1.4.5.1. Trên thế giới
Hệ thống ngập chìm tạm thời là một trong những phương pháp vi nhân giống ựầy triển vọng trong sản xuất cây giống thương mại.
a, Trong sự nhân nhanh chồi và các ựoạn cắt in vitro
Sự ngập chìm tạm thời kắch thắch sự nảy chồi. Hệ thống này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà không cần phải cấy chuyển mẫu cấy. Chồi thu ựược khi nuôi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và có chất lượng tốt hơn so với những chồi thu ựược trên môi trường bán rắn.
Một chứng minh ựầy ựủ và thuyết phục về tắnh hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia tăng số lượng chồi khi nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng chuối (Musa, phụ nhóm AAH). đồng thời Alvard và cộng sự
(1993) chứng minh rằng sử dụng môi trường lỏng tác ựộng mạnh mẽ vào sự
phát triển và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân giống chuối.
- Chồi chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng ựơn giản hay trên giá thể bằng cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 24
- Chồi trên môi trường bán rắn có sự ngập một phần và trong môi trường lỏng có sục khắ có hệ số nhân chồi từ 2,2 - 3,1 lần.
- Hệ số nhân chồi cao nhất (>5 lần) thu ựược trên mẫu nuôi cấy trong ựiều kiện nuôi cấy ngập chìm tạm thời.
Các tác giả này ựã thu ựược kết quả trên khi sử dụng hệ thống RITAệ với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Một nhóm nhà nghiên cứu của Cuba cũng thu ựược kết quả tương tự trên ựối tượng cây Chuối Musa
acuminata khi sử dụng hệ thống bình ựôi (Teisson và cộng sự, 1999).
Tương tự như vậy, Escalona và cộng sự (1999) ựã sử dụng hệ thống trên ựể nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy nuôi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọng lượng khô sau 42 ngày nuôi cấy. Hệ số nhân ựược gia tăng khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường rắn. Có gần 5.000 cây Ananas comosus thu ựược từ một hệ thống như vậy.
đối với cây cà phê (Coffea arabica và C. canephora), nhân giống bằng cách cắt chồi in vitro trên môi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi. Hệ số nhân xấp xỉ 6 - 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự,
1989). Khi sử dụng hệ thống RITAệ hệ số nhân tương tự có thể ựược ựạt tới chỉ trong vòng 5 - 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995).
b, Trong sự tạo củ bi in vitro
Sự sinh trưởng và sự hình thành củ bi (mini tuber) khoai tây Solanum
tuberosum L. ựược ựẩy mạnh bởi tình trạng ngập chìm tạm thời trong hệ
thống bình ựôi (Akita và Takayama, 1994). Số củ bi hình thành xấp xỉ 500 - 960 củ sau 10 tuần nuôi cấy, nhiều hơn những kết quả trong các công trình trước ựó (chỉ khoảng 220 củ trong một lần nuôi cấy (Akita và Takayama,
1993). Trọng lượng tổng số và tắnh ựồng nhất của củ cũng ựược gia tăng.
Ngược lại, trong ựiều kiện nuôi cấy ngập liên tục, không thấy bất cứ sự hình thành củ nào. Teisson và Alvard (1999) ựã kiểm chứng lại hiệu quả của
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 25
nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sự tạo củ bi khoai tây bằng cách tiến hành thắ nghiệm trên hệ thống RITAệ ựôi dựa trên nguyên tắc hệ thống bình ựôi: 3 củ bi ựược hình thành trên 1 ựốt thân trong 10 tuần nuôi cấy, 50% củ có trọng lượng lớn hơn 0,5 g. Hệ thống này rất có hiệu quả và nhanh chóng do có từ 3 ựến 4 chồi nảy lên từ một củ.
c, Trong sự phát sinh phôi
* Gia tăng sự phát sinh phôi:
- Các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ựã ựược chứng minh thành công hơn trong nuôi cấy phát sinh phôi khi ựược so sánh với các hệ thống thông thường sử dụng môi trường rắn hay nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác.
- Tisserat và Vandercook (1985) thống kê sự sinh trưởng của phôi cây
cà rốt và cây chà là (Phoenix dactylifera) trong hệ thống APCS trong ựó thời gian ngập chìm là 5 - 10 phút sau mỗi 2 giờ. So sánh với những cây nuôi cấy trên môi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp cây cà rốt, và 4,0 lần ựối với cây chà là trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Thêm vào ựó chất lượng cũng như số lượng của phôi soma và cây con cà rốt ựược nâng lên.
