Nhân Giống Vô Tính In Vitro Cây Hoa Cẩm Chướng (Dianthus Sinensis L.)

Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa lên quá trình phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro 15 và 30 ngày sau cấy .... Mục đích Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO CÂY HOA CẨM CHƯỚNG (Dianthus sinensis L.)

TÓM TẮT

Nhu cầu sử dụng hoa để trang trí trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống Hoa Cẩm chướng là loại hoa cắt cành phổ biến không kém hoa hồng, hoa cúc trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có khoảng hơn 300 loài hoa này và có rất nhiều giống lai khác nhau Mục tiêu của đề tài này là nhân giống cây hoa Cẩm chướng dựa trên việc khảo ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân chồi

và tạo rễ cây Cẩm chướng in vitro

Môi trường muối khoáng cơ bản Murashige và Skoog (1962) được sử dụng để

nuôi cấy cây Cẩm chướng in vitro

- Trong giai đoạn nhân chồi, chúng tôi khảo sát hai thí nghiệm:

Thí nghiệm (1) bổ sung nồng độ BA từ 0,5mg/l đến 2,0mg/l trong môi trường

nuôi cấy Kết quả, ở nồng độ BA 1,5mg/l cho số chồi cây Cẩm chướng in vitro cao

MỤC LỤC

Trang

Mục lục i

Danh mục chữ viết tắt iii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về cây hoa Cẩm chướng 3

2.1.1 Phân loại thực vật 3

2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 3

2.1.3 Giá trị thẩm mỹ và kinh tế 4

2.2 Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 4

2.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô 5

2.2.2 Nhân giống in vitro 6

2.2.3 Các vấn đề liên quan đến nhân giống in vitro 9

2.3 Các nghiên cứu trước đây về cây Cẩm chướng in vitro 23

2.4 Một số loài Cẩm chướng phổ biến ở Việt Nam 24

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm 28

3.2 Vật liệu thí nghiệm 28

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

3.2.2 Trang thiết bị 28

3.2.3 Hóa chất và môi trường 28

3.3 Phương pháp thí nghiệm 29

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi của cây Cẩm chướng in vitro 29

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro 30

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ của cây Cẩm chướng in vitro 32

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

BA : benzyl adenin IBA : acid indol-3-butyric

Môi trường

MS: môi trường Murashige và Skoog (1962) ĐC: đối chứng

chướng in vitro 38 Bảng 4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa lên số lượng chồi cây Cẩm chướng in vitro

39

Bảng 4.3.1 Ảnh hưởng của IBA lên thời gian tạo rễ cây Cẩm chướng in vitro 42 Bảng 4.3.2 Ảnh hưởng của IBA quá trình hình thành rễ cây Cẩm chướng in vitro 43

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Dianthus sinensis L 3

Hình 2.2 Dianthus barbatus 25

Hình 2.3 Dianthus deltoides 25

Hình 2.4 Dianthus gratinanopolitanus 26

Hình 2.5 Dianthus pavonius 26

Hình 2.6 Dianthus plumatus 27

Hình 4.1 Ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro sau 15 và 30 ngày sau cấy 38

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa lên quá trình phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro 15 và 30 ngày sau cấy 42

Hình 4.3 Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ cây Cẩm chướng in vitro 46

Hình 4.4 Sơ đồ quy trình nhân giống cây Cẩm chướng in vitro 47

tế quan trọng trong nhân giống cây trồng

Từ nhiều năm trở lại đây, khi khám phá ra rằng thực vật có thể nhân giống

nhanh chóng trong điều kiện in vitro thì rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã tập trung vào nghiên cứu Phương pháp nhân giống vô tính in vitro cho phép giữ nguyên đặc tính và cải thiện giống cây trồng Bằng phương pháp in vitro người ta

có thể sử dụng tất cả các bộ phận của cây trong điều kiện vô trùng để nuôi cấy Ngày nay khi khoa học kỹ thuật phát triển, đời sống con người được nâng cao, các nhu cầu thẩm mỹ ngày càng được chú trọng hơn Nhu cầu sử dụng hoa để trang trí trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống Phương pháp nhân giống vô

tính in vitro đã mở ra cho ngành công nghiệp hoa cắt cành và hoa chậu cảnh ngày

một phát triển và đem lại một nguồn thu nhập đáng kể

Từ những nghiên cứu về nhân giống vô tính in vitro, chúng tôi thực hiện đề tài

này trên đối tượng là cây hoa Cẩm chướng Mục tiêu của đề tài này là nhân giống cây hoa Cẩm chướng dựa trên việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc hình

thành chồi, rễ của cây Cẩm chướng in vitro

1.2 Mục đích-yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi, tạo rễ,

hình thành cây Cẩm chướng in vitro hoàn chỉnh

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA thích hợp cho sự hình thành

chồi cây Cẩm chướng in vitro

- Xác định nồng độ nước dừa thích hợp lên sự hình thành chồi cây Cẩm

chướng in vitro

- Xác định nồng độ IBA thích hợp lên sự phát sinh rễ cây Cẩm chướng in vitro

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về cây Cẩm chướng

bị sâu bệnh Thân phân nhánh nhiều, có đốt dễ gãy giòn, lá Cẩm chướng mọc đối, phiến lá nhỏ dày, dài, không có răng cưa, mặt lá thường nhẵn Hoa mọc đơn từng chiếc một ở nách lá, hoa kép có nhiều màu sắc ngay trên cùng một bông, mang nhiều hạt, có từ 330 – 550 hạt [14]

Hiện nay, trên thế giới có khoảng hơn 300 loài và có rất nhiều giống lai khác nhau Hoa cẩm chướng có hai loại là loại hoa đơn và cánh kép, màu sắc rất đa dạng như: màu trắng điểm pha sắc hồng, hường, đỏ, vàng và cam Chúng thường ra hoa vào mùa xuân hay mùa hè, có khi đến tận mùa đông nếu thời tiết không quá lạnh Hoa Cẩm chướng có mùi hương rất đặc trưng [10]

