Ứng dụng hệ thống nuôi cấy Bioreactor

Ứng dụng hệ thống nuôi cấy Bioreactor trong công nghệ sinh học thực vật

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 1 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY BIOREACTOR TRONG CNSH

THỰC VẬT

1 MỞ ĐẦU

Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cây trồng cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao; do việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dể bị nhiễm Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới làm sao có thể

tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian và số lượng cây nhiều Năm 1981, Takayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên ngoài vào với tên gọi Bioreactor [2] Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ra ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreactor, tất cả đều được dùng

để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh cơ quan.[21] Và hệ thống Bioreactor là thường được dùng nhiều, chủ yếu để nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp trên nhiều đối tượng nghiên cứu khác nhau [22][2][18], và hiện nay đang có xu hướng dùng Bioreactor để nuôi cấy rễ lông tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp, bởi so với nuôi cấy huyền phù thì nuôi cấy rể có ưu thế là ít bị biến đổi di truyền và chứa nhiều sản phẩm cần thu nhận hơn

Nhưng thực ra từ những năm 60, Giáo sư Gamborg đã đưa ra ý tưởng ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong fermenter, vào những năm đó thiết bị nuôi cấy tương đương như hệ thống nuôi cấy lên men Bằng thiết bị đó các nhà khoa học có thể điều khiển và xác định được sự tăng trưởng của tế bào Sau khi bắt đầu nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng đã cho các nhà khoa học biết rằng tế bào thực vật khác với tế bào nấm men, và nếu được bảo quản trong điều kiện giống nhau thì tế bào thực vật không sinh trưởng đơn độc mà cũng không xảy ra sự sinh trưởng đồng thời theo một cách như tế bào nấm men Nuôi cấy bằng kỹ thuật này, việc nghiên cứu thu nhận sinh khối, nghiên cứu dinh dưỡng và sinh hoá trong môi trường lỏng tỏ ra rất hiệu quả [4] Trong những năm sau đó vào những năm 1970, một công ty Thuốc lá của Nhật Bản đã rất quan tâm đến vấn

đề này, họ đã tiến hành sản xuất sinh khối cây thuốc lá để làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc điếu; công ty này đã nuôi cấy trong tank fermenter 20 lít [15]

Về sau, để khắc phục những nhược điểm của hệ thống cho ngập chìm mẫu hoàn toàn, Harris và Mason đã cải tiến thành hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary immersion system- TIS) là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống nuôi cấy Rocker vào năm 1983; ít lâu sau, vào năm 1985 Tesserat và Vandercook đã thiết kế một

hệ thống nuôi cấy tự động APCS, đây là hệ thống có thể thây thế được môi trường và có thể sử dụng trong thời gian dài mà không cần cấy chuyền Nuôi cấy bằng Bioreactor là

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 2 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

một trong những phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với số lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi,…), và sản xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng cách sử dụng tế bào thực vật

Mỗi hệ thống có những ưu nhược điểm riêng nhưng tất cả đều mang lại một số thành công bước đầu trong việc tạo ra một số sản phẩm Trong những năm gần đây, hệ thống đã được phổ biến rộng, nhưng cũng chỉ mới ở các công ty đa quốc gia hoặc nghiên cứu cơ bản tại các phòng nghiệm và hệ thống này được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau như nhân giống cây trồng, y học… và đạt một số kết quả nhất định Một công

ty tai Đức, Diversa, đã trang bị đến năm hệ thống Bioreactor có dung tích đến 75.000 L

để nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên, những chi tiết cụ thể về hệ thống Bioreactor đó không được tiết lộ, theo hình ảnh trưng bày cho thấy hệ thống của họ có hình dáng trông

giống hệ thống lên men vi khuẩn bình thường Công ty đó đã nuôi cấy tế bào Echinacea

purpurea ở quy mô lớn để sản xuất hợp chất có hoạt tính miễn dịch sinh học là

polysaccharide.[15]

