Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp CHITOSAN từ phế liệu chế biến thủy sản

Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp CHITOSAN từ phế liệu chế biến thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TỔNG HỢP CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Mã số: Đ2013-02-53

Chủ nhiệm đề tài: TS Bùi Xuân Đông

Đà Nẵng, 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TỔNG HỢP CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Mã số: Đ2013-02-53

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu) (ký, họ và tên)

Đà Nẵng, 12/2013

NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

KS Nguyễn Xuân Hoàng

Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng

Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng

Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Tên đơn vị

Công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền

trung: Công ty chế biến và xuất khẩu

thủy sản Thọ Quang

Nguyễn Anh Tuấn

MỤC LỤC

MỤC LỤC 4

DANH MỤC BẢNG BIỂU 6

DANH MỤC HÌNH VẼ 7

CÁC CHỮ VIẾT TẮT 9

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 10

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 12

MỞ ĐẦU 14

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15

1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin/chitosan 15

1.1.1 Giới thiệu về chitin 15

1.1.2 Giới thiệu về chitosan 16

1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của chitin/chitosan 17

1.1.4 Các phương pháp thu nhận chitin 19

1.1.5 Thu nhận chitosan 25

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacsillus subtilis và enzyme protease 30

1.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis 30

1.2.2 Giới thiệu về enzyme protease 32

1.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis của các tác giả trong nước 37

1.3 Các lĩnh vực ứng dụng của chitin/chitosan 37

1.3.1 Trong y học 38

1.3.2 Trong xử lý nước thải và làm trong nước sinh hoạt 39

1.3.3 Trong nông nghiệp 39

1.3.4 Trong mỹ phẩm 40

1.3.5 Trong thực phẩm 40

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 42

2.1.1 Nguyên liệu: 42

2.1.2 Hoá chất và thiết bị: 43

2.2 Phương pháp nghiên cứu 43

2.2.1 Định lượng nước 43

2.2.2 Định lượng muối Calci carbonat 43

2.2.3 Định lượng chitin 44

2.2.4 Phương pháp xác định độ deacetyl của chitosan 44

2.2.5 Một số phương pháp xác định khác: 44

2.3 Sơ đồ các mô hình thí nghiệm (hình 2.2) 44

2.4 Xử lý số liệu 46

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Kết quả nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của vỏ tôm, nguyên liệu nội tạng cá và phương pháp bảo quản nguyên liệu nội tạng cá 47

3.1.1 Thành phần hóa học của một số nguyên liệu chứa chitin, phổ biến ở thành phố Đà Nẵng 47

3.1.2 Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá 48

3.1.3 Kết quả nghiên cứu bảo quản nguyên liệu nội tạng cá phục vụ thu hồi chế phẩm enzyme protease 48

3.2 Chọn phương pháp thu hồi chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá, khảo sát hoạt độ của chế phẩm enzyme protease thu được 49

3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản lên hoạt tính của chế phẩm enzyme

protease tách chiết từ nội tạng cá 52

3.4 Các kết quả nghiên cứu sản xuất chitin/chitosan ứng dụng enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá 54

3.4.1 Kết quả nghiên cứu phương pháp xử lý nguyên liệu vỏ tôm trước khi loại bỏ protein: 55

3.4.2 Kết quả nghiên cứu phản ứng thủy phân protein trong nguyên liệu vỏ tôm 56

3.4.3 Kết quả đánh giá chất lượng chitin được thu nhận bằng phương pháp ứng dụng enzyme protease từ nội tạng cá 59

3.4.4 Đánh giá chất lượng chitosan sản xuất từ chitin ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá 60

3.4.5 Kết quả nghiên cứu xử lý các loại phế thải sinh ra trong quá trình xử lý nguyên liệu thành chitin/chitosan 61

3.5 Kết quả nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn B subtilis để loại bỏ protein trong nguyên liệu vỏ tôm 61

3.5.1 Kết quả nghiên cứu nhằm chuẩn bị giống vi khuẩn Bacillus subtilis 61

3.5.2 Kết quả ứng dụng Bacillus Subtilis để loại bỏ protein trong vỏ tôm 65

3.6 So sánh chất lượng chitosan sản xuất theo các phương pháp hóa học và ứng dụng công nghệ sinh học 70

3.7 Đề xuất sơ đồ công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng công nghệ sinh học 71

3.6.1 Dây chuyền công nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá (hình 3.18) 71

3.6.2 Dây chuyền công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng vi khuẩn B.subtilis (hình 3.19) 72

KẾT LUẬN 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 78

Phụ lục 1: Phương pháp pha loãng thập phân 78

Phụ lục 2: Môi trường hoạt hoá giống (pH=6,5) 78

Phụ lục 3: Môi trường kiểm tra hoạt lực enzyme 78

Phụ lục 4: Thành phần thuốc nhuộm Amido-Black 78

Phụ lục 5: Môi trường nhân giống cấp 1 78

Phụ lục 6: Môi trường nhân giống cấp 2 79

Phụ lục 7: Phương pháp chuẩn độ phooc-môn 79

Phụ lục 8: Phương pháp chuẩn độ Kjeldahl 80

Phụ lục 9: Môi trường kiểm tra hoạt lực enzyme 81

Phụ lục 10: Thu nhận chitin/chitosan bằng phương pháp hóa học (mẫu đối chứng) 81

Phụ lục 11: Thu nhận chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá 82

Phụ lục 12: Nghiên cứu quá trình thủy phân protein trong vỏ đầu tôm bằng chế phẩm enzyme protease, thu nhận từ nội tạng cá 82