2.1.3 Tính thẩm mỹ và giá trị kinh tế

Trước đây hoa Cẩm chướng được trồng làm cảnh trang trí Từ năm 1975 đã có sản xuất hoa cắt cành với những giống nhập trước 1975 Từ năm 1995 có nhiều giống hoa Cẩm chướng được nhập nội có nguồn gốc từ Hà Lan, Trung Quốc với màu sắc đa dạng phong phú Vùng Vạn Thành – phường 5, Thái Phiên – phường 12,

7, 8 là nơi trồng nhiều hoa Cẩm chướng tại Đà Lạt [12]

Hiện nay có khoảng 20 giống được trồng với mục đích cắt cành Các giống trồng trọt hiện nay được chia theo nhóm sau:

Nhóm hoa chùm: Màu đỏ, hồng, trắng, kem… Hoa nhỏ, chành thấp 30-40 cm Thời gian sinh trưởng 18-24 tháng

Nhóm hoa đơn: Màu đỏ, hoa lớn, cành cao 70-80 cm, mắt thưa, ít chồi Thời gian sinh trưởng 15-18 tháng

Hoa Cẩm chướng có diện tích canh tác không lớn, chủ yếu trồng trong nhà có mái che plastic Hàng năm, Đà Lạt cung cấp khoảng 0,3-0,5 triệu cành hoa Cẩm chướng các loại [15]

2.2 Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các

phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm trên môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường bao gồm các nhân tố thiết yếu đa lượng và vi lượng, chất kích thích sinh trưởng, đường, vitamin và một số hợp chất hữu cơ cần thiết khác

Tế bào thực vật có tính toàn thế, tế bào đơn hoặc protoplast thực vật đều có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh Đây là điều kiện quan trọng để ứng dụng trong nuôi

cấy mô thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các

mô như lá, thân, hoa hoặc rễ tạo thành cây hoàn chỉnh nhờ vào sự điều chỉnh môi

trường nuôi cấy in vitro [13], [1]

2.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô

Ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in vitro)

đã được Haberlandt thử nghiệm từ năm 1902 nhưng do ông đã sử dụng các tế bào

của cây một lá mầm nên đã thất bại Năm 1919, Carrel nuôi cấy thành công mô

động vật, nhưng cho đến năm 1934 mô thực vật mới được nuôi cấy

Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của các

tế bào rễ cà chua được nuôi cấy mô

Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn

Ông đã thành công trong việc chuyển mô nuôi cấy thành cây con ở cây sen cạn và

cây White lupin trên môi trường nuôi dinh dưỡng nhân tạo Tuy nhiên, việc nhân

giống thực vật in vitro vẫn chưa hoàn thiện Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu đã khám

phá ra những thành phần quan trọng, cần thiết cho sự phát triển của tế bào được

nuôi cấy

Năm 1951, Skoog và Miller phát hiện ra các hợp chất có khả năng điều khiển sự

nhân chồi

Năm 1962, Murashige và Skoog đã thành công trong việc cải tiến môi trường

nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ đã được dùng làm môi trường cơ bản cho việc nuôi cấy nhiều

loại cây và cho đến nay vẫn còn được sử dụng rộng rãi [2], [7]

Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đang được sử dụng rộng rãi để sản xuất

giống cây trồng tạo nguồn giống đồng nhất về di truyền, sạch bệnh, đồng đều về

sinh lý và phát triển bình thường Những ứng dụng của vi nhân giống trong nghề

vườn nói riêng và nông nghiệp nói chung đã rộng khắp thế giới nhưng việc thương

mại hóa vẫn còn giới hạn do chi phí sản xuất lớn, giá thành sản phẩm cao

Trong nuôi cấy mô người ta có xu hướng quan tâm đến các thành phần hóa học

như: chất vô cơ, chất kích thích sinh trưởng thực vật, đường, acid amin, vitamin, và

các đặc tính sinh hóa của môi trường như chỉ số pH hơn là các yếu tố vật lý môi trường (ánh sáng, thành phần khí, độ ẩm, trao đổi khí, nhiệt độ) trong hộp nuôi cấy

2.2.2 Nhân giống in vitro

2.2.2.1 Ưu điểm

- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây mẹ ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao về số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng với tốc độ nhân nhanh, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây

- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân nhanh dòng Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gene dị hợp hay đồng hợp

- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

- Nâng cao chất lượng cây trồng: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 – 30% so với giống gốc

- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác

nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro hoặc trong bầu

đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ

- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận

là sạch bệnh Do vậy, đảm bảo an toàn, đáp ứng được các yêu cầu về vệ sinh thực vật quốc tế

- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành ở bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [13], [1], [7]

2.2.2.2 Hạn chế

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả các cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chứa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thị trương mại hoặc bảo quản nguồn gene Nhiều vấn đề lý thuyết liên

quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

- Chi phí sản xuất cao: Vì nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỉ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích tăng trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

2.2.2.3 Các bước nhân giống in vitro

Nhân giống cây trồng in vitro gồm các bước cơ bản sau:

- Tạo thể nhân giống in vitro

- Nhân giống in vitro

- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

- Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

٭ Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống

in vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống

in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với

những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo) Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác Trước khi tạo các thể nhân giống, các mẫu ban đầu thường được khử trùng bằng hóa chất để loại bỏ những mầm bệnh gây hại cho cây

