Thiết Lập Hệ Thống Tái Sinh IN VITRO Cây Hoa Cúc (Chrysanthemum Sp.)

œMục đích đề tài: Tìm hiểu các thông số môi trường thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro, từ đó nuôi cấy thành cây hoa Cúc hoàn chỉnh in vitro làm cơ sở ch

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

************

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009

THIẾT LẬP HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum sp.)

Giảng viên hướng dẫn : TS TRẦN THỊ DUNG

TÓM TẮT

Đặng Thị Thu Thảo, Đại học Tôn Đức Thắng, Tp Hồ Chí Minh Tháng 12/2009,

với đề tài “Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro cây hoa Cúc Chrysanthemum

sp.)”, dưới sự hướng dẫn của TS Trần Thị Dung Đề tài được thực hiện tại Khoa

Khoa học ứng dụng, Trường Đại học Tôn Đức Thắng Thời gian thực hiện từ tháng 10/2009 đến 12/2009

œMục đích đề tài: Tìm hiểu các thông số môi trường thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro, từ đó nuôi cấy thành cây hoa Cúc hoàn chỉnh in vitro làm cơ sở cho vi nhân giống và các nghiên cứu chuyển gen có lợi ở cây hoa Cúc (Chrysanthemum sp.)

œPhương pháp nghiên cứu: Mẫu lá cây hoa Cúc in vitro được sử dụng để tiến hành khảo sát các thông số sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh chồi từ mẫu

lá cây hoa Cúc in vitro

- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây Cúc

in vitro trong môi trường agar và môi trường lỏng

- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo rễ cây hoa Cúc

in vitro

œKết quả đạt được: Các mẫu lá cây Cúc in vitro có thể tái sinh chồi trong môi

trường MS cơ bản có bổ sung 2 mg/l NAA + 2 mg/l 2,4-D + 4 mg/l BA Mỗi mảnh

mô sẹo lá có từ 1 – 2 chồi

Sau khi tái sinh, chồi được nhân nhanh để tạo số lượng lớn cây con in vitro trong

môi trường MS cơ bản có bổ sung 1 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA hoặc môi trường MS lỏng có bổ sung 5 mg/l GA3 + 0,05 mg/l NAA Các chồi mọc vươn lên khỏi môi trường, kích thích sự phát triển thân

Khi đạt số lượng chồi mong muốn, tiến hành tạo rễ trong môi trường MS cơ bản có

bổ sung 0,5 mg/l IBA Rễ mập, có nhiều lông hút, thích hợp để chuyển sang giai

đoạn ex vitro tạo cây hoa Cúc hoàn chỉnh

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt v

Danh sách các hình vi

Danh sách các bảng vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về cây hoa Cúc 3

2.1.1 Vị trí phân loại thực vật 3

2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 3

2.1.3 Tình hình sản xuất hoa Cúc 4

2.1.4 Giá trị kinh tế của cây hoa Cúc 5

2.1.5 Đặc điểm thực vật 5

2.1.6 Đặc điểm sinh thái 6

2.1.7 Kỹ thuật trồng 6

2.2 Khái niệm chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

2.2.1 Khái niệm chung 8

2.2.2 Các bước nhân giống in vitro .14

2.2.3 Một số kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro 15

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy 16

2.3 Các nghiên cứu trước đây về nuôi cấy mô cây hoa Cúc 25

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 29

3.1.1 Địa điểm 29

3.1.2 Thời gian 29

3.2 Nội dung nghiên cứu 29

3.3 Vật liệu thí nghiệm 29

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 29

3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm 29

3.3.3 Môi trường nuôi cấy 29

3.3.4 Điều kiện nuôi cấy 31

3.4 Phương pháp thí nghiệm 31

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro 31

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường agar 32

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường lỏng 33

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo rễ cây hoa Cúc in vitro 34

3.5 Phương pháp phân tích số liệu 34

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 52

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS: Môi trường Murashige và Skoog (1962)

BA: Benzyl adenine

IAA: Indole – 3 – acetic acid

IBA: Acid indolebutyric

NAA: 1 – naphthalene acetic acid

2,4-D: 2,4 – dichlorophenoxyacetic acid

GA 3 : Acid gibberellic

ĐC: Đối chứng

NSC: Ngày sau cấy

CĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây hoa Cúc 3

Hình 2.2 Quy trình chuyển gen vào thực vật bằng kỹ thuật đĩa lá nhờ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens 11

Hình 2.3 Một số giống hoa Cúc thuộc chi Chrysanthemum sp 28

Hình 4.1 Ảnh hưởng của NAA, 2,4-D và BA đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa

Cúc in vitro sau 40 ngày nuôi cấy 37

Hình 4.2 Ảnh hưởng của NAA, 2,4-D và BA đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa

Cúc in vitro sau 60 ngày nuôi cấy 38

Hình 4.3 Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong

môi trường agar 42

Hình 4.4 So sánh ảnh hưởng của BA và IBA đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro

trong môi trường agar .43

Hình 4.5 Ảnh hưởng của GA3 và NAA đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong

môi trường lỏng 45

Hình 4.6 Ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ cây hoa Cúc in vitro 47

Hình 4.7 Sơ đồ thiết lập hệ thống tái sinh in vitro từ mẫu lá cây hoa Cúc

(Chrysanthemum sp.) 48

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige – Skoog, 1962) 30

Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro 31

Bảng 3.3 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường agar 32

Bảng 3.4 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến

sự nhân chồi cây Cúc in vitro trong môi trường lỏng 33

Bảng 3.5 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

đến sự tạo rễ cây hoa Cúc in vitro 34

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh chồi từ mẫu

lá cây hoa Cúc in vitro 35

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây hoa

Cúc in vitro trong môi trường agar 39

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây hoa

Cúc in vitro trong môi trường lỏng 44

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo rễ cây hoa Cúc

in vitro 46

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU CHUNG

1.1 Đặt vấn đề

Từ xa xưa, chơi Cúc đã là một thú chơi tao nhã của các bậc học sỹ và các gia đình giàu có Trải qua nhiều năm, cùng với các kỹ thuật lai ghép, các phương pháp trồng hoa mới, chất lượng và chủng loại hoa Cúc đã được cải thiện rất nhiều Cho đến nay có khoảng 70 giống Cúc được trồng với mục đích cắt cành Cây hoa

Cúc (Chrysanthemum sp.) là một loài hoa trang trí phổ biến trên thế giới Hoa Cúc

rất đa dạng về màu sắc và hình dáng, là loại hoa cắt cành làm cảnh, loại cây hương liệu và dược liệu

Hoa Cúc nhanh chóng trở thành một trong những mục tiêu thương mại đầu tiên trong vi nhân giống, bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để sản xuất với số lượng lớn Có nhiều công trình nghiên cứu về nhân giống cây hoa Cúc ở nhiều quốc gia đã được báo cáo như nuôi cấy mô sẹo và tái sinh thành cây con, nuôi

cấy đỉnh sinh trưởng in vitro, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy các mô sẹo phát sinh từ

thân và lá và từ các phần của hoa [9]

Nhân giống sinh dưỡng ex vitro bằng cách cắt cành là một phương pháp

đơn giản được nông dân sử dụng ngoài đồng ruộng Tuy nhiên, các cây con thu nhận từ phương pháp này bị thoái hóa sau một vài thế hệ do bị nhiễm virus Ngoài nhân giống, các nghiên cứu tạo giống hoa có màu sắc mới lạ, các giống Cúc có mang gen chống chịu được sâu bệnh hay điều kiện thời tiết khắc nghiệt cũng được chú trọng, tuy nhiên do thường thực hiện bằng phương pháp lai tạo truyền thống nên thường gây đột biến, cho kết quả không như mong muốn Thời gian gần đây, nhờ sự can thiệp của các kỹ thuật di truyền đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong

lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật như chuyển nạp gen gfp nhờ Agrobacterium tumefaciens vào mẫu lá Cúc đại đóa giúp giống này có khả năng phát sáng Vì vậy,

đề tài “Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro cây hoa Cúc (Chrysanthemum sp.)” nhằm tìm ra môi trường thích hợp để tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro tạo thuận

lợi cho các nghiên cứu sau này về chuyển nạp gen cũng như các ứng dụng khác trên cây hoa Cúc

1.2 Mục đích

Tìm hiểu các thông số môi trường thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ

mẫu lá cây hoa Cúc in vitro, từ đó nuôi cấy thành cây hoa Cúc hoàn chỉnh in vitro

làm cơ sở cho vi nhân giống và các nghiên cứu chuyển gen có lợi ở cây hoa Cúc

(Chrysanthemum sp.)