2 MỘT SỐ HỆ THỐNG BIOREACTOR

2.1 Cấu tạo chung

Bioreactor là hệ thống có cấu tạo tương đối giống với hệ thống fermentor trong nuôi cấy vi sinh vật Cấu trúc bên trong của Bioreactor cũng chứa các thành phần như bộ điều chỉnh nhiệt độ - pH, thùng chứa dung dịch dinh dưỡng, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống cánh khuấy (trong một số thiết bị được thay bằng bộ sục khí nén từ dưới lên)… Nguyên tắc hoạt động của từng thiết bị phụ thuộc vào từng công nghệ sản xuất Về sau, để tăng khả năng ứng dụng của hệ thống này trong nuôi cấy, người ta đã đưa ra một

số mô hình cải tiến như các hệ thống ngập chìm tạm thời (TIS) Hệ thống này hoạt động trên nguyên tắc ngập chìm không hoàn toàn, mà được điều chỉnh thời gian ngập bằng tự động

2.2 Phân loại

Hệ thống Bioreactor có rất nhiều kiểu, nhưng trong giới hạn bài viết tôi chỉ đưa ra hai hệ thống nuôi cấy được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất là hệ thống Bioreactor kiểu Air-lift và hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

2.2.1 Bioreactor không có cánh khuấy

Đây là kiểu Bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bột khí ở phí dưới đáy bình, nó có tác dụng khuấy trộn môi trường và cung cấp oxygen và lượng oxygen cung cấp ảnh hưởng đến sự phát triển của đối tượng Theo Hiroyuki Honda, callus của cây nho phát triển tốt nhất ở dòng khí cung cấp là 80 ml/phút, và góp phần làm tăng lượng anthocyanin trong nuôi cấy [11]

Loại này khắc phục được hai nhược điểm của Bioreactor có cánh khuấy là: ít ốn năng lượng cho khuấy trộn môi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào nhờ những dòng

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 3 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ dưới lên Sự hòa trộn dòng khí vào pha lỏng trở nên hiệu quả hơn do có sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường [2] Theo nghiên cứu của Paek và cộng sự (2003) trên đối tượng là các cây lâm nghiệp cho thấy, để có thể tạo được các bọt khí nhỏ mịn, dòng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ có kích thước nhỏ 0.01 – 0.1 mm Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm giảm đáng kể sự cọ xát cho các tế bào nên tế bào ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào

có độ nhạy cảm cao[17]

Ưu điểm của hệ thống này là có khả năng nhân sinh khối rất nhanh, khi nuôi ấy ngập chìm và được di chuyển tự

do trong môi trường làm cho

hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến

mất và chồi phát triển tương đối

đồng đều Hệ thống này rất phù

hợp cho những quá trình nhân

sinh khối tế bào và nhân sinh

khối rễ do khả năng chịu được

sự ngập chìm trong môi trường,

và thực tế hiện nay người ta

cũng đang sử dụng hệ thống này

vào sản xuất giống hay sinh

khối như nuôi củ hoa Lily, hoa

thu Hải đường hay nhân sâm

của phân viện sinh học Đà Lạt [2].Chính

khả năng này đã thúc đẩy sự ứng dụng hệ

thống Bioreactor vào nhân giống cũng

như nhân nhanh sinh khối để thu các chất hoạt

hóa sinh học

Tuy nhiên, Hệ thống Bioreactor Air-lift cũng lộ ra những khuyết điểm trong quá trình nuôi cấy như là dể bị hiện tượng thủy tinh thể hay hiện tượng street tế bào do mẫu khi nuôi cấy luôn được cho ngập chìm hoàn toàn và liên tục và hệ thống cũng khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau Một vấn đề lớn nữa là nuôi cấy trong môi trường lỏng dể bị nhiểm vi sinh vật như nấm,vi khuẩn, côn trùng…Đó là những nguyên nhân mà hiện nay người ta đã có những cải tiến thiết bị trong nuôi cấy lỏng có cung cấp không khí từ bên ngoài[2]

2.2.2 Hệ thống nuối cấy ngập chìm tạm thời

Hệ thống ngập chìm tạm thời gọi tắc là TIS, được nghiên cứu cải tiền vào năm

1985 Và nó được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu [23]

Ở nước ta, bước đầu Phân viện Sinh học Đà Lạt đã chế tạo hệ thống nuôi cấy này

và đã thành công trong việc nhân giống nhanh loài hoa African violet Kết quả cho thấy

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 4 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

hệ thống TIS cho hiệu quả nhân chồi và tăng sinh khối chồi hoa African violet cao hơn so với phương pháp nhân giống truyền thống Cụ thể là số chồi tăng 4,61 lần và sinh khối tăng 23,17 lần [2]