٭ Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng số lượng mẫu trong nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi Giai đoạn này cây cần có một lượng cytokinin ngoại sinh cao để kích thích sự hình thành cụm chồi, đôi khi nồng độ chất kích thích sinh trưởng giảm thấp làm cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp

giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ

hóa và được duy trì trong thời gian dài

٭ Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ thuộc nhóm auxin Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi tách ra khỏi điều kiện

in vitro

٭ Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

Đây là một giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì nó quyết

định chi phí sản xuất cây giống Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định

dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ cao, nhiệt độ cao,

độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao Cây con thường được trồng trong các luống ươm, trên các vĩ xốp

hoặc trên các bầu đất cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi

và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ

2.2.3 Các vấn đề liên quan đến nhân giống in vitro

2.2.3.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy lên khả năng phát sinh hình thái của cây

Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển in vitro Những ảnh hưởng có thể được tóm tắt như sau:

٭ Kiểu gen

Khả năng tái sinh trong giới thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ khi chúng còn non) Trong số các cây hai lá mầm: Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những loài dễ tái sinh nhất Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các giống lai

Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh

in vitro Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinaceae hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo

nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các

chất kích thích sinh trưởng

٭ Tuổi của cây

Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao, do đó ở Ngũ cốc người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây con dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi Một vài ví dụ cụ thể chỉ sự khác nhau về khả năng tái sinh và phân

chia tế bào giữa cây già và cây in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và Britt, 1965),

Lunaria annua (Pierik, 1967) và Anthurium andreanum (Pierik và cộng sự, 1974)

Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ được

những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu Đôi

khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do gia tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được Hackett (1985) chứng minh

trên những đối tượng như: Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonoca

Sự hình thành chồi bất định là một trong những phương pháp giúp trẻ hóa

٭ Tình trạng sinh lý

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào

in vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh

hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây Huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957) Các chồi

của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi

của những cây đã trải qua giai đoạn ngủ đông

٭ Tình trạng sức khỏe

Vào thời điểm tiến hành nuôi cấy in vitro, nếu sử dụng các bộ phận của cây

trong tình trạng khỏe mạnh thì khả năng nuôi cấy thành công cao hơn Do đó, nên chọn mẫu từ những cây khỏe mạnh và sinh trưởng bình thường nhất làm thí nghiệm

vì điều này ảnh hưởng đến phần trăm nhiễm và khả năng tái sinh của mẫu sau khi được tách khỏi cây mẹ

٭ Điều kiện phát triển

Các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong tự nhiên phản ứng khác với các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong nhà kính Nhìn chung, những mẫu cấy ban đầu có nguồn gốc từ nhà kính thường ít bị bệnh, dễ tái sinh hơn vật liệu bên ngoài ví dụ như cây

Rhododendron (Pierik và Steegmans, 1975) Điều kiện phát triển của những cây nở

hoa vào mùa đông như Begonia có ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành chồi và rễ bất định trong nuôi cấy in vitro

٭ Vị trí của mẫu cấy trên cây

Các mẫu cấy được lấy từ thân chính hoặc các chồi bên ở một số cây thân gỗ sẽ giữ nguyên đặc tính di truyền này đối với cây con nuôi cấy mô nghĩa là đối với các mẫu lấy từ thân chính thì cây cấy mô sẽ phát triển thành cây trưởng thành và tạo nhiều cành ngang, ngược lại nếu mẫu cấy được lấy từ các cành ngang thì cây cấy

mô cũng chỉ phát triển ở dạng cành ngang, không tạo được thân chính như cây gieo hạt Sự bảo lưu đặc điểm di truyền này thể hiện rất rõ ở các cây giâm cành

Ever (1984) đã khảo sát hiện tượng bảo lưu di truyền ở cây Pseudotsuga menziesii,

ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển

trong môi trường in vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách Sự

hình thành chồi bất định của các mẫu cấy lan Dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh Điều này cũng xảy ra tương tự đối với lily (Robb, 1957) Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng

in vitro giống nhau

٭ Kích thước mẫu cấy

Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏi cây tự

nó cung cấp dự trữ chất dinh dưỡng và hormon, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh

dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn

những cơ quan ít dự trữ Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt dễ bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk chứng minh vào năm 1984

٭ Vị trí của các mẫu cấy đặt trên môi trường nuôi cấy

Các mẫu cấy có thể đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọn xuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu cấy được cấy không cực (Pierik và Steegmans, 1975) Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuyếch tán vào trong thạch do nó không tiếp xúc với môi trường Như ở trường hợp tất cả cây thuộc họ

Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1985), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy

hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực [2], [1], [13]

2.2.3.2 Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát sinh hình thái

của cây

٭ Độ ẩm tương đối trong bình

Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy là một nhân tố môi trường quan trọng, nó ảnh hưởng đến mối quan hệ về nước của mẫu cấy bởi vì mối quan hệ này tác động lên các quá trình sinh hoá và sinh lý Tanaka và cộng sự (1992) đã thấy rằng có sự liên hệ tích cực giữa việc giảm độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy với việc gia

tăng sự kháng của lá đối với sự thoát hơi nước của cây Khoai tây nuôi cấy in vitro

Sự điều khiển độ ẩm tương đối thích hợp có thể góp phần vào việc cải thiện chất

lượng và năng suất của cây được nuôi cấy in vitro Độ ẩm tương đối trong bình nuôi

cấy phụ thuộc rất nhiều vào số lần trao đổi khí trong một giờ và độ ẩm tương đối của phòng nuôi cấy (Tanaka và cộng sự, 1992) Việc giảm độ ẩm tương đối trong môi trường nuôi cấy sẽ cải thiện được chức năng của khí khổng (Ziv, 1991) Những bằng chứng thu được cho thấy rằng độ ẩm tương đối đóng vai trò chính trong hiện tượng thủy tinh thể (Debergh, 1987)