1.3 Ý nghĩa của đề tài

Xác định được nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tái

sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro

Xác định được nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự

nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường agar và môi trường lỏng

Xác định được nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự

tạo rễ cây Cúc in vitro

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây hoa Cúc

Tên khoa học: Chrysanthemum sp Hình 2.1 Cây hoa Cúc

Tên tiếng Anh: Red – white chrysanthemum

Tên thông thường: Cúc hoa

2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố [25]

Cây hoa Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc Khoảng 500 năm trước Tây Lịch Khổng Tử đã đề cập đến việc trồng hoa Cúc Ở Nhật vào thế kỷ thứ 8 sau Tây Lịch mới có sự hiện diện của hoa Cúc Riêng Âu Châu, Cúc được mang vào Hà Lan năm 1688, nhưng việc trồng hoa Cúc thời này ở đây không thành công Đến năm 1789 M Blancard ở Marseilles đem ba loại Cúc từ Trung Hoa về Pháp, nhưng chỉ có một trong ba loại này sống được, đó là Cúc “Old Purple” và vì vậy đã được ghi trong lịch sử hoa Cúc Ở Anh cuối thế kỷ 18 người ta thấy có 8 loại Cúc được nhập cảng, đến năm 1824 có 24 loại và năm 1826 lên tới 48 loại Vào năm 1860, nhân dịp thăm viếng Nhật Bản, ông Robert Fortune đã đem về nhiều loại Cúc mới

về Châu Âu Trong sự phát triển hoa Cúc, chính sự lai giống tiếp của các loại Cúc này mà người ta được thêm nhiều giống mới nữa Ở Châu Úc, hoa Cúc được trồng tại Tasmania vào năm 1836, New South Wales 1843, Victoria 1855 và ở New Zealand 1860 Ở Mỹ cuối thế kỷ 19 Cúc được trồng rất nhiều Riêng hoa Cúc của Việt Nam hiện tại có xuất xứ từ Trung Hoa, Nhật và Châu Âu

Hoa Cúc được trồng phổ biến tại nhiều vùng trồng hoa của nước ta Trong đó, các vùng trồng lớn nhất là làng hoa ở Hà Nội, Mê Linh (Vĩnh Phúc), Nam Định và Đà Lạt Hoa Cúc được trồng làm cảnh tại Đà Lạt từ lâu nhưng thực sự

trở thành sản phẩm kinh tế từ năm 1995 Cho đến nay có khoảng trên 70 giống hoa Cúc được trồng với mục đích cắt cành tại Đà Lạt Giống hoa Cúc hiện nay chủ yếu xuất phát từ Hà Lan và du nhập vào Đà Lạt với nhiều hình thức khác nhau

2.1.3 Tình hình sản xuất hoa Cúc [4]

œ Trên thế giới

Trong ngành sản xuất hoa toàn cầu, hoa Cúc là loài hoa quan trọng thứ hai sau hoa Hồng Cúc được xem là một trong những loài hoa được ưa chuộng trên toàn thế giới

Ở Nhật Bản, hoa Cúc là quốc hoa từ năm 910, nên ngành sản xuất hoa Cúc đã mang lại lợi nhuận tăng lên 2 lần, chỉ trong vài thập niên gần đây, nhờ áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật cũng như do nhu cầu thưởng thức cuộc sống của người dân tăng nhanh Hoa Cúc ở Nhật bản chiếm đến 35% tổng sản phẩm hoa cắt cành trong cả nước

Trên thế giới, hàng năm Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa Cúc nhiều nhất với 2 tỷ cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu, Columbia 600 triệu, Italia 500 triệu, Mỹ 300 triệu Ở Anh, hoa Cúc là loài hòa cắt cành quan trọng đứng thứ 2 trên thị trường

Tại Nhật Bản, hoa Cúc cắt cành được sử dụng phổ biến: 40% được dùng làm quà tặng, 25% được dùng để trang trí trong các khách sạn hay trong các lễ hội, 25% được dùng trang trí trong các gia đình và cúng theo đạo Phật và 10% phục vụ trong việc giảng dạy, nghiên cứu

œ Tại Việt Nam

Ở nước ta, có nhiều loài cây dại thuộc họ Cúc mọc ở nhiều nơi Một số loài được dùng để làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như Bồ Công Anh

(Lactuca laciniata L.) Hoa Cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng

thế kỷ thứ 15 đến đầu thế kỷ thứ 16, lúc đó chủ yếu là dùng làm cảnh Mãi đến sau này, Cúc mới được trồng như một loại cây thương mại Hà Nội là nơi có diện tích trồng Cúc nhiều nhất với diện tích 450 ha, sau đó là Thành phố Hồ Chí Minh 370

ha Đà Lạt là vùng có diện tích trồng hoa Cúc lớn thứ 3 với diện tích 160 ha

Tại Lâm Đồng, hầu hết diện tích trồng Cúc tập trung ở thành phố Đà Lạt,

ở các huyện Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương,…diện tích không đáng kể Mặc

dù được trồng từ khá lâu, nhưng hoa Cúc thành sản phẩm thương mại mới từ 1995

Diện tích trồng hoa Cúc tại Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đầy Diện tích trồng chiếm đến 40 – 50% diện tích trồng hoa nói chung Trong việc trồng hoa Cúc, bà con nông dân đã áp dụng nhiền biện pháp kỹ thuật như dùng hệ thống đèn chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kính,…Đa số hoa Cúc ở Đà Lạt được trồng với mục đích cắt cành Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường 10 – 15 triệu cành Đà Lạt hiện có khoảng 70 giống được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều con đường khác nhau: chính thức và không chính thức Do đó, việc xác định tên thương phẩm và chủng loại cho từng chủng loại Cúc là rất khó khăn

2.1.4 Giá trị kinh tế của cây hoa Cúc [ 24, 25]

Cây hoa Cúc là một trong những loài hoa có giá trị kinh tế cao được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới Hoa Cúc được chơi nhiều cách, trồng đại trà

để cắt hoa cắm bình, lọ, bát, trồng trong bồn nhậu để trang trí trong nhà, đặt trên bồn ghế hay ngoài sân, ngoài hiên, trên ban công Có những giống trồng trên ban công, thân lá rũ xuống trông xa như một dòng suối, màu hoa vàng gọi là kim tuyền (suối vàng), màu hoa trắng gọi là ngân tuyền (suối bạc) Đặc biệt hoa Cúc không rụng cánh như hoa Hồng và nhiều loài hoa khác nên rất ưa được trang trí trên bàn thờ, nóc tủ, hơn nữa đa số các giống Cúc hoa đều có màu sắc thanh nhã và dịu dàng Việc trồng cây hoa Cúc đã đang và sẽ mang lại lợi nhuận cao cho nghề trồng hoa

Hoa Cúc còn có tác dụng thanh nhiệt, giải nhiệt và mụn nhọt nên được ứng dụng rộng rãi trong việc ăn uống để chữa bệnh, như pha chế thành đồ uống, bánh điểm tâm, làm món ăn trong bữa ăn hàng ngày Trong thức ăn hàng ngày, dùng hoa Cúc bày ở xung quanh mép đĩa, dùng cánh hoa làm món rau xào, nước hoa Cúc đem nấu canh Hoa Cúc nấu với bột cua là một trong những món ăn nổi tiếng của Trung Quốc