2.2.2.1 Nguyên tắc và cấu tạo

Ngoài những hệ thống nuôi cấy nghiêng, Rocker và hệ thống nuôi cấy tự động APCS thì trên thị trường một số hệ thống đã được thương mại hóa như: Hệ thống RITA,

hệ thống bình đôi BIT và hệ thống Plantima Vì đây thực ra là các hệ thống được dùng để nghiên cứu ở nước ta hiện nay

Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện là tránh sự ngập liên tục, có thể thay đổi môi trường, điều khiển tự động và hạn chế sự nhiểm

Về cấu tạo hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời gồm các bộ phận như máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc, bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh

2.2.2.1.1 Hệ thống RITA

Hệ thống RITA (Hình 1) là công trình của

Teisson và Alvard vào năm 1995 Một bình chứa

1 L gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và

phần dưới chứa môi trường Một áp suất khí

dương được cung cấp vào ngăn dưới sẽ đẩy chất

lỏng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy được

ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy

theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì

Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ thống Và hệ thống này thể tích môi trường dinh dưỡng được giữ trong suốt quá trình nuôi cấy mà không cần phải thay mới

Hiện nay, có nhiều hãng sản xuất hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA®như hãng Cirad, Pháp; BIT® Twin Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau Một hệ thống cũng xuất hiện gần đây là hệ thống Plantima®

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 5 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

của công ty Atech, Ðài Loan Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, hoa Lan…

trường và môi trường lỏng rút xuống ngăn dưới

2.2.2.1.2 Hệ thống bình sinh đôi BIT

Hệ thống bình sinh đôi BIT (Hình 2) được thiết kế

bởi Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số

lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma Ðối với nhân

giống theo con đường phát sinh cơ quan kích thước mẫu cấy

đòi hỏi một hệ thống có thể tích lớn hơn và rẻ hơn Con

đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái ngập chìm tạm

thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay

plastic có kích thước từ 250 mL - 10 L bằng một hệ thống

ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi

trường vào bình chứa mẫu và ngược lại Hệ thống BIT®

được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên

2.2.2.1.3 Hệ thống Plantima

Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan Hệ thống này cũng đã được tiến hành khảo sát trên nhiều đối tượng như chuối, hoa Lan…Cấu tạo

và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 3, Hình 4):

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 6 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

Hình 3: Các bộ phận chính của Plantima Hình 4: Hệ thống điều khiển chu kỳ ngập

2.2.2.2 Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

a Ưu điểm

- Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau Như khả năng phát sinh chồi và phôi soma không

bị biến dị với tần số cao

- Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường

- Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt

hơn

- Nuôi trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm Điều này được chứng minh thông qua việc trồng trực tiếp ra đất củ khoai tây bi và phôi soma cây cà phê

- Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những ưu điểm của

hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong

hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng

- Hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể so, đây là ưu điểm lớn của hệ thống này

so với hệ thống Bioreactor thông thường

- Hệ thống này tiết kiệm được công lao động, không gian phòng nuôi cấy giảm số lượng chai lọ nên giảm được chi phí sản xuất, và hệ thống cho hiệu suất sinh học cao Mô hình này rất thích hợp cho việc mở rộng quy mô phục vụ cho sản xuất thương mại

- Một ưu điểm khác của hệ thống này là trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 7 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

b Khuyết điểm

- Hiện nay chưa khảo sát được mật độ nuôi cấy [32]

- Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với

những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới

- Phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy

- Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy

- Giá thành của các thiết bị nuôi cấy ngập chìm tạm thời ở nước ta hiện nay rất đắt nhưng vẫn chưa được tự chế tạo trong nước

- Những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây

2.2.2.3 Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng cây nuôi cấy

Theo nghiên cứu của Escalona và cộng sự

(1999), cho thấy khi nuôi cấy chồi trong hệ thống

TIS thì lá sẽ nhỏ hơn lá trong nuôi cấy lỏng [9]

Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong

Bioreactor thường có hình cầu và chồi có xu hướng

phát triển toả tròn xung quanh tâm Do đó, một số

chồi con có kích thước không lớn và cần được kéo

dài trong cùng hệ thống trước khi cho ra rể ngoài

ống nghiệm Ngược lại, chồi cây có thân dài hơn và

ra nhiều lá hơn khi nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời so với nuôi cấy trên thạch [24] Chồi cây nuôi cấy trong hệ thống này cũng dài và nặng hơn chồi nuôi cấy trên môi trường bán rắn Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình chứa dung tích lớn [4]