Hộp nuôi cấy kín gây điều kiện bất lợi cho sự tăng trưởng của cây in vitro do độ

ẩm trong hộp tăng cao so với độ ẩm ngoài hộp Độ ẩm ảnh hưởng đến khả năng hấp thu nước, các chất khoáng và khả năng sống của cây khi ra khỏi ống nghiệm Độ ẩm cao làm lá phát triển không bình thường, thay đổi về hình thái cấu trúc và chức năng sinh lý, như hiện tượng thủy tinh thể, lớp cutin mỏng, chức năng đóng mở của khí khổng giảm (Nguyễn Thị Quỳnh và Toyoki Kozai, 2001)

chất lượng và năng suất của cây được nuôi cấy in vitro Độ ẩm tương đối trong bình

nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào số lần trao đổi khí trong một giờ và độ ẩm tương đối của phòng nuôi cấy (Tanaka và cộng sự, 1992) Việc giảm độ ẩm tương đối trong môi trường nuôi cấy sẽ cải thiện được chức năng của khí khổng (Ziv, 1991) Những bằng chứng thu được cho thấy rằng độ ẩm tương đối đóng vai trò chính trong hiện tượng thủy tinh thể (Debergh, 1987)

Hộp nuôi cấy kín gây điều kiện bất lợi cho sự tăng trưởng của cây in vitro do độ

ẩm trong hộp tăng cao so với độ ẩm ngoài hộp Độ ẩm ảnh hưởng đến khả năng hấp thu nước, các chất khoáng và khả năng sống của cây khi ra khỏi ống nghiệm Độ ẩm cao làm lá phát triển không bình thường, thay đổi về hình thái cấu trúc và chức năng sinh lý, như hiện tượng thủy tinh thể, lớp cutin mỏng, chức năng đóng mở của khí khổng giảm (Nguyễn Thị Quỳnh và Toyoki Kozai, 2001)

Nồng độ CO2 trong bình thay đổi theo sự hô hấp và quang hợp của cây Trong tối, khi cây hô hấp, nồng CO2 trong bình tăng lên nhưng khi chiếu sáng, cây quang hợp thì nồng độ CO2 lại giảm đi. 

Trong phương pháp vi nhân giống truyền thống, sự kém thông thoáng của môi trường hộp nuôi cấy đã giới hạn việc trao đổi khí khiến nồng độ CO2 trong hộp nuôi cấy giảm nhanh sau hai giờ chiếu sáng và tiếp tục giảm đến gần điểm bù CO2 (50 – 100 μmol mol-1) theo nghiên cứu của Buddendorf và cs (1994), do đó cây hầu như không quang hợp được ở nồng độ CO2 này làm cho cây tích lũy sinh khối ít và chậm phát triển Cùng với sự giảm nồng độ CO2 trong hộp nuôi cấy là quá trình tích

lũy các khí như ethylen cũng làm giảm sự tăng trưởng của cây in vitro Lin và cộng

sự (2009) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CO2 và độ ẩm tương đối của môi trường không đường lên các cây Dã yên thảo, Cúc, Cà chua nuôi cấy trong hộp tăng trưởng lớn Cây Dã yên thảo sinh trưởng tốt ở nồng độ CO2 650 ± 50 μl/l và độ ẩm 70%; Cây cúc và cà chua sinh trưởng tốt ở nồng độ CO2 350 ± 50 μl/l Suốt thời gian chiếu sáng, thực vật sử dụng CO2 và sản xuất O2 Trong giai đoạn tối cây hô hấp tiêu thụ O2, nồng độ CO2 sẽ tăng lên CO2 trong giai đoạn tối sẽ được thực vật cấy mô sử dụng hết sau 2 giờ được chiếu sáng Gần đây, người ta đã chứng minh

rằng sự chuyển động của không khí gây ảnh hưởng đến chất lượng cây giống

in vitro

Chingwen Huang và Chiachung Chen (2005) nghiên cứu các đặc điểm vật lý: tốc độ trao đổi khí, sự phân bố khí, quang phổ ánh sáng lên 7 loại bình nuôi cấy Kết quả cho thấy tốc độ trao đổi khí trong bình nuôi cấy dao động 0,0145-0,0811/h;

Sự phân bố khí trong bình đáy tròn đồng đều hơn bình nhiều góc cạnh; đặc điểm của bình ảnh hưởng rõ rệt đến quang phổ ánh sáng Thông thường việc đậy kín bình nuôi cấy ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thoát hơi nước quá mức

từ môi trường và mẫu cấy Dạng bình nuôi cấy kín làm ảnh hưởng đến thành phần các khí (Lentini và cộng sự, 1988) cũng như ánh sáng Blazkova và cộng sự (1989)

đã quan sát sự khác nhau về sinh trưởng và phát triển của cây Chenpodium rubrum nuôi cấy in vitro trong những bình nuôi cấy khác nhau và lý do cho sự khác nhau

này là sự thay đổi thành phần môi trường khí trong bình nuôi cấy như hàm lượng

CO2 giảm và hàm lượng ethylene gia tăng (De Proft và cộng sự, 1985; Blazkova và cộng sự, 1989)

Nồng độ CO2 cao có nhiều tác động có lợi lên sự kéo dài chồi và sự phát triển

của lá dựa trên sự tháo gỡ sự ngủ của chồi ngủ và đốt đơn cây Theobroma cacao,

một loài rất khó nhân giống bằng hệ thống vi nhân giống truyền thống Woltering (1990) đã chứng minh rằng nồng độ CO2 trên 10000 ppm rất có ích cho cây hoa Hồng và cây cây hoa Đồng tiền trong việc giảm sự lão hóa của lá và sự rụng lá Figueira và Janick (1994) nhận thấy tính gia tăng của việc kéo dài chồi, số lá, diện

tích lá, khối lượng khô và tươi của chồi cây Theobroma cacao khi nồng độ CO2

xung quanh lên đến 24000 ppm Fujiwara và cộng sự (1988) cho rằng tốc độ quang

hợp thấp và sự kém phát triển của cây in vitro là do nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy thấp trong suốt quá trình quang hợp Nói cách khác nồng độ CO2 thấp trong bình nuôi cấy trong gần hết quang kỳ sẽ ức chế khả năng quang hợp của cây, từ đó buộc cây phải sinh trưởng theo phương thức dị dưỡng hay dị-tự dưỡng nhờ vào sự hấp thu đường từ môi trường như là nguồn cacbon chủ yếu của cây (Kozai,1991)