Có người dùng hoa Cúc phối hợp với những vị thuốc như bạch chỉ chẳng hạn làm thành gói thuốc, dùng để điều trị cho trên 1,000 bệnh nhân mất ngủ, đã kéo dài thêm giấc ngủ được trên 2 giờ, tỷ lệ hữu hiệu trên 90 %, không có bất cứ một phản ứng phụ nào Đối với người già và người huyết áp cao lại càng thích hợp Trẻ

em dùng gói thuốc hoa Cúc có thể phòng chữa bệnh rôm sảy

2.1.5 Đặc điểm thực vật [4, 19, 20]

Rễ: Cúc có hệ rễ chùm, mọc cạn theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10 –

20 cm, rễ Cúc có kích thước khá đều nhau, với số lượng rễ lớn nên khả năng hút

nước và chất dinh dưỡng rất mạnh Do Cúc được nhân giống bằng phương pháp vô tính, nên rễ mọc ngang từ các mấu thân ở gần mặt đất

Thân: thân hoa Cúc là thân thảo nhỏ, mọc nhiều đốt, mọng nước, giòn,

dễ gãy Trên thân non một số loài có phủ một lớp lông tơ, một số loài có dạng thân

bò Chiều cao thân tùy loài, nhưng đa số các giống nhập thì có thân to, giòn, thẳng Các giống nội địa có thân nhỏ, mảnh, cong

Lá: lá Cúc thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, mọc sole Bản lá có xẻ

thùy hình lông chim Phiến lá mỏng, phía dưới có phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn Gân lá hình mạng Mỗi cây có từ 30 – 50 lá

Hoa, quả: hoa Cúc về cơ bản là hoa lưỡng tính, có nhiều màu sắc khác

nhau, thích nghi với việc thụ phần nhờ sâu bọ Hoa nhỏ, sít nhau và luôn tập trung thành cụm hoa đầu để một sâu bọ có thể thụ phấn nhiều hoa cùng một lúc Đế hoa lồi lên Hoa ở giữa là hoa hình ống, hoa ở ngoài là hoa thìa lìa giả

Ở Cúc, quả là quả bế, chỉ có một hạt mầm nằm trong khoang của quả và đôi khi dính với vỏ quả Vỏ hạt rất mỏng, phôi lớn và thẳng, không có nội nhủ Quả phát tán nhờ gió và động vật

2.1.6 Đặc điểm sinh thái [4]

Khí hậu: Đa số loài Cúc thích nghi với khí hậu ôn hòa, mát mẻ, lượng

mưa đầy đủ, nhất là những hoa được nhập từ vùng ôn đới Với nhiệt độ trên 250C, Cúc sinh trưởng và phát triển kém

Đất đai: Cúc ít đòi hỏi về điều kiện đất đai Thích hợp với đất acid nhẹ,

pH khoảng 6,0 – 6,5 Phát triển tốt trên đất có độ ẩm tốt, thoáng khí, giàu chất hữu

cơ, đặc biệt có phân chuồng Trước khi trồng, cần làm đất tốt, cày sâu 20 – 40 cm

để đảm bảo thoáng khí và bón lót đầy đủ phân hữu cơ Cần chú ý không bón phân khi cây bước vào giai đoạn ra hoa

2.1.7 Kỹ thuật trồng [4]

Nước tưới: Cúc chỉ có thể sống sót trong thời gian khô hạn ngắn, nếu

khô hạn kéo dài sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Vì vậy, tưới nước rất quan trọng với Cúc nhất là vào mùa khô Cần tưới một cách đều đặn và kỹ lưỡng, đảm bảo nước thấm xuống đất ít nhất 12 – 15 cm, cần chú ý tránh làm tổn thương cây do những tia nước quá mạnh Những tổn thương này là nguyên nhân để virus xâm nhập, các vi khuẩn và nấm phát triển

Bón phân: Bón phân đúng phương pháp không những làm tăng năng

suất, phẩm chất mà còn cải thiện được lý, hóa tính của đất, tiết kiệm được phân Trái lại, không những lãng phí phân bón mà còn làm cho cây sinh trưởng, phát triển không cân đối, bị sâu bệnh tấn công Phải tuân theo nguyên tắc bón phân: đúng lúc, đúng cách, đúng liều lượng

œ Công thức bón cho 1000 m2 cây hoa Cúc:

Bón lót: 50 – 100 kg vôi bột (bón trước khi bón phân hữu cơ 5 – 7 ngày),

100 kg phân hữu cơ sinh học Better HG01, 0,5 – 1 tấn phân chuồng hoai

Bón thúc:

Tưới thúc (sau trồng 10 và 20 ngày): hòa tan 10 – 15 kg phân NPK Better và TE trong nước để tưới vào gốc

Bón thúc lần 1 (sau trồng 25 – 30 ngày): 10 – 15 kg phân NPK Better và TE

Bón thúc lần 2 (sau trồng 40 – 45 ngày): 10 – 15 kg phân NPK Better và TE

Bón thúc lần 3 (sau trồng 55 – 60 ngày): 10 – 15 kg phân NPK Better và TE

Ngoài ra còn có thể kết hợp phun phân bón lá Better HG – Best farm, Better HG – Best plant

Phòng trừ bệnh

Bệnh virus: Hiện nay chưa có thuốc phòng chống các loại bệnh do virus gây ra

Biện pháp tốt nhất là loại bỏ cây bị nhiễm bệnh virus ngay từ vuờn giống và thường

xuyên phun thuốc phòng ngừa để loại bỏ các vectơ lây truyền

Bệnh nấm-khuẩn: Có nhiều nguyên nhân gây bệnh, cần xác định rõ từng loại bệnh

để có biện pháp phòng ngừa hữu hiệu Các dạng bệnh thường gặp là:

- Gốc cành giâm bị thối ướt, màu đen nhạt, do Pythium debaryanum gây ra

- Vết chết hoại màu nâu: do Rhizoctonia solanii và Phytophtora cryptoyea

- Vết thối ở gốc, có màng tơ trắng: do Sclerotinia minor và Sclerotinia sclerotiorum

- Trên lá xuất hiện bột phấn trắng, do Erysiphe cichoracearum gây ra

- Mặt trên lá có những đốm màu vàng sau đó chuyển thành nâu đen, lá bị khô héo

Bệnh do Septoria chrysanthemi gây ra

- Mặt dưới lá có những mụn tập trung, màu nâu: do Puccinia chrysanthemi gây ra

- Vết tổn thương bị loét, gây ra sự nứt thân, lá khô héo và lây nhiễm mạnh Bệnh

gây ra do Erwinia chrysanthemi

Biện pháp phòng chống tốt nhất là xử lý đất canh tác, bổ sung dinh dưỡng cân đối

và đúng thời gian để cây tăng sức chống chịu, giữ ẩm độ vừa phải (không quá khô

và quá ẩm), phun phòng định kỳ bằng các loại thuốc chống nấm bệnh với liều lượng khuyến cáo

Với một số bệnh thường gặp, sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật như sau:

- Bệnh lở cổ rễ sử dụng Benlat, Topsin M, Monceren… phun vào gốc cây

- Bệnh rỉ sắt: sử dụng các thuốc Daconil, Sumi eight, Score, Bayfidan, Bonaza, Anvil…

- Bệnh cháy lá do Alternaria sp sử dụng Rovral, Anilazine

2.2 Khái niệm chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô

tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm trên môi trường xác định ở điều kiện vô trùng Môi trường bao gồm các nhân tố thiết yếu đa lượng và vi lượng, chất điều hòa sinh trưởng, đường, vitamin và một số hợp chất hữu cơ cần thiết khác

Tế bào thực vật có tính toàn thế, tế bào đơn hoặc protoplast thực vật đều

có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh Đây là điều kiện quan trọng để ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa hoặc rễ tạo thành cây hoàn chỉnh nhờ vào sự điều chỉnh

môi trường nuôi cấy in vitro

2.2.1 Khái niệm chung

2.2.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô [1]

