Ứng dụng hệ thống nuôi cây ngập chìm tạm thời Plantima trong nhân giống vô tính in vitro cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  BÙI TRỌNG HẢI ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TEMPORARY IMMERSION SYSTEM- TIS) TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO CÂY LAN HỒ ðIỆP (PHALAENOPSIS) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI -2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  BÙI TRỌNG HẢI ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TEMPORARY IMMERSION SYSTEM - TIS) TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO CÂY LAN HỒ ðIỆP (PHALAENOPSIS) CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.NGND. NGUYỄN QUANG THẠCH TS. HOÀNG THỊ NGA HÀ NỘI -2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi cũng xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Bùi Trọng Hải Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn này tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh ñạo, các tập thể và cá nhân. Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS NGND Nguyễn Quang Thạch, TS Hoàng Thị Nga ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp ñỡ tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Ban Quản lý ñào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học, các cán bộ và nhân viên Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học nông nghiệp - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi, giúp ñỡ tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh ñạo Trung tâm Khoa học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh, nơi tôi làm việc và công tác, ñã tạo ñiều kiện về mặt thời gian và vật chất, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình tôi làm việc và thực hiện ñề tài nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia ñình, người thân và bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài. Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Tác giả luận văn Bùi Trọng Hải Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục các chữ viết tắt viii MỞ ðẦU 0 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu chung về lan Hồ ñiệp 4 1.1.1 Nguồn gốc và phân bố 4 1.1.2 Phân loại thực vật học 6 1.1.3 ðặc ñiểm hình thái 6 1.2 Tình hình phát triển lan Hồ ñiệp trên thế giới và ở Việt Nam 8 1.2.1 Trên thế giới 8 1.2.2 Ở Việt Nam 10 1.3 Các nghiên cứu về nhân giống lan Hồ ñiệp 12 1.3.1 Nhân giống hữu tính 12 1.3.2 Nhân giống vô tính 14 1.4 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary immersion system -TIS)17 1.4.1 Giới thiệu chung 17 1.4.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản của hệ thống 18 1.4.3 Phân loại 19 1.4.4 Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tiêu biểu 20 1.4.5 Một số ứng dụng trong vi nhân giống 23 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 1.4.6 Những ưu ñiểm và nhược ñiểm của hệ thống ngập chìm tạm thời. 29 Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 ðối tượng nghiên cứu 31 2.2 Vật liệu nghiên cứu 31 2.3 Nội dung nghiên cứu 32 2.3.1 Thiết lập ñiều kiện nuôi cấy vô trùng và khởi ñộng quá trình nuôi cấy trên hệ thống Plantima. 32 2.3.2 Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima 32 .3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự nhân nhanh protocorm 33 2.3.3 Khảo sát quá trình tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh trên hệ thống Plantima. 34 2.3.4 So sánh hiệu quả nhân giống bằng hệ thống Plantima só với các hệ thống khác (ñặc, lỏng tĩnh, lỏng lắc) 34 2.4 Phương pháp nghiên cứu 35 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 35 2.4.2 Chuẩn bị môi trường 35 2.4.3 ðiều kiện thí nghiệm 35 2.4.4 Chỉ tiêu theo dõi 35 2.4.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 36 2.4.6 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 36 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Thiết lập ñiều kiện nuôi cấy vô trùng và khởi ñộng quá trình nuôi cấy trên hệ thống Plantima. 37 3.1.1 Tạo vật liệu khởi ñầu cho quá trình nuôi cấy 37 3.1.2 Thiết lập ñiều kiện nuôi cấy vô trùng cho hệ thống Plantima 39 3.2 Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima 42 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 3.2.1 Xác ñịnh môi trường nuôi cấy tối ưu ñể nhân nhanh protocorm 42 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật ñộ nuôi cấy lên sự nhân nhanh protocorm45 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường nuôi cấy lên sự nhân nhanh protocorm 48 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân nhanh protocorm. 