* Sự phát triển phôi:
- Quy trình nhân và chất lượng của phôi soma trên nhiều ựối tượng khác nhau ựã ựược cải tiến bằng nuôi cấy ngập chìm tạm thời.
- đối với cây cao su Hevea brasiliensis sự hình thành phôi soma trên môi trường rắn cho kết quả rất thấp và số lượng cũng như chất lượng phôi soma không ựáng kể (Etienne và cộng sự, 1997). Sự tạo phôi soma trong nuôi cấy ngập chìm tạm thời gấp ựến 4 lần so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn với hơn 400 phôi/g trọng lượng tươi của mẫu nuôi cấy phát sinh phôi.
- Nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng giúp giảm số lượng phôi bị bất thường xuống còn phân nửa cũng như giúp gia tăng tỷ lệ phôi phát triển lên tiếp. Hệ thống này có thể giúp tỷ lệ nảy mầm của phôi lên tới trên 60%, tỷ lệ
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 26
hình thành trụ trên lá mầm là 35%. Theo Teisson và cộng sự (1999) gần 150 phôi soma cây cao su ở giai ựoạn có lá mầm ựã thu ựược trong một hệ thống RITAệ từ tuần thứ tư ựến tuần thứ tám sau khi bắt ựầu chuyển giai ựoạn phát sinh phôi vào trong hệ thống này.
- Tuy nhiên, ựể tái sinh thành cây hoàn chỉnh, những phôi nảy mầm cần ựược chuyển vào trong môi trường bán rắn do khi cây phát triển thành phần ngọn và phần gốc, ựòi hỏi phải ựặt cây con luôn ựứng thẳng hướng lên trên cùng hướng phát triển của cây. Trong hệ thống RITAệ không thể ựạt ựược yêu cầu trên vì cây luôn di chuyển mỗi khi môi trường dâng lên ngập theo chu kỳ.
* Sự tạo phôi ựồng loạt:
- Trên các cây thuộc họ cam chanh, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng ựã cải thiện tắnh ựồng bộ trong quá trình phát sinh phôi nhờ khả năng ức chế sự phát sinh phôi thứ cấp (Cabasson và cộng sự, 1997).
- Hệ thống này cũng cải thiện sự ựồng bộ trong suốt quá trình phát triển và nảy mầm phôi cao su và cà phê Arabica so với quá trình này trên môi trường bán rắn (Etienne và cộng sự, 1997; Etienne-Barry và cộng sự, 1999).
1.4.5.2. Ở Việt Nam
Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ựã ựược thế giới ựã ứng dụng trong nhân giống cây trồng từ lâu. Tuy nhiên, công nghệ này mới bước ựầu ựược thử nghiệm tại Việt Nam trong những năm gần ựây. Hệ thống này ựã ựược tiến hành khảo sát trên một số ựối tượng như hoa lan, cây thu hải ựường và các giống kiểng lá.
Năm 2005-2007, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. Hồ Chắ Minh ựã tiến hành ựề tài "Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân
giống cây lan Hồ ựiệp lai" do ThS. Cung Hoàng Phi Phượng là chủ nhiệm ựề
tài. Hệ thống này lần ựầu tiên ựược ứng dụng ở Việt Nam nhằm mở một hướng ựi mới, ựầy tiềm năng cho ngành nhân giống của Việt Nam. Hệ thống ngập chìm tạm thời ựược sử dụng là hệ thống Plantima của đài Loan. Kết quả
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 27
bước ựầu thu ựược rất khả quan: tỉ lệ nhân protocorm gấp 2,27 lần so với nhân trên môi trường thạch và gấp 1,2 lần so với môi trường lỏng lắc; tỉ lệ chồi gấp 3,37 lần khi so sánh với nuôi cấy trên môi trường ựặc, từ 1 chồi ban ựầu thu nhận ựược 10 chồi mới, cây con tạo thành phát triển mạnh (Cung
Hoàng Phi Phượng, 2007)
Kết quả cũng chỉ ra hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời khắc phục ựược những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kắn trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng. Sự nuôi cấy ựược ựồng bộ hóa vì chất dinh dưỡng ựược khuếch tán ựều do ựó thúc ựẩy sự tăng trưởng ựồng ựều của các chồi nuôi cấy. Chồi ựược nhân giống trong hệ thống này sẽ phát triển nhanh hơn, năng suất cao hơn, phẩm chất tốt hơn.