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schneiden và Shwann đã đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: tất cả các sinh vật đều cấu tạo từ tế bào, những

tế bào mới được tạo nên từ sự phân chia của những tế bào trước nó có sự giống nhau căn bản về thành phần hóa học và các hoạt tính trao đổi chất giữa tất cả các loại tế bào và hoạt động của cơ thể là sự tích hợp hoạt tính của các đơn vị tế bào độc lập

Ý kiến cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in vitro)

đã được nhà khoa học Haberlandt thử nghiệm rất sớm (từ những năm 1902) nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công Mô động vật được cấy

trước tiên do A Carrel (1919), đến năm 1934 mô thực vật được chọn làm đối tượng nuôi cấy mô mới thử nghiệm thành công

Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua

Năm 1937, Gautheret và Nobecourt đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một khoảng thời gian dài trên môi trường thạch cứng

Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô phôi cà Trong thời gian này chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công

Năm 1948, Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt

Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều hòa

sự nhân chồi

Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin Sau

đó các chất cytokinin khác như BAP, 2IP, zeatin cũng được phát hiện

Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về tỷ lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá

Năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đã phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh

Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ đã được dùng làm cơ

sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay

Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính cây Lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết quả đó, cây Lan được xem là cây nuôi cấy

mô lần đầu tiên được thương mại hóa Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều loại cây khác nhau và được ứng dụng thương mại hóa

Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn và ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây Sen cạn và cây Đậu trắng từ môi trường nuôi cấy tối thiểu Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa

hoàn thiện Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy

2.2.1.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô [1]

- Tạo được số lượng cây giống lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện tích

và không gian nhỏ trong phòng thí nghiệm, có thể kiểm soát được các điều kiện vật

lý và hóa học

- Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến

- Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy hạt phấn

- Tạo dòng lai soma và lai tế bào trần

- Tạo được nhiều cây con từ các mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, noãn, chồi, phát hoa và rễ) mà ngoài tự nhiên không thực hiện được

- Cố định nitrogen

- Cải thiện hiệu quả quang tổng hợp

- Bảo quản các nguồn gen

- Loại bỏ được các mầm bệnh như: nấm, virus, một số vi sinh vật khác gây bệnh cho cây thông qua phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt

- Cải thiện tính trạng thực vật

Ngoài những ứng dụng trên, các nghiên cứu cải tiến giống cây trồng bằng công nghệ sinh học cũng rất được quan tâm Trong những cải tiến đó, chuyển nạp gen vào thực vật đã và đang mang lại nhiều lợi ích cho các giống cây trồng

Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ

thuật chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens vẫn được ứng dụng rộng rãi Agrobacterium tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật

sống trong đất, trong lĩnh vực biến nạp gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển các gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các đặc tính mong muốn

Để thực hiện việc chuyển gen nhờ vi khuẩn người ta sử dụng kỹ thuật đĩa

lá Tạo các đĩa lá của thực vật cần chuyển gen sau đó xử lý các đĩa lá trong dung

dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang các plasmid chứa gen mong muốn

đã được thiết kế lại trong vài chục phút, trong dung dịch có bổ sung acetosyringone

để tăng cường khả năng hoạt hoá gen vùng vir qua đó thúc đẩy thêm quá trình chuyển gen Sau giai đoạn này rửa sạch lá bằng dung dịch kháng sinh cefotaxime để

diệt hết khuẩn Nuôi cấy đĩa lá trên môi trường tái sinh và tạo cây Chọn lọc các cây mang gen chuyển vào qua sự phát hiện các gen bị chỉ thị Phát hiện các gen chuyển vào qua phân tích ADN và đánh giá sự thể hiện của gen qua biotest

Hình 2.2 Quy trình chuyển gen vào thực vật bằng kỹ thuật đĩa lá nhờ vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

2.2.1.3 Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát sinh hình thái của cây

[11]

Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy

Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy là một nhân tố môi trường quan trọng, nó ảnh hưởng đến mối quan hệ về nước của mẫu cấy bởi vì mối quan hệ này tác động lên các quá trình sinh hoá và sinh lý Tanaka và cộng sự (1992) đã thấy rằng có sự liên hệ tích cực giữa việc giảm độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy với việc gia tăng sự kháng của lá đối với sự thoát hơi nước của cây Khoai tây nuôi cấy

in vitro Sự điều khiển độ ẩm tương đối thích hợp có thể góp phần vào việc cải thiện chất lượng và năng suất của cây được nuôi cấy in vitro Độ ẩm tương đối trong bình

nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào số lần trao đổi khí trong một giờ và độ ẩm tương đối của phòng nuôi cấy Việc giảm độ ẩm tương đối trong môi trường nuôi cấy sẽ

cải thiện được chức năng của khí khổng Những bằng chứng thu được cho thấy rằng

độ ẩm tương đối đóng vai trò chính trong hiện tượng thủy tinh thể

Hộp nuôi cấy kín gây điều kiện bất lợi cho sự tăng trưởng của cây in vitro

do độ ẩm trong hộp tăng cao so với độ ẩm ngoài hộp Độ ẩm ảnh hưởng đến khả năng hấp thu nước, các chất khoáng và khả năng sống của cây khi ra khỏi ống nghiệm Độ ẩm cao làm lá phát triển không bình thường, thay đổi về hình thái cấu trúc và chức năng sinh lý, như hiện tượng thủy tinh thể, lớp cutin mỏng, chức năng đóng mở của khí khổng giảm

Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có dải bước sóng từ 400 – 700 nm với đỉnh từ 600 – 680 nm Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, kéo dài đốt thân, ) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400 – 500

nm (xanh lam), 600 – 700 nm (đỏ), 700 – 800 nm (siêu đỏ)

Nhu cầu ánh sáng của cây được phân tích ở những thông số khác nhau:

độ sáng bởi đơn vị diện tích (hoặc cường độ) thể hiện bởi w/m2, thời gian chiếu sáng thể hiện bằng giờ/ngày và chất lượng phổ của ánh sáng nhận được Trước đây, cường độ ánh sáng được đo bằng đơn vị lux, nhưng nó lại tùy thuộc vào sinh lý của mắt người đo, mắt người lại nhạy với ánh sáng xanh lá cây hơn là xanh lam và đỏ nên hoàn toàn không phù hợp với nhu cầu của thực vật Do đó, hiện nay, trong các nghiên cứu về thực vật người ta sử dụng đơn vị đo cường độ ánh sáng là PPF (photosynthesis photon flux), tính bằng µmol m-2 s-1, nghĩa là số lượng photon tham gia trong quá trình quang hợp đồng thời cũng tham gia trong quá trình phát sinh hình thái, tính trên đơn vị diện tích 1 m2 lá trong thời gian 1 giây Chất lượng ánh sáng (light quality), thời gian chiếu sáng (photoperiod) và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô

Cường độ ánh sáng mà cây hấp thụ được là rất quan trọng và được tính toán ở khoảng ngang với cây Tuy nhiên, cũng có những báo cáo tính theo cường độ ánh sáng bên ngoài, phía trên hộp nuôi cấy hoặc trên kệ trống của phòng sáng Cường độ ánh sáng trên kệ trống xấp xỉ gấp 2 lần cường độ ánh sáng ở mức ngang với cây trong bình, do đó loại vật liệu được dùng để làm hộp và nút đậy bình phải đảm bảo cho những ánh sáng khác nhau đi qua

Để sự quang hợp của cây là tối đa, trong nuôi cấy thoáng khí và quang tự dưỡng người ta kết hợp nồng độ CO2 cao với cường độ ánh sáng cao (từ 200 – 300 µmol m-2 s-1) Tuy nhiên khi cường độ ánh sáng cao sẽ làm tăng nhiệt độ trong những bình nuôi cấy, làm thay đổi môi trường xung quanh cây, ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và phát triển của cây Do đó, khi sử dụng ánh sáng cao, cần có biện pháp để giảm tối đa sự tăng của nhiệt độ

