải trình tự .38 1.3.11 Giải trình tự máy ABI 310 39 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận: 43 Kiến nghị: 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 47 Số hóa Trung tâm Học liệu / - ADN : Axit deoxyribonucleic - ARN : Axit ribonucleic - CSĐT : Cảnh sát điều tra - DTT : Dithiothreitol (tên hoá chất) - KHHS : Khoa học hình - PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng nhân bội gen) - PrK : Proteinaza K - STR : Short tandem repeat (đoạn lặp lại ngắn) - TS : Tiến sĩ - VNTR : Variable number of tenderm repeat (đoạn lặp có độ dài trung bình) -X -R : xương : Số hóa Trung tâm Học liệu / Số hiệu bảng Tên Bảng 1.1 3.1 Trang 12 Kết định lượng phương pháp tách chiết 28 mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm) 3.2 Kết định lượng phương pháp tách chiết 30 mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 5-10 năm) 3.3 Kết định lượng tối ưu hoá nồng độ chelex 31 mẫu răng, xương (thời gian chôn cất từ 1-5 năm) 3.4 Kết định lượng tối ưu hoá thể tích d/d hạt từ đối 32 với mẫu răng, xương(thời gian chôn cất từ 5-10 năm) HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Ti thể tế bào người 1.2 Cấu trúc hệ gen ti thể người 11 1.3 Phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ti thể 14 inheritance (maternal) Số hóa Trung tâm Học liệu / Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA : Giám định gen 90 20 không khắc phục hạn chế phương pháp huyết học trước mà giải vụ án bế tắc trước đó, vụ án mà ADN chứng Tính ưu việt giám định gen truy nguyên cá thể người, xác định huyết thống cha-con, xác định hài cốt… giám định gen tách chiết ADN nhân máu, lông, tóc, tế bào niêm mạc miệng Tuy nhiên, công tác giám định kỹ thuật hình nói chung đặc biệt giám định ADN hình nói riêng, đối tượng giám định thường mẫu vật nhiều biến tính không nguyên vẹn nhiều mảnh xương gẫy vỡ lẫn môi trường tự nhiên thời gian dài, với mẫu vật ADN nhân tế bào không tồn tại, để giải yêu cầu điều tra đặt xác định tung tích nạn nhân, đòi hỏi phải tiến hành giám định ADN ti thể Năm 2003 Viện Khoa học hình (KHHS) viện trợ máy giải trình tự nhằm nâng cao lực giám định ADN Viện, chuyển giao công nghệ chuyên gia có giới thiệu phương pháp giám định ADN ti thể với số hóa chất thiết bị phụ trợ họ sản xuất, sau tiếp cận với phương pháp giám định ADN ti thể chưa trang bị hoàn chỉnh, thiếu qui trình chuẩn trước đòi hỏi ngày cấp thiết công tác điều tra phá án, phòng giám định gen Viện KHHS vừa làm, vừa học thực thành công số vụ giám định ADN ti thể kết nhiều không ổn định chưa có qui trình phù hợp từ khâu Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA xử lý mẫu đến tách chiết, tinh ADN ti thể Tham khảo số phương pháp tách chiết ADN ti thể nước nhận thấy có phương pháp tách chiết tận thu ADN ti thể, bảo đảm chất lượng cho phản ứng nhân gen (PCR) giải trình tự, xong không phù hợp với điều kiện chất lượng mẫu vật gửi giám định ADN ti thể nước ta thời gian tính, giá thành C , phương pháp tách chiết ADN ti thể thực Viện KHHS - Bộ không cho kết ổn định phương pháp Công an ứng dụng tự phát mang tính chất thăm dò , chưa đồng có tính rủi ro cao, chưa trở thành quy trình chuẩn để áp dụng rộng rãi, yêu cầu giám định