51 3.3 Khảo sát quá trình tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh trên hệ thống Plantima 53 3.3.1 Xác ñịnh môi trường nuôi cấy tối ưu cho quá trình tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. 53 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các thông số hoạt ñộng của hệ thống Plantima ñến sự tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. 55 3.4 So sánh hiệu quả nhân nhanh protocorm trên hệ thống tis so với các hệ thống nuôi cấy khác (thạch, lỏng tĩnh, lỏng lắc) 59 3.4.1 So sánh, ñánh giá hiệu quả nhân nhanh protocorm của hệ thống Plantima so với một số hệ thống nuôi cấy khác 59 3.4.2 Xác ñịnh giai ñoạn sử dụng hệ thống TIS hiệu quả trong quy trình nhân giống. 61 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 63 1 Kết luận 63 2 ðề nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 70 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng của BAP và α-NAA lên sự nhân nhanh protocorm (Sau 6 tuần nuôi cấy) 43 3.2 Ảnh hưởng của mật ñộ mẫu cấy ñến sự nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima (sau 6 tuần nuôi cấy) 45 3.3 Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên việc nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima 48 3.4 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima (sau 6 tuần nuôi cấy) 51 3.5 Ảnh hưởng của chất phụ gia hữu cơ ñến quá trình tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh (sau 6 tuần nuôi cấy) 55 3.6 Ảnh hưởng của mật ñộ nuôi cấy lên sự tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh trên hệ thống Plantima (sau 6 tuần nuôi cấy) 56 3.7 Chất lượng sinh trưởng- phát triển của chồi lan Hồ ñiệp trên hệ thống ngập chìm tạm thời (sau 2 thành nuôi cấy) 57 3.8 So sánh hiệu quả nhân nhanh và chất lượngProtocorm hình thành trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau 59 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sự ña dạng và phong phú về màu sắc, hình dáng Lan Hồ ðiệp 5 1.2 Hình thái cây lan Hồ ñiệp 6 1.3 Keiki hình thành trên phát hoa của Lan Hồ ñiệp 15 1.4 Hệ thống ngập chìm tạm thời RITA ® 21 1.5 Hệ thống bình ñôi BIT ® 22 1.6 Các thành phần của hệ thống Plantima 22 1.7 Hệ thống Plantima với thiết bị ñiều khiển chu kỳ ngập chìm 23 2.1 Hồ ñiệp Pha.Sogo Yukidian'V3' 31 3.1 Phát sinh hình thái tạo chồi bất ñịnh (b& c) từ mắt ngủ phát hoa (a) 38 3.2 Các protocorm - Thể tiền chồi (b) phát sinh từ mô lá (a) của chổi bất ñịnh (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 3.3 Lắp ñặt, vận hành khởi ñộng hệ thống Plantima 40 3.3 Ảnh hưởng của chất ðTSH lên quá trình nhân nhanh protocorm 44 3.4 Ảnh hưởng của mật ñộ mẫu cấy lên sự nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima (sau 6 tuần nuôi cấy) 47 3.5 Ảnh hưởng của thế tích môi trường nuôi cấy lên sự nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima. 50 3.6 Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân nhanh protocorm 53 3.7 Chồi tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường ñược bổ sung 50g/l KT + 50 g/l CR (CT tối ưu) 55 3.8 Sự sinh trưởng và phát triển của chồi lan Hồ ñiệp trên hệ thống nuôi cấy ngập chìn tạm thời Plantima 58 3.9 Chất lượng protocorm hình thành trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau 60 3.10 Sơ ñồ quy trình nhân giống vô tính in vitro lan Hồ ñiệp trên hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima 62 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6- Benzyl Amino Purine C : Chuối CR : Cà rốt CT : Công thức 2,4-D : 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid Ki : Kinetin (6-Furfuryl amino purine) ðC : ðối chứng ðK : ðường kính (ðường saccharose) ðTST : ðiều tiết sinh trưởng HSN : Hệ số nhân MS : Murashige & Skoog, 1962 α-NAA : 1- Naphtalene Acetic Acid ND : Nước dừa KC : Knudson C, 1965 KT : Khoai tây Protocorm : Thể tiền chồi (Protocorm Like Bodies) THT : Than hoạt tính TIS Hệ thống ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System) VW : Vacin & Went, 1949 [...]