Nhiệt độ

Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trường khác có ảnh hưởng rõ ràng là nhiệt độ Nhiệt độ phòng nuôi cây thường được điều chỉnh ổn định từ 20 – 250C, vì nhiệt độ bên trong bình nuôi cấy thường cao hơn 20C so với nhiệt độ của phòng nuôi do tác động của hiệu ứng nhà kính

Môi trường in vitro

Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy Môi trường in vitro có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển hình thái của cây in vitro Một số vấn đề của môi trường in vitro là mức độ quang hợp thấp không

cân bằng CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dưỡng hạn chế, Vì

vậy, cây con in vitro sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị về hình thái và chất lượng

mẫn cảm với stress ở giai đoạn thuần hóa

Đặc tính của môi trường in vitro và phản ứng của cây con in vitro với môi trường có mối tương quan Do đó việc kiểm soát môi trường in vitro được đặt ra để

điều khiển sự sinh trưởng

Hiện tượng thủy tinh thể

Những cây thân thảo và thân gỗ nhân giống in vitro thường xuyên bị ảnh

hưởng bởi sự dư thừa của nhiều nhân tố nuôi cấy Điều này dẫn đến sự rối loạn biến dưỡng và hình thái Những bất thường về hình thái giải phẫu và sinh lý trong nuôi cấy mô đã được miêu tả bằng rất nhiều thuật ngữ: hiện tượng thủy tinh thể, sự tích lũy nước quá mức, sự mọng nước và hiện tượng trong vắt như thủy tinh Mặc dù vậy, thuật ngữ “vitrification” là thuật ngữ chính vì nó đề cập được một quá trình sinh lý chứ không phải là một quá trình sinh học, nó là thuật ngữ được dùng nhiều nhất để diễn tả sự thay đổi của lá dẫn đến hiện tượng thủy tinh thể Một vài đặc điểm có thể thấy rất rõ trên lá của cây Cẩm chướng: sự rối loạn mà nó biểu hiện chủ yếu trên lá, tác động lên hai quá trình chính được thực hiện bởi lá, đó là sự quang

hợp và sự trao đổi khí (CO2, hơi nước) Sự bất thường về hình thái giải phẫu cũng được biểu hiện với mức ít phổ biến hơn trên thân và rễ Những rối loạn tiếp tục

ngăn cản những cây vi nhân giống có thể phát triển trong điều kiện ex vitro Các điều kiện đặc biệt cần thiết cho việc nhân nhanh chồi in vitro như độ ẩm cao, dư

thừa chất dinh dưỡng, có mặt các chất khoáng, đường và các chất điều hòa sinh trưởng ở nồng độ cao, cường độ ánh sáng thấp là nguyên nhân chính được chứng minh là có khả năng cảm ứng việc hình thành những chồi biến dị Những bằng chứng hiện nay xác định rằng độ ẩm tương đối và thế nước là những nhân tố chủ

yếu tham gia vào quá trình phát sinh hình thái bất thường trong điều kiện in vitro

Hiện tượng thủy tinh thể có thể xảy ra cả ở trong môi trường rắn cũng như môi trường lỏng Hiện tượng này đặc biệt phổ biến nếu cây có quá nhiều lượng nước sẵn có, điều này thường thấy ở trường hợp nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường có hàm lượng thạch thấp

2.2.2 Các bước nhân giống in vitro [1]

Nhân giống cây trồng in vitro gồm các bước cơ bản sau:

- Tạo thể nhân giống in vitro

- Nhân giống in vitro

- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

- Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

2.2.2.1 Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân

giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối

với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo) Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác Trước khi tạo các thể nhân giống, các mẫu ban đầu thường được khử trùng bằng hóa chất để loại bỏ những mầm bệnh gây hại cho cây

2.2.2.2 Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng số lượng mẫu trong nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi

trường tạo thể chồi Giai đoạn này cây cần có một lượng cytokinin ngoại sinh cao

để kích thích sự hình thành cụm chồi, đôi khi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng giảm thấp làm cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy

thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân giống in vitro ở

trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài

2.2.2.3 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn

bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất điều hòa quá trình tạo rễ thuộc nhóm auxin Điều kiện nuôi cấy gần với điều

kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro

2.2.2.4 Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

Đây là một giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì nó

quyết định chi phí sản xuất cây giống Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn

định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ cao, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao Cây con thường được trồng trong các luống ươm, trên các vĩ xốp hoặc trên các bầu đất cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ

2.2.3 Một số kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro [5]

2.2.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương pháp tạo ra cây giống sạch

bệnh và trẻ hóa hiệu quả nhất trong nhân giống vô tính in vitro Sau khi vô trùng,

mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ, hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Từ một đỉnh sinh trưởng mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay cụm chồi

Chồi tiếp tục phát triển và phân hóa tạo tán cây và rễ Cây con được chuyển ra đất dần dần thích nghi và phát triển thành cây trưởng thành

2.2.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản biệt hóa của các tế bào đã phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường được bổ sung nồng độ auxin cao Mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thích hợp

2.2.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng để tăng sinh khối Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng, tế bào đơn được trải trên môi trường agar Khi môi trường thạch được bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm mô sẹo Khi môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.2.3.4 Nuôi cấy tế bào trần – chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì chức năng sẵn có Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép tạo giống cây trồng mới Quá trình dung hợp có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy 2.2.4.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy lên khả năng phát sinh hình thái của cây[11]

Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự

sinh trưởng và phát triển in vitro Những ảnh hưởng có thể được tóm tắt như sau:

Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Crucferae là những loài dễ tái sinh nhất

Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các giống lai

Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinaceae hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều

hòa sinh trưởng

Tuổi của cây

Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao, do đó ở Ngũ cốc người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây con dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi Một vài ví dụ cụ thể chỉ sự khác nhau về khả năng tái sinh và

phân chia tế bào giữa cây già và cây in vitro: Hedera helix, Lunaria annua và Anthurium andreanum Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ được những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều

kiện ban đầu Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do gia tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được Hackett

(1985) chứng minh trên những đối tượng như: Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonoca Sự hình thành chồi bất định là một trong những phương

pháp giúp trẻ hóa

Tình trạng sinh lý

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế

bào in vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái

sinh hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây Huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản Các chồi của cây

trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của

những cây đã trải qua giai đoạn ngủ đông

Tình trạng sức khỏe

Vào thời điểm tiến hành nuôi cấy in vitro, nếu sử dụng các bộ phận của

cây trong tình trạng khỏe mạnh thì khả năng nuôi cấy thành công cao hơn Do đó, nên chọn mẫu từ những cây khỏe mạnh và sinh trưởng bình thường nhất làm thí

nghiệm vì điều này ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm và khả năng tái sinh của mẫu sau khi được tách khỏi cây mẹ

Điều kiện phát triển

Các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong tự nhiên phản ứng khác với các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong nhà kính Nhìn chung, những mẫu cấy ban đầu có nguồn gốc từ nhà kính thường ít bị bệnh, dễ tái sinh hơn vật liệu bên ngoài ví dụ như cây

Rhododendron Điều kiện phát triển của những cây nở hoa vào mùa đông như Begonia có ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành chồi và rễ bất định trong nuôi cấy in vitro

Vị trí của mẫu cấy trên cây

Các mẫu cấy được lấy từ thân chính hoặc các chồi bên ở một số cây thân

gỗ sẽ giữ nguyên đặc tính di truyền này đối với cây con nuôi cấy mô nghĩa là đối với các mẫu lấy từ thân chính thì cây cấy mô sẽ phát triển thành cây trưởng thành và tạo nhiều cành ngang, ngược lại nếu mẫu cấy được lấy từ các cành ngang thì cây cấy mô cũng chỉ phát triển ở dạng cành ngang, không tạo được thân chính như cây gieo hạt Sự bảo lưu đặc điểm di truyền này thể hiện rất rõ ở các cây giâm cành