2.3 Các yếu tố và thông số ảnh hưởng đến quá trình nuối cấy

Khác với nuôi cấy trên bề mặt thạch các thông số kỹ thuật hay các yếu tố ảnh hưởng chỉ là dinh dưỡng, pH, và độ vô trùng; thì đối với nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor thì có thêm các thông số như không khí, oxygen hòa tan, sự khuấy trộn và có thể có thêm yếu tố ngập chìm Ở từng đối tượng cụ thể mà các thông số kỹ thuật có thể được điều chỉnh cho tối ưu

2.3.1 Không khí

Trong không khí thì thành phần các loại gồm Nitrogen (78%), Oxygen (21%) và Cacbon dioxide (0,036%) Lượng không khí trong bình phụ thuộc vào thể tích và độ

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 8 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

thoáng khí của bình Hệ thống Bioreactor, hai yếu tố quan trọng là môi trường và độ thoáng khí.[3]

Trong quá trình hô hấp thực vật sử dụng O2 và thải CO2, còn trong quá trình quang hợp thì ngược lại Trong pha tối, nồng độ CO2 tănglên trong nuôi cấy, còn khi điều kiện quang tự dưỡng chiếm ưu thế thì nồng độ đó giảm đi trong pha sáng Nồng độ CO2 cao

có nhiều tác động có lợi trên sự kéo dài chồi và sự phát triển của lá cây Theobroma cacao

[4] Theo Woltering (1990), đã chứng minh được rằng nồng độ CO2 trên 10.000 ppm rất

có ích cho cây hoa Hồng và cây hoa Đồng tiền trong việc giảm lão hoá của lá

Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy In vitro thì ngoài cơ chế trên thì cây còn thải

ra trong bình nuôi cấy các chất khí như ethylen(C2H4), ethanol(C2H5OH), acetaldehyde

và hydrocacbon Và theo nghiên cứu của De Proft và cộng sự (1985), thì trong điều kiện

nuôi cấy In vitro thành phần môi trường khí khác nhau thì sự phát triển của cây cung

khác nhau, cụ thể là là việc hàm lượng CO2 giảm và hàm lượng ethylene tăng

Trong nuôi cấy dùng hệ thống Bioreactor thì cung cấp hay thải các chất khí đã được tính đến trong công nghệ của thiết bị nuôi cấy, và điều này có ý nghĩa rất lớn đến quá trình của mẫu cấy Lấy trường hợp của củ khoai tây nuôi cấy bằng Bioreactor air-lift, khi chúng ta nuôi cấy chìm liên tục thì quá trình cảm ứng tạo củ bị ức chế và các củ chỉ phát triển sau khi các chồi được kéo dài ra và được tiếp xúc với pha khí ở phần trên của Bioreactor [4] Các biện pháp tăng cường thêm lượng O2, điều khiển lượng hormone và các điều kiện thẩm thấu đều không có hiệu quả và khó giải thích được hiện tượng trên Nhưng nếu thay bằng hình thức nuôi cấy 2 pha, môi trường có bổ sung 9% sucrose để cảm ứng tạo củ thì sự tạo củ từ chồi sẽ phát triển, vượt lên cả môi trường, tiếp xúc với pha khí ở phía trên Ngoài ra, thì thoáng khí còn ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của chồi Hồ Điệp, kết quả khảo nghiệm của các nhà nghiên cứu trên nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau cho thấy nếu sự thông thoáng càng nhiều thì chồi Hồ Điệp càng sinh trưởng và phát triển tốt hơn Điều này đã cho thấy tầm quan trọng của pha khí trong Bioreactor đối với sự phát triển của thực vật [2].Một nghiên cứu đi vào khảo sát sự

ảnh hưởng của sự thông thoáng đến sự phát triển của nuôi cấy huyền phù Catharanthus

roseus trong hệ thống Bioreactor airlift của P K Hegarty và cộng sự cho thấy, khối

lượng khô sau khi nuôi cấy có thể tăng lên rất nhiều và hàm lượng chất mang hoạt chất thứ cấp rất cao

Vì vậy trong nuôi cấy thì sự sinh trưởng và phát triển của cây không chỉ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy mà còn phụ thuộc vào thành phần không khí trong hệ thống nuôi cấy

2.3.2 Oxygen hòa tan

Một trong những chức năng của Bioreactor là tăng cường khả năng vận chuyển oxygen từ pha khí sang pha lỏng Do oxygen chỉ hoà tan một phần trong nước (0.25