... vitro cây lan H ñi p (Phalaenopsis) M c ñích - yêu c u * M c ñích Kh o sát, ñánh giá kh năng ng d ng c a h th ng ng p chìm t m th i Plantima trong vi c c i thi n h s nhân nhanh cũng như ch t lư ng cây gi ng trong quy trình nhân gi ng vô tính in vitro lan H ñi p * Yêu c u - L p ñ t và thi t l p ñư c ñi u ki n nuôi c y vô trùng trên h th ng ng p chìm t m th i Plantima - Xác ñ nh ñư c môi trư ng nuôi. .. ng h th ng nuôi c y ng p chìm t m th i trong nhân gi ng vô tính in vitro lan H ñi p Vi t Nam T k t qu này có th áp d ng sang cho nh ng ñ i tư ng cây tr ng khác - Ý nghĩa th c ti n ng d ng h th ng ng p chìm t m th i trong vi nhân gi ng vô tính hoa lan nư c ta là m t công ngh m i, vi c ng d ng thành công công ngh này s m ra tri n v ng trong vi c s n xu t qui mô công nghi p, ñáp ng ñ lư ng cây gi ng v... ño n nuôi c y trên h th ng ng p chìm t m th i Plantima Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 2 - Xác ñ nh ñư c các thông s v n hành t i ưu cho h th ng ng p chìm t m th i Plantima: M t ñ nuôi c y, th tích môi trư ng nuôi c y, chu kỳ ng p chìm ñ n kh năng nhân nhanh protocorm và ch i in vitro - So sánh, ñánh giá hi u qu nhân gi ng c a h th ng ng p chìm t m th i Plantima. .. nghi p 22 Hình 1.7: H th ng Plantima v i thi t b ñi u khi n chu kỳ ng p chìm 1.4.5 M t s ng d ng trong vi nhân gi ng 1.4.5.1 Trên th gi i H th ng ng p chìm t m th i là m t trong nh ng phương pháp vi nhân gi ng ñ y tri n v ng trong s n xu t cây gi ng thương m i a, Trong s nhân nhanh ch i và các ño n c t in vitro S ng p chìm t m th i kích thích s n y ch i H th ng này cho phép s sinh trư ng liên t c c a ch... khi nhân gi ng trên h th ng nuôi c y thông thư ng N m m c ñích kh o sát kh năng ng d ng c a h th ng nhân gi ng m i này so v i các h th ng nuôi c y truy n th ng, góp ph n ñ y m nh vi c s n xu t cây gi ng v i s lư ng l n, có ch t lư ng t t và giá ñáp ng yêu c u c a th c ti n s n xu t Chúng tôi ti n hành th c hi n ñ tài: “ ng d ng h th ng nuôi c y ng p chìm t m th i Plantima trong nhân gi ng vô tính in vitro. .. p chìm t m th i ñã ñư c ch ng minh thành công hơn trong nuôi c y phát sinh phôi khi ñư c so sánh v i các h th ng thông thư ng s d ng môi trư ng r n hay nuôi c y huy n phù trong bình tam giác - Tisserat và Vandercook (1985) th ng kê s sinh trư ng c a phôi cây cà r t và cây chà là (Phoenix dactylifera) trong h th ng APCS trong ñó th i gian ng p chìm là 5 - 10 phút sau m i 2 gi So sánh v i nh ng cây nuôi. .. ch i in vitro trên môi trư ng r n r t h n ch do s sinh trư ng ch m c a ch i H s nhân x p x 6 - 7 l n trong 3 tháng (Sondhal và c ng s , 1989) Khi s d ng h th ng RITA® h s nhân tương t có th ñư c ñ t t i ch trong vòng 5 - 6 tu n (Berthouly và c ng s , 1995) b, Trong s t o c bi in vitro S sinh trư ng và s hình thành c bi (mini tuber) khoai tây Solanum tuberosum L ñư c ñ y m nh b i tình tr ng ng p chìm. .. n xu t lan l n trong khu v c 1.3 Các nghiên c u v nhân gi ng lan H ñi p 1.3.1 .Nhân gi ng h u tính Nhân gi ng H ñi p b ng h t là phương pháp thư ng dùng hi n nay ñ s n xu t cây gi ng hàng hoá Cây con m c t h t g i là cây gi ng th c sinh Lan H ñi p thư ng thư ng ph i th ph n nhân t o m i k t h t ñư c Nhưng h t phát d c không hoàn ch nh, không có phôi nhũ, ch có l p v h t r t m ng, gieo tr ng trong ñi... ng cây gi ng vô tính t nuôi c y mô phân sinh thì Vi t Nam k thu t nhân gi ng H Ði p ph bi n hi n nay v n là nhân gi ng h u tính (gieo h t in vitro) trên môi trư ng th ch, v i nhi u h n ch nh hư ng ñ n ch t lư ng cây gi ng cũng như giá thành s n ph m Gi ng cho s n xu t hi n nay v n ch y u ph i nh p n i v i giá thành cao, b ñ ng, khó ki m soát ñư c ch t lư ng cũng như nguy cơ lây lan d ch h i H th ng nuôi. .. m m Năm 1922, Knudson – ngư i M - phát minh ra phương pháp gieo h t trong ñi u ki n vô trùng và có th thu ñư c m t s lư ng l n các cây lan hoàn ch nh thông qua nuôi c y mô t bào S thành công này ñã thúc ñ y quá trình ch n gi ng lan cũng như vi c s n xu t cây gi ng và tr ng cây lan theo mô hình công nghi p Gieo h t trong ñi u ki n vô trùng, h t s n y m m theo 1 trong 2 phương th c sau: - D ng th nh t . ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TEMPORARY IMMERSION SYSTEM - TIS) TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO CÂY LAN HỒ ðIỆP (PHALAENOPSIS) CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC. nhân giống của hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima so với các hệ thống nhân giống khác: thạch, lỏng tĩnh, lỏng lắc. Qua ñó xác ñịnh ñược giai ñoạn sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima. Plantima trong nhân giống vô tính in vitro cây lan Hồ ñiệp (Phalaenopsis) Mục ñích - yêu cầu * Mục ñích Khảo sát, ñánh giá khả năng ứng dụng của hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima trong việc