Mặc dù vậy, nếu tắnh sự vượt trội và trung bình protocorm tạo thành từ 1 protocorm ban ựầu thì kết quả vẫn chưa thật sự thuyết phục (23,4 protocorm trong hệ thống TIS so với 18 và 16 protocorm lần lượt trong hệ thống lỏng lắc và trên môi trường thạch). điều này tác giả giải thắch là do các thông số như chu kỳ ngập ựược cài ựặt trong thắ nghiệm này chưa tối ưu cho việc nhân nhanh protocorm, thời gian ngập tương ựối ngắn chỉ 2 phút 30 giây sau mỗi 2 giờ. Ngoài ra, mật ựộ mẫu cấy và thể tắch môi trường cũng tác ựộng rất lớn lên quá trình nhân protocorm. Vì vậy, ựể ựạt ựược hiệu quả cao nhất khi sử dụng hệ thống TIS trong quá trình nhân protocorm, tác giả ựề xuất cần có thêm những khảo sát và tối ưu hóa các thông số về mật ựộ, thể tắch và chu kỳ ngập chìm của hệ thống này.
Cùng với những ưu ựiểm của hệ thống Plantimavà phát huy kết quả ựạt ựược, Trung tâm Công nghệ sinh học TP.Hồ Chắ Minh tiếp tục ứng dụng hệ thống này trong nhân giống cây kiểng lá Spathiphyllum sensation và ựã cho kết quả ban ựầu cũng rất khả quan: Sau 2 tháng nuôi cấy, các mẫu cấy sống
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 28
100% và có khả năng tái sinh chồi, chồi thu ựược có từ 3 - 4 lá, xanh mướt. Xét về số lượng chồi thu ựược hệ số nhân chồi gấp 4 lần trên môi trường thạch [59 ].
Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự (2008) tại Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam ựã ứng dụng thành công hệ thống bioreactor dạng TIS trong nhân chồi và protocorm lan Dendrobium và Phalaenopsis. Kết quả thu ựược lượng chồi, protocorm sản xuất cao hơn từ 3-20 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch, chồi khỏe, protocorm có màu xanh ựậm.
Trần Thế Mai, Nguyễn Thị Sơn (2012) tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô 2 loài Hoàng thảo là Thạch Hộc (Den. nobile Lindl.) và Ngọc vạn vàng (Den.
chrysanthum) trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau: 1- Trao ựổi khắ có giới hạn:
Môi trường nuôi cấy ựặc, bình nuôi sử dụng nút bông; 2- Không trao ựổi khắ: Môi trường nuôi cấy ựặc, bình sử dụng nút nylon bịt kắn miệng bình ngăn cản trao ựổi khắ; 3- Trao ựổi khắ hoàn toàn: Môi trường nuôi cấy ựặc, bình sử dụng nút là màng vi lọc khắ; 4- Môi trường lỏng tĩnh thoáng khắ: Môi trường nuôi cấy lỏng, bình sử dụng nút là mạng vi lọc khắ; 5- Môi trường lỏng lắc thoáng khắ: Môi trường nuôi cấy lỏng, lắc 100 vòng/ phút, bình sử dụng màng vi lọc khắ; và 6- Hệ thống Bioreactor Plantima: Hệ thống ngập chìm ngắt quãng, môi trường lỏng. Kết quả thu ựược cho thấy: Trong các phương thức nuôi cấy thử nghiệm, phương thức nuôi bằng Bioreactor Plantima (hệ thống ngập chìm ngắt quãng) là phương thức tối ưu so với các phương thức nuôi cấy mô hiện hành.
Những thành công bước ựầu trong việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nuôi cấy mô góp phần phát triển ngành nhân giống
in vitro nước ta lên tầm cao mới; và phục vụ tốt cho việc sản xuất theo qui
mô công nghiệp trong thời gian tới. Tuy nhiên, ựể hệ thống hoạt ựộng hiệu quả thì việc tối ưu hóa các thông số kỹ thuật (mật ựộ nuôi cấy, thể tắch, số lần ngập chìm) cho từng ựối tượng cụ thể là rất quan trọng.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 29