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 9 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

mmol.l-1 ở 250C, 1 atm) nên để đáp ứng nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô thực vật, một lượng lớn oxygen cần được khuếch tán vào môi trường nuôi cấy Ngoài ra, mức

độ đảo trộn cũng là một yếu tố cần quan tâm do oxygen hòa tan trong môi trường cần nhanh chóng được mô và tế bào hấp thu

Tóm lại, đế đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxygen cho sự phát triển của mô và tế bào thì lượng oxygen hòa tan trong dung dịch nuôi cấy luôn phải lớn hơn ngưỡng oxygen hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO2 htcđ) Trong trường hợp lượng oxygen hòa tan vào trong môi trường nhỏ hơn (DO2 htcđ), năng lượng ATP của tế bào sẽ bị giảm sút, từ đó ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát sinh hình thái và trao đổi chất của tế bào Tuy nhiên, trong thực tế người ta căn cứ vào giá trị (DO2 htcđ) để thiết kế Bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn hơn [2] Theo nghiên cứu của Thanh N T, Yu K W, Hahn E J và Paek K Y(2005), cho thấy nồng độ Oxygen 40% là phù hợp cho việc sản xuất sinh khối và sản xuất Ginsenoside là tốt nhất, và nếu tăng lên 50% thì lại không thích hợp cho qua trình nuôi cấy tế bào cũng như tích luỹ sản phẩm Ginsenoside [25]

Ở một số trường hợp khi nuôi cấy mẫu trong Bioreactor thì nguồn oxygen thường không đến được với sinh khối ở giữa Bioreactor dẫn đến hậu quả là nhiều khối mô bị lão hóa, vì rể có nhiều nhánh nên nhiều rễ đan xen vào nhau có khả năng cản lại nguồn cung cấp khí cũng như dinh dưỡng cho các rể nằm phía trong; trường hợp này gặp ở nuôi cấy nhân sinh khối rể Vì vậy mà khả năng thành công để làm nguồn cho sản xuất các chất có hoạt chất sinh học phụ thuộc vào việc thiết kế các hệ thống Bioreactor phù hợp

Tuy nhiên, cần lưu ý chỉ thực hiện quá trình khuấy trộn ở mức vừa phải để vừa kích thích mô, tế bào vừa không làm tổn thương mô tế bào Sự đảo trộn trong nuôi cấy thì vẫn chưa được nghiên cứu nhiều, chỉ mới công bố ở mảng nuôi cấy tế bào thu nhận các sản phảm thứ cấp

Đối với các thiết bị nuôi cấy cải tiến thì sự đảo trộn thường ít được ứng dụng do các thiết bị này mẫu không bị ngập chìm hoàn toàn vào trong môi trường nuôi cấy

2.3.4 pH

pH là một thông số vật lý ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật [2] Theo một số tác giả, sự thay đổi độ pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 10 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

liên quan đến sự cân bằng của các muối amonium trong môi trường Mức chịu đựng của thực vật đối với pH môi trường vào khoảng 5,5 đến 6,5; độ pH ảnh hưởng đến sự hoạt động của các nguyên tố đa vi lượng trong môi trường nuôi cấy Dưới 5,5 thì khả năng hoạt động của P, K, Ca, Mg và Mo giảm đi rất nhanh, trên 6,5 thì Fe và Mn trở nên bất hoạt và nếu môi trường pH tăng quá cao sẽ diển ra sự kết tủa của Ca3(PO4) [6]

Theo Lazzeri P A và cộng sự (1987), khi pH hạ xuống dưới 5,0 thì mô thực vật

mà có thể bổ sung thêm vào ở những nồng độ và liều lượng nhất định

Sucrose hoặc glucose ở tại nồng độ 2 -4 % thì phù hợp cho nguồn cacbon

2.3.5.2 Dinh dưỡng khoáng

Có nhiều loại nguyên tố muối khoáng khác nhau cần cho đời sống thực vật được cung cấp dưới dạng đa lượng và vi lượng Các nguyên tố đa lượng thường được sử dụng với nồng độ khá lớn (khoảng 0,5 mmol/l), còn các nguyên tố vi lượng được sử dụng với lượng rất nhỏ (khoảng 0,05 mmol/l) [5].Nuôi cấy trên hệ thống Bioreactor, các nhà khoa học thường sử dụng các loại môi trường khác nhau như SH, MS, B5, Nisch… nhưng môi trường được sử dụng nhiều vẫn là môi trường MS bởi đây là môi trường giàu khoáng, thích hợp cho nhiều đối tượng khác nhau

