Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1. Tạo vật liệu khởi ựầu cho quá trình nuôi cấy
Trong nhân giống in vitro, việc sử dụng các cơ quan sinh dưỡng làm vật liệu nuôi cấy ựược gọi là phương pháp nhân giống vô tắnh in vitro. Kết quả của phương pháp này là cho ra các sản phẩm con cái giữ nguyên ựược phẩm chất di truyền của cây mẹ và hoàn toàn ựồng nhất với nhau về mặt di truyền. đối với nhân giống Hồ ựiệp hiện nay, phương pháp này lại càng có ý nghĩa quan trọng, thay thế cho phương pháp gieo hạt in vitro trên môi trường thạch, về bản chất vẫn là nhân giống hữu tắnh, do ựó vẫn có sự phân ly tắnh trạng giữa bố mẹ và con cái và giữa các con cái với nhau theo các quy luật di truyền của Mendel.
Bước ựầu tiên của quy trình nhân giống vô tắnh in vitro là phải có ựược mẫu sạch từ các cơ quan sinh dưỡng, sau ựó sử dụng các ựường hướng nuôi cấy ựể biệt hóa, phát sinh hình thái mẫu cấy tạo thành cây con hoàn chỉnh. đối với lan Hồ ựiệp, ựã có nhiều công trình nghiên cứu về tạo nguồn mẫu sạch và phát sinh hình thái từ các cơ quan sinh dưỡng như: ựỉnh sinh trưởng, phát hoa (Rotor, 1949; Sagawa, 1961; Arditti và Ernst, 1993; Part và cộng sự,
1996; Tanaka, 1987Ầ), lá non (Part và cộng sự 2002; Ishii và cộng sự,
1998Ầ), chóp rễ (Ichihashi, 1997; Tanaka và cộng sự, 1976; Kobayashi và
cộng sự, 1991Ầ). Trong ựó, phát hoa ựược nghiên cứu nhiều nhất do khi cắt
phát hoa không ảnh hưởng ựến sức sống của cây mẹ, ngoài ra phần gốc phát hoa còn có các ựốt chứa mắt ngủ nên rất thuận tiện cho kắch thắch tạo chồi. Trong nghiên cứu này chúng tôi kế thừa kết các quả nghiên cứu trong nước ựể tạo ra nguồn mẫu sạch in vitro (chồi bất ựịnh) từ mắt ngủ phát hoa
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 38
của các tác giả Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga (2000), tiếp theo phát sinh hình thái bằng nuôi cấy mô lá của các chồi bất ựịnh vừa thu ựược theo Hoàng Thị Lan Hương và cộng sự (2008) ựể tạo ra các thể tiền chồi (protocorm) làm vật liệu phục vụ cho các nghiên cứu nhân nhanh, tái sinh chồi từ protocorm và tạo cây hoàn chỉnh trên hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima.
3.4.1.1.1.Cảm ứng tạo chồi bất ựịnh từ mắt ngủ phát hoa
Kế thừa kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga (2000) với các thông số sau:
- Mẫu cấy: Phát hoa có chứa mắt ngủ
- Chế ựộ khử trùng: Khử trùng lần 1 bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút, sau ựó bóc tiếp các lá bao bên ngoài mắt ngủ rồi khử trùng tiếp lần 2 bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 1 phút
- Môi trường nuôi cấy khởi ựộng: VW + 100 ml/l ND + 10 g/l đK + 2,0 mg/l BAP + 0,3 mg/l Ki + 6,5 g/l Agar, pH 5,8 - 6,0
Sau 30 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy sống sót ựã phát sinh hình thái tạo thành chồi bất ựịnh. Chồi bất ựịnh này lại ựược sử dụng làm vật liệu ựể tái sinh tạo protocorm ở công ựoạn thiếp theo.
(a) (b) (c)
Hình 3.1: Phát sinh hình thái tạo chồi bất ựịnh (b& c) từ mắt ngủ phát hoa (a)
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 39
3.1.1.2. Cảm ứng tạo protocorm từ mô lá của chồi bất ựịnh
Kế thừa kết quả nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Lan Hương, Lê Huy Hàm, Nguyễn Xuân Linh, Nguyễn Thị Kim Lý (Viện Di truyền Nông nghiệp, 2008).
- Mẫu nuôi cấy: Mô lá của chồi bất ựịnh in vitro ựược cắt nhỏ thành các mẩu có kắch thước 5mm x 5mm.
- Môi trường cảm ứng tạo protocorm: MS + 100 ml/l ND + 10 g/l đK + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l Ki + 6,5 g/l Agar
Sau 30 ngày nuôi cấy, các mẫu sống sót ựã cảm ứng phát sinh hình thái tạo thành protocorm.Các protocorm này ựược sử dụng làm vật liệu ựể phục vụ các nghiên cứu nhân nhanh, tái sinh tạo chồi và tạo cây hoàn chỉnh trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Plantima
(a) (b)
Hình 3.2: Các protocorm - Thể tiền chồi (b) phát sinh từ mô lá (a) của chổi bất ựịnh (sau 30 ngày nuôi cấy)
3.1.2.Thiết lập ựiều kiện nuôi cấy vô trùng cho hệ thống Plantima
Trước khi tiến hành khảo sát các quá trình nhân nhanh protocorm, tái sinh tạo chồi từ protocorm, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên hệ thống Plantima, việc lắp ựặt và vận hành hệ thống này một cách thành thạo, ổn ựịnh, hạn chế
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 40
tối ựa sự nhiễm tạp là một bước rất quan trọng. Sau khi lắp ựặt hệ thống theo như hướng dẫn của nhà sản xuất, chúng tôi tiến hành cài ựặt chu kỳ ngập chìm cho hệ thống. Có 3 thông số ựược cài ựặt, lần lượt là thời gian T1,T2 và T3:
- T1: Là thời gian từ khi máy bơm ựược kắch hoạt, không khắ ựược nén vào ngăn chứa môi trường nuôi cấy tạo ra áp suất ựẩy môi trường lỏng theo ống dẫn của Funnel lên ngăn chứa mẫu cấy.