٭ Sự bổ sung của đường trong môi trường

Sự hiện diện của nồng độ đường cao trong môi trường nuôi cấy sẽ làm giảm khả năng quang hợp của cây Do hoạt động của diệp lục tố bị kiềm hãm bởi tác động của các enzym Rubisco Sự hiện diện của đường trong môi trường cùng với cường độ ánh sáng thấp làm cho hoạt động biến dưỡng và tiêu thụ carbon hydrate thấp khiến cây tăng trưởng chậm Sự có mặt của đường làm tăng tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn, là nguyên nhân làm thất thoát một lượng cây lớn trong quá trình nuôi cấy

in vitro (Nguyễn Thị Quỳnh, Toyoki Kozai, 2002) Đồng thời, sự có mặt của đường

làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, cản trở quá trình hấp thu nước và chất khoáng của hệ rễ Vì vậy, Kozai đề nghị giảm hay loại bỏ hoàn toàn đường và vitamin khỏi thành phần môi trường nuôi cấy, đồng thời tăng nồng độ CO2 và

cường độ ánh sáng (Kozai và cs, 1995)

٭ Ánh sáng

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có dải bước sóng từ 400-700 nm với đỉnh từ 600-680 nm Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, kéo dài đốt thân,v.v.) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400-500 nm (xanh lam), 600-700 nm (đỏ), 700-800 nm (siêu đỏ)

Nhu cầu ánh sáng của cây được phân tích ở những thông số khác nhau: độ sáng bởi đơn vị diện tích (hoặc cường độ) thể hiện bởi w/m2, thời gian chiếu sáng thể hiện bằng giờ/ngày và chất lượng phổ của ánh sáng nhận được Trước đây, cường

độ ánh sáng được đo bằng đơn vị lux, nhưng nó lại tùy thuộc vào sinh lý của mắt người đo, mắt người lại nhạy với ánh sáng xanh lá cây hơn là xanh lam và đỏ nên hoàn toàn không phù hợp với nhu cầu của thực vật Do đó, hiện nay, trong các nghiên cứu về thực vật người ta sử dụng đơn vị đo cường độ ánh sáng là PPF (photosynthesis photon flux), tính bằng µmol m-2 s-1, nghĩa là số lượng photon tham gia trong quá trình quang hợp đồng thời cũng tham gia trong quá trình phát sinh hình thái, tính trên đơn vị diện tích 1 m2 lá trong thời gian 1 giây Chất lượng ánh sáng (light quality), thời gian chiếu sáng (photoperiod) và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô

Cường độ ánh sáng mà cây hấp thụ được là rất quan trọng và được tính toán ở

khoảng ngang với cây Tuy nhiên, cũng có những báo cáo tính theo cường độ ánh

sáng bên ngoài, phía trên hộp nuôi cấy hoặc trên kệ trống của phòng sáng Kozai và

cộng sự (1995) nhận định rằng, cường độ ánh sáng trên kệ trống xấp xỉ gấp 2 lần

cường độ ánh sáng ở mức ngang với cây trong bình, do đó loại vật liệu được dùng

để làm hộp và nút đậy bình phải đảm bảo cho những ánh sáng khác nhau đi qua

Để sự quang hợp của cây là tối đa, trong nuôi cấy thoáng khí và quang tự dưỡng

(từ 200-300 µmol m-2 s-1) Tuy nhiên khi cường độ ánh sáng cao sẽ làm tăng nhiệt

độ trong những bình nuôi cấy, làm thay đổi môi trường xung quanh cây, ảnh hưởng

lên sự tăng trưởng và phát triển của cây Do đó, khi sử dụng ánh sáng cao, cần có

biện pháp để giảm tối đa sự tăng của nhiệt độ (Nguyễn Thị Quỳnh và Kozai, 1998)

٭ Nhiệt độ

Nhiệt độ phòng nuôi cây thường được điều chỉnh ổn định từ 24 – 25oC, vì nhiệt

độ bên trong bình nuôi cấy thường cao hơn 2oC so với nhiệt độ của phòng nuôi do

tác động của hiệu ứng nhà kính

٭ Giá thể

Việc sử dụng thạch hay gelrite trong môi trường nuôi cấy có thể kìm hãm sự

phát triển rễ của cây in vitro do môi trường thiếu thông thoáng khiến hệ rễ và hệ

thống bó mạch kém phát triển, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn thuần hóa khi đưa cây

ra vườn ươm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc thay thế thạch bằng các loại

giá thể có cơ cấu xốp như vermiculite, sợi cellulose, rockwool sẽ giúp môi trường

xung quanh hệ rễ được thông thoáng, nhờ vậy rễ phát triển mạnh hơn giúp cây hấp

thu nước và muối khoáng trong môi trường dễ hơn (Fujiwara và Kozai, 1995)

Yulan Xiao và Toyoki Kozai (2006) sử dụng hộp Magenta nuôi cấy chồi cây

Limonium latifolium trên môi trường MS không đường với số lần trao đổi khí trong

bình là 3,8 lần/h, cường độ ánh sáng là 100 μmol m-2 s-1 và nồng độ CO2 trong

phòng nuôi cấy là 1500 μmol mol-1 Bố trí thí nghiệm với 3 nồng độ BA 0; 0,25 và

0,5 mg/l và sử dụng hai loại giá thể là thạch và Florialite Hai ông đã nhận thấy rằng

diện tích lá, hàm lượng Clo-rô-phin, cường độ quang hợp của các cây trong môi trường không đường bổ sung 0,25 mg/l BA và giá thể Florialite tăng rõ rệt Khi tăng nồng độ BA thì số lượng chồi tăng nhưng diện tích lá, khối lượng khô, cường độ quang hợp của cây giảm