Trong một số nghiên cứu về sự hình thành củ trong nuôi cấy củ hoa Lily trong Bioreactor thì thu được kết quả sau 16 tuần nuôi cấy như các muối amonium, nitrate, phosphat hầu như được sử dụng hết, trong khi đó các ion K+, Mg2+, Ca2+, Na+, và Cl- vẫn còn một lượng đáng kể trong môi trường Tuy nhiên một điều đặc biệt là đường sucrose lúc này lại là tác nhân ức chế sự tăng trưởng thay vì là một nguồn dinh dưỡng chính Theo Y.E Choi, nồng độ của NH4NO3 trong nuôi cấy cây Panax ginseng để thu sinh khối

thì ở từng giai đoạn là khác nhau, giai đoạn phát sinh callus thì nồng độ để cảm ứng callus là khoảng 60mM; trong khi đó, nồng độ khi cấy chuyền là 40mM; và dùng trong quá trình tăng sinh khối thì nồng độ chuẩn là 20 mM [26]

2.3.5.3 Chất điều hoà sinh trưởng

Tái sinh chồi in vitro và quá trình nhân giống tiếp theo đòi hỏi nguồn cung cấp

chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy Những chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng là chất thuộc nhóm auxin và cytokinin riêng lẻ hay dùng chung với tỉ

lệ rất đa dạng phụ thuộc vào loài cây và loại mô dùng để nuôi cấy [4] Theo Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005), khi nuôi cấy tái sinh callus rể bất định cây nhân sâm thì nồng độ NAA dùng là 3mg/l [8] Theo A.M Shohael và cộng sự, khi nuôi cấy phôi callus trong hệ

thống Air-lift cây Eleutherococcus sessiliflorus, thì nồng độ 2,4 D phải dùng là 1 mg l－1,

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 11 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

kết quả nghiên cứu cho thấy việc nuôi cấy ở nồng độ như vậy sẽ mang lại lượng sinh khối khá cao và việc tích tụ hợp chất eleutherosides

sản xuất từ callus cây Eleutherococcus sessiliflorus tương đối nhiều[7]

2.3.5.4.Vitamin

Thực vật tự tổng hợp các Vitamin và chúng được sử dụng như những chất xúc tác trong các quá trình trao đổi chất khác nhau Khi các tế bào và mô thực vật sinh trưởng

trong điều kiện in vitro, một số Vitamin không thể thay thế được tổng hợp nhưng thường

không đủ về lượng, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các Vitamin thuộc nhóm B [5] Theo Masanaru Misawa (1994),Vitamin Thiamine (B1) có ý nghĩa hết sức quan trọng, nó thường thích hợp trong nhiều loại tế bào thực vật và trong một số trường hợp nó như là chất kích thích sự phát triển của thực vật.[15] Và là chất rất cần trong môi trường nuôi cấy, B1 có thể bị nhiệt phân khi khử trùng môi trường nhưng khi nuôi cấy tế bào có thể tổng hợp lại chúng thành phân tửu B1 ban đầu [5] Trong số các môi trường nuôi cấy thì môi trường MS được xem là môi trường tốt nhất trong nuôi cấy

mô vì ngoài thành phần B1 trong môi trường còn có các loại Vitamin khác với liều lượng thích hợp cho sự phát triển của thực vật

2.3.6 Thời gian ngập chìm mẫu

Yếu tố này chỉ lưu ý đối với hệ thống Bioreactor ngập chìm tạm thời (TIS) Đây là yếu tố để hệ thống TIS được coi là khắc phục các nhược điểm của hệ thống Bioreactor Air-lift Nó tạo nên hiệu quả do có sự kết hợp giữa vấn đề thoáng khí và sự tiếp xúc theo chu kỳ giữa mô thực vật và môi trường nuôi cấy [4] Và trong quá trình nuôi cấy chu kỳ

và tần số ngập chìm là những chỉ số chủ yếu Theo Etienne và cộng sự (1997), thời gian ngập chìm dài (1giờ ngập trong chu kỳ 6 giờ) tỏ ra hiệu quả cho sự hình thành củ của cây Khoai tây bi, thời gian ngập chìm ngắn (1 phút ngập trong chu kỳ 12 giờ) lại phù hợp cho

sự hình thành phôi soma ở cây Cà phê và Cao su Còn theo nghiên cứu của Harris và Mason (1983) cho thấy, tần số ngập chìm cao (30 giây ngập chìm, 30 giây rút) thì hiệu quả nhân chồi Nho cao khi nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor nghiêng lắc [28] Và ở tần

số ngập chìm 22 phút trong chu kỳ 7 giờ thì tỷ lệ nhân chồi Cây chuối cao.[S Roels và cộng sự]