Hiện tượng bảo lưu di truyền ở cây Pseudotsuga menziesii đã được nghiên cứu,

những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi

trường in vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách Sự hình thành

chồi bất định của các mẫu cấy lan Dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của

cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau

Kích thước mẫu cấy

Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏi cây tự nó cung cấp dự trữ chất dinh dưỡng và hormon, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh

dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn

những cơ quan ít dự trữ Đối với những mẫu bị cắt, tỷ lệ bề mặt dễ bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk chứng minh vào năm 1984

Vị trí của các mẫu cấy đặt trên môi trường nuôi cấy

Các mẫu cấy có thể đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọn xuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu cấy được cấy không cực Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuyếch tán vào trong thạch do nó không tiếp xúc với môi

trường Như ở trường hợp tất cả cây thuộc họ Amaryllidaceae, sự tái sinh chỉ xảy ra

ở phần gốc của vảy hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực

Ảnh hưởng của nhân tố khoáng

Chất khoáng là một trong những nhóm chất dinh dưỡng quan trọng cần

cho sự phát triển của cây in vitro Sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng phụ

thuộc nhiều vào loại cây thí nghiệm Môi trường Murashige và Skoog (1962) là môi trường phổ biến nhất vì hầu hết các loài cây có thể thích nghi được Tuy nhiên, cần lưu ý rằng dung dịch dinh dưỡng không phải lúc nào cũng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển vì nồng độ muối khoáng trong dung dịch quá cao Ví dụ cây

Đồng tiền rất nhạy cảm với muối đa lượng in vitro Môi trường thích hợp cho một

số loài thân gỗ nhạy cảm với muối gọi là môi trường WPM (woody plant medium) Khi lựa chọn sự kết hợp giữa muối đa lượng và vi lượng cần chú ý những vấn đề sau:

- Nồng độ tổng cộng đôi khi rất quan trọng Môi trường Knop (1884) là môi trường nghèo muối và môi trường Murashige và Skoog là môi trường giàu muối

- Trong một số trường hợp nitrogen được cung cấp dưới dạng hữu cơ nhưng thông thường nó được cung cấp ở dạng NH4+ và NO3- Tổng lượng N cần thiết từ 12 – 60 mM l-1, trong đó hàm lượng NH4+ từ 6 – 10 mM l-1 và hàm lượng NO3-từ 6 –

40 mM l-1 Hầu hết các cây ưa thích NO3- hơn NH4+ tuy nhiên cũng có một số trường hợp ngoại lệ Chúng ta cần tìm ra tỷ lệ NO3-/NH4+ thích hợp cho sự sinh

trưởng phát triển in vitro

- Nếu cây hấp thụ ion NH4+, pH của môi trường bị giảm xuống và thạch trở nên lỏng pH của môi trường giảm xuống do cây giảm hấp thụ NH4+ dẫn đến sự hấp thu NO3- tăng lên

- Hàm lượng K+ cần thiết nằm trong khoảng 2 – 26 mM Trong khi nồng độ các ion khác như H2PO4-, Ca2+, Mg2+ rất thấp

2.2.4.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và

phát triển của thực vật [2, 4, 5]

Đặc tính chung của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Chất điều hòa sinh trưởng có thể là những chất tự nhiên được sản sinh với một lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo Những chất điều hòa sinh trưởng này được vận chuyển đến các bộ phận khác của cơ thể, gây nên những tác động điều tiết của cây

Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng là khởi động cho sự hình thành các phản ứng cá biệt hay các quá trình sinh lý nhất định hoặc trì hoãn quá trình đó Chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây ở nồng độ rất thấp, ngược lại ở nồng độ cao chúng trở nên độc hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của cây Ví dụ 2,4-D dùng ở nồng độ thấp có tác dụng kích thích sự tạo rễ nhưng ở nồng độ cao thì có thể sử dụng như các chất diệt cỏ dại Chất điều hòa sinh trưởng tác động vào các hoạt động sinh l ý của cây như kéo giãn các thành tế bào và kích thích sự phân hóa tế bào Các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh Trái lại các chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế Các chất điều hòa sinh trưởng thức vật gồm 2 nhóm chính là auxin và cytokinin, ngoài ra gibberelin và ethylen cũng có vai trò quan trọng với sự sinh trưởng, phát triển và trao đổi chất ở thực vật

Auxin

œ Tác dụng sinh l ý của auxin

Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động lên sự giãn của thành tế bào: IAA gây ra sự giảm pH trong

thành tế bào, hoạt hóa enzyme phân hủy các polysacarit liên kết giữa các sợi xenluloz làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kiện cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu không bào trung tâm Ngoài ra auxin cũng kích thích lên thành tế bào đặc biệt là xenluloz, pectin, hemixenluloz Bên cạnh đó auxin còn ảnh hưởng lên sự phân chia của tế bào Tuy nhiên các ảnh hưởng của auxin lên sự giãn

và phân chia của thành tế bào trong mối tác động tương hỗ với các phytohoocmon khác (giberelin, cytokinin)

Auxin gây ra tính hướng động của cây, auxin gây ra hiện tượng ưu thế ngọn, auxin kích thích sự hình thành rễ: trong sự hình thành rễ đặc biệt là rễ phụ hiệu quả của auxin là rất đặc trưng Sự hình thành rễ phụ có thể chia ra làm 3 giai đoạn: giai đoạn đầu là phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh; tiếp theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ và ra ngoài Để khởi xướng sự phản phân hóa của tế bào mạnh mẽ thì cần hàm lượng auxin khá cao Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin hơn nếu hàm lượng auxin cao sẽ có tác dụng gây ức chế sự phát triển của rễ Vai trò của auxin trong sự phân hóa rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô, trong kỹ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kỳ quan trọng và bắt buộc Auxin kích thích sự hình thành, sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt Auxin kiềm hãm sự rụng lá, tăng sự tạo quả và phòng rụng nụ, quả non, làm tăng năng suất cây trồng Auxin ảnh hưởng lên sự vận động của nguyên sinh chất, tăng tốc độ lưu động của nguyên sinh chất, ảnh hưởng lên các quá trình trao đổi chất, kích thích sự tổng hợp các polyme và ức chế sự phân hủy của chúng, ảnh hưởng đến các hoạt động như quang hợp, hô hấp, sự vận chuyển các chất trong cây Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh được thực vật tổng hợp và auxin tổng hợp do con người tạo ra

œ Cơ chế tác dụng của auxin lên sự sinh trưởng của cây

Cơ chế tác dụng của auxin chủ yếu là tác dụng lên sự giãn của các tế bào,

sự giãn của các tế bào thực vật xảy ra do hai hiệu ứng: sự giãn của thành tế bào và

sự tăng thể tích, khối lượng nguyên sinh chất Đã từ lâu người ta phát hiện ra hiện tượng “sinh trưởng acid” tức là trong điều kiện pH thấp (pH = 5) thì sự sinh trưởng của tế bào và mô được kích thích Điều này do ion H+ đã hoạt hóa enzyme phân giải các cầu nối ngang polysacarit giữa các sợi xenluloz với nhau làm cho các sợi

xenluloz tách rời nhau và rất dễ trượt lên nhau Dưới ảnh hưởng của sức trương tế bào do không bào hút nước vào mà các sợi xenluloz đã mất liên kết, lỏng lẻo rất dễ trượt lên nhau làm cho thành tế bào giãn ra Vai trò của auxin ở đây là gây nên sự thay đổi pH cho thành tế bào, bằng cách hoạt hóa bơm proton (H+) nằm trên màng sinh chất

Các loại auxin tổng hợp thông dụng thường dùng: IAA, IBA, NAA, 2,4-D Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid có trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi soma trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Chúng được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa và

ở trên các quả còn non Auxin lưu thông từ đỉnh xuống phần dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxi hóa do hoạt động của auxin – oxydase, điều này cho thấy các nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp

ra chúng Như vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức độ các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo cho sự nhân giống và kéo dài tế bào