ADN ti thể từ mẫu xương người nhằm giải vụ án ngày cao[16] Theo thống kê phòng thí nghiệm giám định gen Viện KHHS cho thấy năm 2004 có yêu cầu, năm 2005 có yêu cầu, năm 2006 có 12 yêu cầu, năm 2007 có 14 yêu cầu 17 yêu cầu 20 yêu cầu năm 2012 22 yêu cầu với số lượng ngày nhiều 10 năm , : “Tối ƣu hoá phƣơng pháp tách chiết ADN phục vụ công tác từ răng, xƣơng ngƣời – ” : Đề tài hoàn thành đưa phương pháp tách chiết ADN ti thể hoàn chỉnh từ mẫu xương người , tối ưu t phù hợp với điều kiện phßng thÝ nghiÖm hiÖn cã t¹i ViÖn KHHS Góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể từ mẫu xương, người quy trình chuẩn áp dụng để giám định ADN ti thể phục vụ giải vụ án hình Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA yêu cầu dân hoàn thiện hoá tính pháp lý quy trình giám định ADN hình Hoàn thiện sở lý luận giám định ADN nói chung ADN ti thể nói riêng phục vụ cho công tác thực tiễn nghiên cứu giảng dạy Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu thực nghiệm phương pháp tách chiết ADN ti thể khác mẫu răng, xương thu từ 02 hài cốt người 1-5 năm từ 5-10 năm - ADN tổng số bao gồm ADN nhân ADN ti thể, khuôn khổ hạn hẹp đề tài, đặt mục tiêu tập trung tối ưu hoá phương pháp tách chiết ADN ti thể, để thu lượng ADN ti thể có chất lượng cao nhất, thu từ 02 hài cốt người 1-5 năm từ 5-10 năm, với tổng số 12 mẫu nghiên cứu bột xương phục vụ cho trình thực nghiệm - Quá trình nghiên cứu tiến hành phòng thí nghiệm Viện KHHS Nội dung nghiên cứu Tham khảo tài liệu, dựa nguyên lý tách chiết ADN; nghiên cứu phương pháp tách chiết sử dụng đề xuất phương pháp tách chiết có tính ưu việt khác để tiến hành thử nghiệm 12 mẫu xương hài cốt gửi giám định Sử dụng phương pháp: + Phương pháp 1: sử dụng chelex 100™ nồng độ khác (5%, 10% 20%) + Phương pháp 2: sử dụng hỗn hợp Phenol-clofom-izoaminalcohol theo tỉ lệ 25:24:1 + Phương pháp 3: sử dụng kit tách chiết Prepfiler (ABI System - Mỹ) với tỉ lệ Nguyễn Xuân Quyền 10µl, 15µl 20µl Mã số: 60.42.01 14 Tối ưu hoá phươ từ răng, xương người phục vụ công tác giám định ADN Viện Khoa học hình - BCA * Từ mẫu răng, xương khoảng ( từ năm tới năm) vị trí, sau nghiền, bột chia vào ống ependoff 1,5ml để thực đủ cho ba lô nghiên cứu với phương pháp tách chiết: ống sử dụng chelex 100™ 10%, ống sử dụng phương pháp tách chiết hữu sử dụng hỗn hợp phenol-clorofom-izoamilalcohol theo tỉ lệ 25:24:1 ống sử dụng kit tách chiết Prepfiler với 10µl lô, phương pháp tách chiết tiến hành xương, người với số lượng chất lượng điều kiện cần thiết để đánh giá, so sánh xác hiệu phương pháp tách chiết, tiến hành thực nghiệm lần Từ * Từ mẫu răng, xương khoảng từ ( năm tới 10 năm) sử dụng phương pháp tách chiết để đánh giá tối ưu phương pháp tách chiết hiệu Sản phẩm tách chiết tinh kit tinh IQ SystemTM định lượng phương pháp Real-time PCR Mỗi lô sau tách chiết ADN phương pháp khác chạy phản ứng PCR tất mẫu để nhân bội đoạn HVI HVII 3.Toàn sản phẩm tách chiết phương pháp khác so sánh, đánh giá hình ảnh điện di đồ máy ABI 310 từ rút phương pháp tách chiết cho kết tốt Đánh giá tổng kết rút phương pháp tách chiết tối ưu Hoàn thiện quy trình giám định ADN ti thể đạt tiêu chuẩn khuôn khổ đề tài Nguyễn Xuân Quyền Mã số: 60.42.01 14