٭ Ảnh hưởng của nhân tố khoáng

Chất khoáng là một trong những nhóm chất dinh dưỡng quan trọng cần cho sự

phát triển của cây in vitro Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ thuộc

nhiều vào loại cây thí nghiệm Môi trường Murashige và Skoog (1962) là môi trường phổ biến nhất vì hầu hết các loài cây có thể thích nghi được Tuy nhiên, chúng ta cần lưu ý rằng dung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển vì nồng độ muối khoáng trong dung dịch quá cao

Ví dụ cây Đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro (Pierik và Seger,

1972) Lloyd và McCowm (1980) đã tìm ra môi trường thích hợp cho một số loài thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium)

Khi lựa chọn sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng cần chú ý những vấn

mM l-1 Hầu hết các cây ưa thích NO3- hơn NH4+ tuy nhiên cũng có một số trường hợp ngoại lệ Chúng ta cần tìm ra tỷ lệ NO3-/NH4+ thích hợp cho sự sinh trưởng phát

2.2.3.3 Ảnh hưởng của các chất kích thích tăng trưởng lên sự hình thành

● Auxin

٭ Tác dụng sinh l ý của auxin

Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt…Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động lên sự giãn của thành tế bào: IAA gây ra sự giảm pH trong thành

tế bào, hoạt hóa enzim phân hủy các polysacarit liên kết giữa các sợi xenluloz làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kện cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu không bào trung tâm Ngoài ra auxin cũng kích thích lên thành tế bào đặc biệt là xenluloz, pectin, hemixenluloz Bên cạnh đó auxin còn ảnh hưởng lên sự phân chia của tế bào Tuy nhiên các ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và phân chia của thành tế bào trong mối tác động tương hỗ với các phytohoocmon khác (Giberelin, cytokinin)

Auxin gây ra tính hướng động của cây, auxin gây ra hiện tượng ưu thế ngọn, auxin kích thích sự hình thành rễ: trong sự hình thành rễ đặc biệt là rễ phụ hiệu quả của auxin là rất đặc trưng Sự hình thành rễ phụ có thể chia ra làm 3 giai đoạn:

giai đoạn đầu là phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh; tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài

Để khởi xướng sự phản phân hóa của tế bào mạnh mẽ thì cần hàm lượng auxin khá cao Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin hơn nếu hàm lượng auxin cao sẽ

có tác dụng gây ức chế sự phát triển của rễ Vai trò của auxin trong sự phân hóa rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô, trong kỹ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc Auxin kích thích sự hình thành, sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt Auxin kiềm hãm sự rụng lá, tăng sự tạo quả và phòng rụng nụ, quả non, làm tăng năng suất cây trồng Auxin ảnh hưởng lên sự vận động của nguyên sinh chất, tăng tốc độ lưu động của nguyên sinh chất, ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất: kích thích sự tổng hợp các polyme

và ức chế sự phân hủy của chúng, ảnh hưởng đến các hoạt động như quang hợp, hô hấp, sự vận chuyển các chất trong cây Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh được thực vật tổng hợp và auxin tổng hợp do con người tạo ra

٭ Cơ chế tác dụng của auxin lên sự sinh trưởng của cây

Cơ chế tác dụng của auxin chủ yếu là tác dụng lên sự giãn của các tế bào: sự giãn của các tế bào thực vật xảy ra do hai hiệu ứng: sự giãn của thành tế bào và sự tăng thể tích, khối lượng nguyên sinh chất Đã từ lâu người ta phát hiện ra hiện tượng “sinh trưởng acid” tức là trong điều kiện pH thấp (pH=5) thì sự sinh trưởng của tế bào và mô được kích thích Điều này do ion H+ đã hoạt hóa enzim phân giải các cầu nối ngang polysacarit giữa các sợi xenluloz với nhau làm cho các sợi xenluloz tách rời nhau và rất dễ trượt lên nhau Dưới ảnh hưởng của sức trương tế bào do không bào hút nước vào mà các sợi xenluloz đã mất liên kết, lỏng lẻo rất dễ trượt lên nhau làm cho thành tế bào giãn ra Vai trò của auxin ở đây là gây nên sự thay đổi pH cho thành tế bào, bằng cách hoạt hóa bơm proton (H+) nằm trên màng sinh chất

Các loại auxin tổng hợp thông dụng thường dùng: IAA, IBA, NAA, 2,4-D Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính axit có trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình

thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi

nách và sự hình thành phôi soma trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng

Chúng được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa và ở trên

các quả còn non Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự

phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trong

quá trình vận chuyển này, chúng bị oxi hóa do hoạt động của auxin – oxydase, điều

này cho thấy các nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng

Như vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc

ở phát hoa để đảm bảo cho sự nhân giống và kéo dài tế bào

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ từ các đoạn cắt (Erwin và cộng sự, 1997)

● Cytokinin

Cytokinin là nhóm phytohoocmon thứ ba được phát hiện sau auxin và giberelin

٭ Tác dụng sinh l ý của cytokinin

Hiệu quả sinh l ý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự

phân chia tế bào mạnh mẽ Có được hiệu quả này là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ

sự tổng hợp acid nucleic và protein

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực

vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân bằng

tỷ lệ giữa auxin và cytokinin có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình

thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn Nếu tỷ lệ auxin cao

hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích

sự xuất hiện và phát triển của chồi Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ

cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro

Cytokinin có khả năng kiềm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây nguyên

vẹn Cytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và củ

Vì vậy nếu xử l ý cytokinin cũng có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ và

chồi

Ngoài ra trong mối tương tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây Cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều Chính vì vậy mà từ rễ (cơ quan tổng hợp cytokinin) lên chồi ngọn (cơ quan tổng hợp auxin) thì hiện tượng ưu thế ngọn càng tăng dần tương ứng với sự tăng hàm lượng auxin và giảm hàm lượng cytokinin