- T2: Là thời gian máy bơm ngừng hoạt ựộng, van xả khắ vẫn ựóng giúp cho áp suất ựược duy trì ựể mẫu cấy ngập trong môi trường nuôi cấy mà không có sự sục khắ.
- T3: Là thời gian bơm ngừng hoạt ựộng, van xả khắ mở ra giúp không khắ ở ngăn chứa môi trường nuôi cấy thoát ra ngoài làm áp suất giảm, môi trường nuôi cấy từ ngăn trên theo trọng lực chảy xuống ngăn dưới như ban ựầu. Khi thời gian T3 kết thúc, hệ thống lặp lại chu kỳ như ựã cài ựặt.
Khi ựã cài ựặt các thông số theo ý muốn với T1 = 2 phút, T2 = 5 phút, T3 = 2 giờ, tiến hành cho hệ thống chạy thử với môi trường lỏng là nước cất, hệ thống không cần phải khử trùng. Sau một thời gian theo dõi, hệ thống ựã vận hành ựúng như ựược lập trình. Việc lắp ựặt và vận hành hệ thống bước ựầu ựã thành công.
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 41
Tiếp theo, ựể kiểm tra mức ựộ vô trùng của hệ thống, tiến hành vận hành thử hệ thống với môi trường lỏng MS có bổ sung 30 g/l ựường Saccharose, pH 6,0 thay cho nước cất.. Tiến hành cho vào mỗi bình Plantima 250 ml môi trường (theo như khuyến cáo của nhà sản xuất), ựậy nắp và vặn ren vừa phải, rồi ựem ựi hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm trong 25 phút. Sau khi hấp xong, ựợi cho các bình môi trường nguội, tiến hành siết nắp vừa chặt rồi lắp các bình môi trường này vào hệ thống và vận hành thử với chế ựộ ngập chìm là T1 = 2 phút, T2 = 5 phút, T3 = 2 giờ. Cho hệ thống vận hành bình thường, sau 3 tuần quan sát thấy hiện tượng nhiễm vi sinh vật ở bên trong hầu hết các bình Plantima.
để tìm hiểu nguyên nhân gây nhiễm trong hệ thống Plantima, chúng tôi nhận thấy:
- Trong quá trình hấp tiệt trùng, môi trường dinh dưỡng trong bình Plantima khi sôi bị văng lên qua chỗ nối với filter làm filter bị ướt, ựây có thể là một trong những nguyên nhân chắnh gây nhiễm.
- Kiểm tra hệ thống nắp và filter có bị rò rỉ trong quá trình bơm nén khắ hay không bằng cách nhúng ngập bình Plantima vào xô nước, nhận thấy dù ựã siết nắp khá chặt nhưng vẫn thấy có hiện tượng sủi bọt khắ ở vị trắ nắp và ở filter. điều này chứng tỏ áp suất của bơm nén khắ trong hệ thống quá mạnh (nguyên nhân là do khi thử nghiệm chỉ với 10 bình, còn bơm ựược thiết kế cho 40 bình Plantima của hệ thống hoạt ựộng cùng lúc).
Sau khi xác ựịnh ựược nguyên nhân gây nhiễm, các biện pháp khắc phục ựược thực hiện như sau:
- điều chỉnh áp lực nén của bơm ựể giảm áp suất bơm của máy, cho hệ thống chạy ựủ với 40 bình theo như thiết kế. Thay các zoăng cao su bị giãn gây hở nắp khi bơm.
- Tiến hành thay ống silicon dài 10 cm nối hai filter với bình Plantima bằng ống silicon dài 25 cm. Môi trường ựược ựổ vào bình trước khi hấp khử
Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 42
trùng, buộc các filter hướng lên trên ựể tránh hiện tượng môi trường khi sôi bị văng lên filter.
- Giữ vệ sinh phòng nuôi luôn sạch sẽ và hạn chế sự ra vào thường xuyên ựể cách ly nguồn nhiễm tạp.
Tiến hành rà soát lại các bước thực hiện như trên, sau hơn 3 tháng tìm hiểu và lặp lại các thắ nghiệm khảo sát nguyên nhân gây nhiễm. Hiện tượng nhiễm vi sinh vật trong bình Plantima ựã từng bước ựược khắc phục, hệ thống ựã sẵn sàng ựể ựưa vào phục vụ cho các công việc nuôi cấy thiếp theo.
3.2. Khảo sát quá trình nhân nhanh protocorm trên hệ thống Plantima