2.3.7 Thể tích môi trường dinh dưỡng

Theo Lorenzo và cộng sự (1998), xác định thể tích môi trường 50 ml cho một mẫu

cấy là tối ưu khi nhân chồi Saccharum ssp.trong hệ thống Bioreactor bình đôi BIT Khi

tăng dần thể tích môi trường từ 5 đến 50 ml/ mẫu cấy, hệ số nhấn chồi tăng từ 8,3 chồi lên 23,9 chồi sau 30 ngày nuôi cấy Vào năm 1999, cũng trên hệ thống nuôi cấy tương tự thì nhóm tác giả Escalona và cộng sự lại chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là 200 ml/mẫu cấy

2.4 Sự phát triển của thực vật trong Bioreactor

GVHD: Huỳnh Văn Kiệt 12 SVTH: Huỳnh Phạm Bảo Triều

2.4.1 Quá trình phát sinh phôi soma

Sự phát sinh phôi soma cũng được áp dụng trong việc nhân giống cây trồng với số lượng lớn trong Bioreactor tự động phôi soma dể sử dụng do chúng có kích thước tương đối nhỏ và đồng đều về kích cỡ, chúng không cần phải được cắt thành những mảnh nhỏ

và tách rời khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh

Tính toàn thể của tế bào thực vật, khả năng tạo phôi mới và sự biểu hiện kiểu hình

là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuôi cấy tế bào thự vật trong môi trường lỏng, đặc biệt giúp kích thích tạo phôi đơn bội Quá trình phát sinh phôi soma được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin (thường sử dụng 2,4 D) và nước dừa ban đầu Sau đó, dùng nhiều xytokinin Myo-inositol và giảm lượng nitrogen Khi các cụm tiền phôi được tạo thành thì phải hạ thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong môi trường Sau đó, trình tự giống như quá trình tạo phôi giao tử (đơn bội) sẽ diển ra

Quá trình phát sinh phôi soma được quan sát lần đầu tiên ở một chi của họ

Umbelliferae được nuôi cấy trong môi trường lỏng Kể từ đó, quá trình này còn được

công bố ở nhiều cây hạt trần và cây hạt kín, bao gồm các loài cây cảnh, cây rau và cây lương thực cũng như cây thân gỗ

Phôi soma thường nhỏ và thích hợp cho các quy trình nhân sinh khối, chúng có thể được phân tách, đưa vào và khuấy trộn bằng một hệ thống tự động, sau đó có thể được cất trữ hay tạo ra cây con trực tiếp [2].Sản lượng và chất lượng phôi soma của nhiều loài thực vật đã được cải thiện nhờ vào hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Kết quả nghiên cứu của Cabasson và cộng sự (1997), đã so sánh quá trình phát triển phôi soma trong nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau Phôi soma hình thành từ nuôi cấy huyền phù tế bào được cấy vào môi trường thạch, lỏng lắc và tạm thời, thì 60% phôi trên môi trường thạch phát triển sang giai đoạn lá mầm, nhưng có hiện tượng mọng nước; mẫu trong hệ thống lỏng lắc thì ngăn cản sự hình thành của lá mầm và vỏ mô phân sinh ngọn do phôi soma không thể phát triển tiếp sau giai đoạn phôi cầu; trong hệ thống RITA, sự phát triển phôi soma được kích thích 66% phôi phát triển lá mầm và có

hình thái tương tự như phôi nhân.[4]

2.4.2 Sự nhân chồi

Hệ thống ngập chìm có tác dụng thức đẩy việc nhân

chồi khi nuôi cấy trên hệ thống lỏng, kết quả sinh trưởng

chồi thu được là tốt hơn trên đối tường cây Pinus radiata

thay vì cấy chuyền mỗi tháng trên môi trường rắn Trong hệ

thống Bioreactor, chồi có thể tăng trưởnglieen tục, vì thế cho

phép thu hoạch chồi sau mỗi tháng trong khoảng thời gian 18