Cytokinin còn ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất như quá trình sinh tổng hợp

acid nucleic, protein, clorophin và do đó ảnh hưởng đến các hoạt động sinh l ý của

cây

٭ Cơ chế tác dụng của cytokinin lên sự sinh trưởng của cây

Cytokinin tác động lên quá trình phân hóa tế bào, đến các quá trình phát sinh cơ quan, kìm hãm sự hóa già, có lẽ ở mức độ phân tử Nhưng cơ chế tác động của nó chưa sáng tỏ một cách hoàn toàn Khi thiếu cytokinin thì tế bào không phân chia được mặc dù ADN có thể tiếp tục được tổng hợp nhưng quá trình tổng hợp protein không xảy ra Vì vậy, cytokinin kiểm tra sự tổng hợp protein ở giai đoạn từ dịch mã (mARN)

Hiệu quả của cytokinin trong việc ngăn chặn sự hóa già có liên quan nhiều đến khả năng ngăn chặn sự phân hủy protein, acid nucleic và clorophin hơn là khả năng kích thích tổng hợp chúng Có lẽ cytokinin ngăn chặn sự tổng hợp mARN điều

khiển sự tổng hợp nên các enzim thủy phân

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào

và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi

cấy in vitro [8], [9], [13]

2.2.3.4 Các chất gây độc từ mẫu cấy

Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô non

Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là acid Eucomic và Tyramine Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:

- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,

đặc biệt có hiệu quả trên các loài Phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aerides với

nồng độ thường dùng 0,1-0,3% Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác

- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau

- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như acid ascorbic, acid citric, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol

Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:

- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non

- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic, acid citric vài giờ trước khi cấy

- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần

2.2.3.5 Hiện tượng thủy tinh thể

Những cây thân thảo và thân gỗ nhân giống in vitro thường xuyên bị ảnh hưởng

bởi sự dư thừa của nhiều nhân tố nuôi cấy Điều này dẫn đến sự rối loạn biến dưỡng

và hình thái Những bất thường về hình thái giải phẫu và sinh lý trong nuôi cấy mô

đã được miêu tả bằng rất nhiều thuật ngữ: hiện tượng thủy tinh thể, sự tích lũy nước quá mức, sự mọng nước và hiện tượng trong vắt như thủy tinh Mặc dù vậy, thuật ngữ “Vitrification” là thuật ngữ chính vì nó đề cập được một quá trình sinh lý chứ không phải là một quá trình sinh học, nó là thuật ngữ được dùng nhiều nhất để diễn

tả sự thay đổi của lá dẫn đến hiện tượng thủy tinh thể Một vài đặc điểm có thể thấy rất rõ trên lá của cây Cẩm chướng: sự rối loạn mà nó biểu hiện chủ yếu trên lá, tác

động lên hai quá trình chính được thực hiện bởi lá, đó là sự quang hợp và sự trao

đổi khí (CO2, hơi nước) (Ziv, 1991) Sự bất thường về hình thái giải phẫu cũng

được biểu hiện với mức ít phổ biến hơn trên thân và rễ Những rối loạn tiếp tục

ngăn cản những cây vi nhân giống có thể phát triển trong điều kiện ex vitro

Các điều kiện đặc biệt cần thiết cho việc nhân nhanh chồi in vitro như độ ẩm

cao, dư thừa chất dinh dưỡng, có mặt các chất khoáng, đường và các chất kích thích

sinh trưởng ở nồng độ cao, cường độ ánh sáng thấp là nguyên nhân chính được

chứng minh là có khả năng cảm ứng việc hình thành những chồi biến dị Những

bằng chứng hiện nay xác định rằng độ ẩm tương đối và thế nước là những nhân tố

chủ yếu tham gia vào quá trình phát sinh hình thái bất thường trong điều kiện

in vitro (Ziv, 1991)

Hiện tượng thủy tinh thể có thể xảy ra cả ở trong môi trường rắn cũng như môi

trường lỏng (Debergh, 1983) Hiện tượng này đặc biệt phổ biến nếu cây có quá

nhiều lượng nước sẵn có, điều này thường thấy ở trường hợp nuôi cấy trong môi

trường lỏng hay môi trường có hàm lượng thạch thấp (Debergh và cộng sự, 1981)

Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều

người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi

cấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh

sáng, trao đổi khí) thích hợp [13], [1], [2]…

2.3 Các nghiên cứu trước đây về cây Cẩm chướng

Các tác giả Lê Đức Thảo, Nguyễn Thị Kim Lý (Viện Di truyền nông nghiệp),

Hoàng Ngọc Thuận (Trường ĐH Nông nghiệp I) ( năm 2008) đã thực hiện nghiên

cứu quy trình nhân giống hoa Cẩm chướng SP1 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế

bào nhằm nhân nhanh, đưa giống cây này phát triển ra sản xuất

Nghiên cứu tiến hành với mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh và chồi nách của giống

cẩm chướng SP1 (Dianthus caryophyllus Topaz), được cấy vào môi trường MS

(Murashige & Skoog) có bổ sung 2% đường, 6,5g/l agar

Môi trường tái sinh chồi và nhân nhanh là MS, pH 5,8-60, 10% nước dừa, 6,5g/l agar, 2% đường Điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 25-280C, ánh sáng 1500-2000 Lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày