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ từ các đoạn cắt

sự hóa già của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và tăng cường hoạt động của một số enzyme

Nồng độ BA cao (1 – 5 ppm) kích thích sự phát triển của chồi đỉnh và

đầu rễ của cây Atropa belladona Khi sử dụng kinetin để nhân nhanh cây Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 1 – 5 mg/l Không phải các chất điều hòa sinh trưởng

ngoại sinh tác dụng độc lập với các chất điều hòa sinh trưởng nội sinh Tác dụng phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát

sinh hình thái của tế bào và mô Tốc độ tái sinh chồi của cây Plantago ovata tăng

cao khi môi trường sử dụng kinetin từ 4 – 6 µM phối hợp với NAA 0,05 µM Khi tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN dẫn đến quá trình mitos và cảm ứng sự phân chia tế bào Cytokinin có vai trò quan trọng trong quá trình phân chia tế bào, cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường

œ Tác dụng sinh l ý của cytokinin

Hiệu quả sinh l ý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là kích

thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ Có được hiệu quả này là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp acid nucleic và protein

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi Từ lâu người ta đã chứng minh rằng sự cân

bằng tỷ lệ giữa auxin và cytokinin có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát

sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng như trên cây nguyên vẹn Nếu tỷ lệ

auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin sẽ kích thích sự xuất hiện và phát triển của chồi Để tăng hệ số nhân giống, người ta

tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro

Cytokinin có khả năng kiềm hãm sự hóa già của cơ quan và của cây nguyên vẹn Cytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt

và củ Vì vậy nếu xử l ý cytokinin cũng có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt,

củ và chồi

Ngoài ra trong mối tương tác với auxin, cytokinin có ảnh hưởng tới ưu thế ngọn của cây Cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều Chính vì vậy mà từ rễ (cơ quan tổng hợp cytokinin) lên chồi ngọn (cơ quan tổng hợp auxin) thì hiện tượng ưu thế ngọn càng tăng dần tương ứng với sự tăng hàm lượng auxin và giảm hàm lượng cytokinin

Cytokinin còn ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất như quá trình sinh tổng hợp acid nucleic, protein, clorophin và do đó ảnh hưởng đến các hoạt động

sinh l ý của cây

œ Cơ chế tác dụng của cytokinin lên sự sinh trưởng của cây

Cytokinin tác động lên quá trình phân hóa tế bào, đến các quá trình phát sinh cơ quan, kìm hãm sự hóa già, có lẽ ở mức độ phân tử Nhưng cơ chế tác động của nó chưa sáng tỏ một cách hoàn toàn Khi thiếu cytokinin thì tế bào không phân chia được mặc dù ADN có thể tiếp tục được tổng hợp nhưng quá trình tổng hợp protein không xảy ra Vì vậy, cytokinin kiểm tra sự tổng hợp protein ở giai đoạn từ dịch mã (mARN)

Hiệu quả của cytokinin trong việc ngăn chặn sự hóa già có liên quan nhiều đến khả năng ngăn chặn sự phân hủy protein, acid nucleic và clorophin hơn là khả năng kích thích tổng hợp chúng Có lẽ cytokinin ngăn chặn sự tổng hợp mARN

điều khiển sự tổng hợp nên các enzyme thủy phân

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho

nuôi cấy in vitro

Các nhóm chất khác

Ngoài các chất điều hòa sinh trưởng kể trên, trong nuôi cấy in vitro còn

sử dụng một số nhóm chất khác như acid abscicis, ethylen, các amino acid,…

Acid abscicis được sử dụng ở nồng độ cao là chất ức chế sinh trưởng và trạng thái nghĩ bắt buộc Ethylen được sinh ra trong quá trình nuôi cấy thực vật Ethylen có thể kìm hãm sự sinh trưởng tế bào và đẩy nhanh sự lão hóa trong quá

trình nuôi cấy mô Bạc nitrat có thể được sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành

trong qua trình nuôi cấy mô

Amino acid có thể nâng cao sự tăng trưởng của tế bào và sự tái sinh cây

L Glutamine có thể được xem là nguồn nitơ enzyme hydrolyzed protein N-Z amin type A như casein hydrolyzate có thể được sử dụng hiệu quả đến 2 g/l Thêm vào đó citrate, pyruvate, malate và acid vô cơ tương tự có thể có hiệu quả trong môi trường nuôi cấy protoplast và có thể làm giảm bớt độc hại của muối amonium

Ngoài ra các chất điều tiết của cây như coconut milk của cây quả hạch xanh có thể có hiệu quả trong việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô cơ không xác định và các nhân tố sinh trưởng

2.3 Các nghiên cứu trước đây về nuôi cấy mô cây hoa Cúc

Arunyanart (1981) nuôi cấy chồi bên, đoạn thân và mảnh lá trên môi trường lỏng và đặc với 0,02 mg/l NAA + 2 mg/l Kinetin Chồi bên tạo ra chồi đơn

và mô sẹo xanh trên môi trường agar Khi mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường

MS đặc với 2 mg/l NAA + 2 mg/l Kinetin, chồi được nhân lên và cây con đem trồng mọc khỏe ngoài vườn ươm.[13, 15]

Pal và Dhar (1985) nhân nhanh giống Cúc trong môi trường tạo mô sẹo

từ lá và cuống lá (thu thập trên cây con 1 tháng tuổi) với các thành phần của MS có

bổ sung 2 mg/l NAA + 2 mg/l 2,4-D + 4 mg/l BA Điều kiện nuôi cấy ở 250C với thời gian chiếu sáng 16 giờ Cây con được tái sinh và trồng thành công ngoài đồng ruộng.[16, 17]

Mongkolsook và Chinachitt (1987) nhân chồi đỉnh Cúc trên môi trường

MS với 1 mg/l NAA + 2 mg/l BA hoặc 10 mg/l IAA và 1 mg/l BA Sự phân hóa đạt

từ 34 – 44,6 chồi trong khoảng 5 tuần Rễ được hình thành ở nồng độ 5 mg/l IAA Trong điều kiện tự nhiên, trên môi trường tro trấu và cát tỷ lệ 1:1, cây sẽ có tỷ lệ sống cao.[14, 18]

Bùi Văn Lệ và cộng sự (2005) đã khảo sát một số điều kiện nuôi cấy in vitro cây hoa Cúc Chrysanthemum sp Thí nghiệm được tiến hành trên 3 loại Cúc

cắt cành thương phẩm phổ biến trên thị trường Thành phố Hồ Chí Minh và các vùng lân cận có tên thông thường là Cúc xanh, Cúc mai vàng và Cúc đại đóa trắng Sau khi loại bỏ phần đế, cánh hoa (hay hoa hình môi) được cắt thành những đoạn có

độ dài 3 mm và cấy lên môi trường Đoạn tràng cánh có vị trí ngay trên đoạn đã loại

bỏ là đoạn cho mô sẹo tốt nhất ở cả 3 loại hoa Sẹo được hình thành sau 1 tuần và tạo chồi sau 14 – 16 ngày Môi trường cho nhiều chồi nhất đối với Cúc xanh, Cúc mai vàng và Cúc đại đóa trắng lần lượt là MS có bổ sung 1 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA, MS có bổ sung 1 mg/l BA và 0,4 mg/l NAA, MS có bổ sung 2 mg/l Kin và 0,4 mg/l NAA Các chồi vươn thân tốt khi được chuyển sang môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BA Cắt đốt và cấy trên môi trường MS, đốt sẽ cho rễ sau 3 ngày nuôi cấy

Ngoài ra, còn thấy sự ra hoa in vitro của các đoạn tràng được cấy trên môi trường

bổ sung BA và NAA với tỷ lệ NAA rất thấp so với BA (1%) hay trên môi trường có lượng sắt thấp chỉ bằng 1/10 lượng sắt của môi trường MS cơ bản, bổ sung thêm

BA và NAA.[6, 12]