Môi trường MS có bổ sung NAA được sử dụng để ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Cát sạch, hạt perlite, đất sông, đất màu, rễ bèo phơi khô được dùng để làm giá thể khi đưa ra vườn ươm

Kết quả cho thấy, mẫu được khử trùng với HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ sống sau 3 tuần cao nhất (78%)

Môi trường MS + 10% nước dừa +6,5 g/l agar + 3% đường bổ sung BAP 1mg/l + Kinetin 0,5 mg/l đạt hệ số nhân cao nhất 7,52 lần

Môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS/2 +6,5 g/l agar +2% đường bổ sung NAA 0,2 mg/l cho tỷ lệ cây sống ra rễ cao nhất đạt 93,11% sau 1 tháng

Tỷ lệ cây sống sau khi đưa ra vườn ươm với giá thể hỗn hợp gồm hạt perlite 30% + cát sông 10% + đất màu 10% + rễ bèo phơi khô xay nhỏ 50% đạt cao nhất

51,56% sau 3 tuần Với giá thể B khi phun Pomior 0,3%, sau 3 tuần tỷ lệ cây đạt

tiêu chuẩn xuất vườn là 64,81% Pomior là loại Phân bón lá cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng đa lượng, trung lượng, vi lượng và các axit amin quan trọng nhất trong cây, tăng hiệu suất quang hợp, tiết kiệm 10% phân hữu cơ và các loại phân

khoáng đa lượng nhằm bảo vệ môi trường nông nghiệp bền vững [12]

2.4 Một số loài hoa Cẩm Chướng trồng phổ biến ở Việt Nam

Hiện nay, ở nước ta đã tiến hành trồng được 3 loài Dianthus làm hoa cảnh tại

Đà Lạt là Dianthus barbatus L., D.sinensis L và D.caryophyllus L Cây hoa Cẩm

chướng phát triển ở vùng có độ cao khác nhau tuy nhiên chất lượng hoa khác nhau

Vì vậy, tùy thuộc nên phổ biến cho người trồng hoa biết thêm những đặc điểm về các loài hay giống Cẩm chướng này để trồng cho phù hợp Cụ thể là các loài sau:

● Loài Sweet William, D.barbatus

● Loài Hồng trinh nữ Maiden Pink, D.deltoides

Đây là loài cẩm chướng duy nhất mọc tốt

được khi ít ánh nắng mặt trời, nửa ngày bóng

râm; cũng chịu lạnh khá giỏi và là loài đa

niên Thân có hoa cao chừng 12-30cm, lá

ngắn Hoa rộng 2cm, mọc ở thân xẻ nhiều

cành, bìa cánh hoa răng cưa nhọn, màu sắc

hồng lợt đến hồng đậm, có khi màu tím hay

trắng lốm đốm màu sắc lợt khác

Hình 2.3 Dianthus deltoides

● Loài cheddar Pink, D.gratinanopolitanus (D.caesius)

Là loài đa niên, mọc như ụ nhỏ,

dày, lá màu xanh dương xám, thân chia

nhánh yếu đuối, dài 30cm, mọc thẳng

đứng Hoa thơm ngào ngạt, màu hồng,

cánh hoa răng cưa

Hình 2.4 Dianthus gratinanopolitanus

● Loài hồng đá – Rock Pink, Dianthus pavonius (D.neglectus),

Đây là cây cẩm chướng vườn đá

nhỏ nhất, đa niên Lá hẹp, xanh lục, dài

● Loài hồng thôn dã- Cottage Pink, Dianthus plumatus đa niên

Đây là loài cẩm chướng diễm

kiều, đã trồng nhiều ở thế kỷ ở Âu Mỹ

và được chọn làm giống để lai thành

nhiều giống khác nhau Điển hình là

một thảm lá nhỏ rời rạc xanh lục Thân

cho hoa cao 25-50cm, hoa thơm mùi

gia vị, đơn hay kép, cánh hoa tua viền,

hồng hay trắng tâm đậm

Hình 2.6 Dianthus plumatus

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 21/9/2009 đến 30/12/2009, tại phòng Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Tôn Đức Thắng TPHCM

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vật liệu dùng trong thí nghiệm này là hạt của cây Cẩm chướng

Hạt được rửa với nước xà phòng loãng, sau đó rửa lại bằng nước máy 3 lần Bằng thao tác vô trùng trong tủ cấy, ngâm hạt 1 phút trong ethanol 70% Rửa hạt sạch ethanol bằng nước cất Sau đó ngâm hạt 10 phút trong dung dịch javel (Mỹ Hảo) với tỉ lệ Javel: nước (3:1) Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3-4 lần Hạt sau khi khử trùng, tiến hành cho nảy mầm trong ống nghiệm Các cây trong ống nghiệm có nguồn gốc từ hạt được dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm sau này

3.2.2 Trang thiết bị thí nghiệm

Thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH

Dụng cụ: pince, dao cấy, lọ thủy tinh, erlen, đèn cồn, pipette, ống đong, petri

Môi trường được chỉnh về pH 5,8

Môi trường được hấp khử trùng ở 121o C, 1 atm trong 20 phút

3.3 Phương pháp thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi nghiệm thức được lặp lại

3 lần

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên quá trình phát sinh chồi

cây Cẩm chướng in vitro 3.3.1 Mục đích thí nghiệm

Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA thích hợp cho sự hình thành

chồi cây Cẩm chướng in vitro

3.3.1.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

Cây Cẩm chướng in vitro được tiến hành cắt để lấy phần gốc ( 1-1,5 cm) có

mang 2 lá mầm và cấy trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ từ 0,5 đến

2,0 mg/l (Bảng 3.1.)

Bảng 3.1 Môi trường phát sinh chồi cây Cẩm chướng in vitro có bổ sung

BA ở nồng độ khác nhau Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l)

C0 (ĐC) 0,0 C1 0,5 C2 1,0 C3 1,5 C4 2,0