Lâm Ngọc Phương và Phạm Lê Tuấn (2006) đã đánh giá hiệu quả của

IAA và BA đến sự tái sinh trực tiếp chồi từ lá của cây hoa Cúc (Chrysanthemum

sp.) Các mẫu lá nguyên và phân nửa lá của hoa Cúc được dùng để tạo chồi bất định trực tiếp trên môi trường nuôi cấy MS đặc với sự kết hợp 0,5 – 2 mg/l BA và 1 – 4 mg/l IAA trong quang chu kỳ 16 giờ Kết quả thí nghiệm cho thấy số chồi cao nhất trên môi trường có bổ sung 1 mg/l BA kết hợp 2 mg/l IAA với số chồi trên mẫu cao

(9,5 chồi) sau 4 tuần nuôi cấy Các chồi cao 35 – 50 mm được tạo rễ in vitro và thuần hóa ex vitro thành công.[9]

Bùi Ngọc Huy và cộng sự (2006) môi trường tối ưu vi thủy canh cây hoa Cúc là môi trường MS 10% và cây hoa Cúc con có rễ hoàn chỉnh được tạo từ chồi bất định sau 12 ngày trong hệ thống vi thủy canh Cây hoa Cúc con sau 1 tuần được trồng bằng kỹ thuật thủy canh trong môi trường MS 5% trong điều kiện nhà lưới khi đưa ra trồng có thể chịu được điều kiện khí hậu khắc nghiệt ở Miền trung.[9]

Văn Hoàng Long và cộng sự (2006) dùng các ống polypropylen trong suốt (nylon film) được thiết kế như là một giá thể mới dùng trong ra rễ đoạn cắt cây

hoa Cúc Chrysanthemum sp trong môi trường lỏng với hệ thống vi thủy canh in vitro và ex vitro Hệ thống này được sử dụng để kiểm tra hiệu quả ra rễ của các đoạn cắt cây hoa Cúc Mỗi lọ thủy tinh (250 ml) chứa 10 ống nylon (hệ thống in vitro) và mỗi hộp nhựa (500ml) chứa 25 ống nylon (hệ thống ex vitro), hệ thống ra

rễ truyền thông trên môi trường agar được sử dụng làm đối chứng Tất cả các đoạn cắt tăng trưởng và phát triển tốt trong hai hệ thống đầu chứa giá thể ống nylon

Trong hệ thống vi thủy canh in vitro, các đoạn cắt ra rễ tốt trên môi trường lỏng

chứa sucrose nồng độ 15 g/l với giá thể nylon với (10,6 rễ mỗi đoạn cắt; dài 2,35 cm) so với đối chứng trên môi trường rắn (6,7 rễ, mỗi đoạn cắt dài 1,22 cm) khi được tiền xử lý với IBA ở nồng độ 500 ppm trong thời gian 20 phút, so với đối chứng không có tiền xử lý với auxin (7,9 rễ, mỗi đoạn cắt dài 2,06 cm) Gía thể mới

có khả năng tái sử dụng này cho thấy khả năng ổn định và hiệu quả cao là một trong những giá thể lý tưởng cho ra rễ cây hoa Cúc trong thương mại.[9]

Nguyễn Xuân Tùng và Nguyễn Văn Kết (2006, 2007) đã đánh giá hiệu

quả của phương pháp loại bỏ virus TMV qua nuôi cấy in vitro trên cây hoa Cúc tại

Đà Lạt bằng test Elisa Thí nghiệm tiến hành khảo sát bệnh virus gây bệnh khảm thuốc lá trên 5 giống Cúc (Cúc nút, Cúc đại đóa, Cúc thọ vàng, Cúc mai vàng, Cúc pha lê) được trồng tại Đà Lạt Các giống Cúc trồng ở quy mô hộ gia đình có dấu hiệu dương tính với virus ở một số giống như Cúc nút, Cúc đại đóa, Cúc pha lê Do trồng ở hộ gia đình nên khả năng lây nhiễm là rất lớn sang những giống chưa bị nhiễm bệnh Cúc pha lê bắt đầu có dấu hiệu nghi nhiễm Đối với một số các giống Cúc khi đã qua phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phối hợp với hóa chất Virazol (75 ppm), kết quả test các giống Cúc này cho kết quả khả quan, không có trường hợp nào test có dấu hiệu nhiễm virus rõ ràng.[9]

Phan Tường Lộc và cộng sự (2007) nghiên cứu chuyển gen gfp đã được

thực hiện trên giống Cúc đại đóa vàng Đồng Tháp (Chrysanthemum morifolium L.)

nhằm tạo cây Cúc chuyển gen với hy vọng hoa có khả năng phát sáng có điều kiện (qua chiếu tia UV sóng dài) Các mảnh lá (0,6x0,6 cm) được nuôi chung với vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pCAMBIA 1303 mang

gen mgfp5, gen hph kháng hygromycin và gen gusA Sau 2 ngày nuôi chung và được rửa sạch vi khuẩn bằng dung dịch cefotaxime 500 mg/l, các mảnh lá được cấy chuyền sang môi trường chọn lọc MS (0,5 mg/l NAA + 1 mg/l BA) có 10 mg/l hygromycin Phân tích PCR cho kết quả dương tính các băng DNA mong đợi 500

bp, 800 bp và 365 bp ứng với các gen gfp, hph và gen gusA nhưng chúng biểu hiện kết quả âm tính qua thử nghiệm hóa mô tế bào GUS.[8]

Hình 2.3 Một số giống hoa Cúc thuộc chi Chrysanthemum sp [22, 27]

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

3.1.1 Địa điểm

Phòng Công Nghệ Sinh Học – Khoa Khoa Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Tôn Đức Thắng Tp Hồ Chí Minh

3.1.2 Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2009 đến tháng 12/2009

3.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh

chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro

Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi

cây hoa Cúc in vitro trong môi trường agar và môi trường lỏng

Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo rễ ở cây

hoa Cúc in vitro

3.3 Vật liệu thí nghiệm

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây hoa Cúc in vitro do Viện Sinh học Nhiệt Đới

cung cấp Đây là giống hoa mới được nhập nội, có màu sắc đẹp, rực rỡ và đang được thị trường rất ưa chuộng

3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm

Máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy lạnh, tủ lạnh, máy cất nước, kẹp cấy, dao cấy, chai lọ, ống nghiệm, đĩa petri, máy lắc…

3.3.3 Môi trường nuôi cấy [3]

Môi trường nuôi cấy mô là môi trường MS của Murashige – Skoog,

1962

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige – Skoog, 1962)

KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370

H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.7H2O 8,6

Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025

FeSO4.7H2O 27,8

Acid nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine HCl 0,1

GA3

Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1atm trong 20 phút

pH môi trường trước hấp khử trùng đạt 5,6 – 5,8

3.3.4 Điều kiện nuôi cấy

Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày

Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 23± 20C

Cường độ chiếu sáng: 3000 lux

3.4 Phương pháp thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, các nghiệm thức được lặp lại 3 lần Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro

œ Mục đích: Xác định được nồng độ NAA, 2,4-D và BA thích hợp cho

sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro

œ Phương pháp thực hiện: Các chồi Cúc in vitro có độ tuổi 3 tuần sau

khi cấy, chọn những lá mở xòe, cắt bỏ cuống, kích thước lá 0,6x0,6 cm Đặt mẫu lá tiếp xúc với môi trường Môi trường nuôi cấy là môi trường MS cơ bản, đường 30 g/l và các chất điều hòa sinh trưởng như bảng 3.2

œ Phương pháp tiến hành thí nghiệm:

Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro

Nghiệm thức Nồng độ NAA Nồng độ 2,4-D Nồng độ BA

(mg/l) (mg/l) (mg/l)

T0 (ĐC) 0,0 0,0 0,0 T1 0,5 0,5 1,0 T2 1,0 1,0 2,0

T3 1,0 1,0 3,0 T4 2,0 2,0 3,0 T5 2,0 2,0 4,0 T6 3,0 3,0 5,0