Phụ lục 13: Nghiên cứu quá trình thủy phân protein trong vỏ đầu tôm bằng vi sinh vật Bacillus subtillis 83

Phụ lục 14: Các bước tiến hành nghiên cứu phương pháp tách chiết chitin sử dụng vi khuẩn B Subtilis 83

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm 47Bảng 3.2 - Thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá 48Bảng 3.3 - Một số tính chất của chế phẩm protease thu nhận từ nguyên liệu tươi và nguyên liệu đông lạnh 51Bảng 3.4 – Một số chỉ tiêu chất lượng của chitin sản xuất bằng phương pháp ứng dụng

enzyme protease từ nội tạng cá 60Bảng 3.5 – Một số đặc điểm chất lượng chitosan thu nhận từ chitin tách chiết từ vỏ tôm ứng dụng enzyme protease từ nội tạng cá 60Bảng 3.6 – Một số đặc điểm của phế thải rắn và lỏng 61Bảng 3.7 - Mật độ khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường hoạt hoá với các độ pha loãng khác nhau 62Bảng 3.8 - Đường kính vòng thuỷ phân của các khuẩn lạc 63Bảng 3.9 - Sự giảm khối lượng vỏ tôm qua từng công đoạn 70Bảng 3.10 – Một số chỉ tiêu chất lượng của chitin sản xuất bằng phương pháp ứng dụng vi

khuẩn B subtilis 70

Bảng 3.11 – So sánh một số đặc điểm chất lượng của chitosan sản xuất theo phương pháp hóa học và ứng dụng công nghệ sinh học 71

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của chitin 16

Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của chitosan 17

Hình 1.3 – Sơ đồ tổng quát thu nhận chitin bằng phương pháp hóa học 19

Hình 1.4 - Các phương án thu nhận chitin 20

từ các nguồn nguyên liệu khác nhau 20

Hình 1.5 – Kriel 21

Hình 1.6 – Phản ứng tóm tắt quá trình điều chế chitosan 26

Hình 1.7 - Máy sấy, tạo hạt loại FL 30

Hình 1.8 - Thiết bị nghiền tới kích thước siêu nhỏ Cage-Paktor ® 30

Hình 1.9 - Vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nhuộm gram 31

Hình 1.10 - Hình ảnh đĩa khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus subtilis 31

Hình 2.1 – Sự khác nhau của một số nguyên liệu tôm, vỏ của chúng dùng để thu nhận chitin/chitosan 42

Hình 2.2 – Sơ đồ mô hình các bước thực hiện trong nghiên cứu 46

Hình 3.1 - Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên chỉ tiêu chất lượng nội tạng cá bảo quản ở nhiệt độ -18 ÷ -200 C 49

Hình 3.2 - Biểu đồ sự phụ thuộc hoạt độ các nhóm enzyme protease 50

trong các vùng pH khác nhau 50

Hình 3.3 - Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme protease 51

từ nội tạng cá 51

Hình 3.4 - Chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá đông lạnh 52

Hình 3.5 – Sự phụ thuộc của hoạt độ của chế phẩm enzyme protease 53

vào nhiệt độ môi trường 53

Hình 3.6 - Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên hoạt độ enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá 53

Hình 3.7 - Ảnh hưởng của thời gian lên độ khử khoáng và hàm lượng chất khoáng còn lại trong vỏ tôm 56

Hình 3.8 – Sự phụ thuộc độ khử protein trong nguyên liệu vỏ tôm vào thời gian thủy phân 57 Hình 3.9 – Sự phụ thuộc của độ khử protein vào nồng độ chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá 58

Hình 3.10 - Ảnh hưởng của nhiệt độ lên phản ứng enzyme thủy phân protein trong nguyên liệu 59

Hình 3.11 - Đĩa khuẩn lạc sau khi nhuộm bởi thuốc nhuộm Amido-Black 62

Sau khi nhuộm chúng tôi quan sát thấy chung quanh các khuẩn lạc xuất hiện các vòng thuỷ phân màu sáng, những vùng môi trường còn lại có màu xanh đậm của thuốc nhuộm như hình 3.11 63

Hình 3.12 - Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis soi dưới kính hiển vi 64

Hình 3.13 - Vòng thuỷ phân của vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nhân giống cấp 1 64

Hình 3.14 - Vòng thuỷ phân của vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nhân giống cấp 2 64

Hình 3.15 – Sự thay đổi hàm lượng đạm hòa tan trong môi trường chứa vi khuẩn B Subtilis và vỏ tôm ở nhiệt độ 480C 66

Hình 3.16 - Hàm lượng đạm hòa tan thu được khi thủy phân protein trong vỏ tôm với các tỉ lệ bổ sung giống khác nhau ở 480 C 67

Hình 3.17 – Sự phụ thuộc của quá trình thủy phân protein trong vỏ tôm vào nhiệt độ 68

Hình 3.18 – Sơ đồ công nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá 72

Hình 3.19 – Sơ đồ công nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng vi khuẩn B subtilis 73

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chitin : poly (1,4) - 2 acetamido - 2 deoxy -  - D glucose

Chitosan : poly (1,4) -2-amino-2-deoxy-β-D-glucan

KK : Quá trình khử khoáng

KP : Quá trình khử protein

EDTA : Etilendiamin tetraaxetic axit

G20X : Enzyme proteinase protosubtilina

Vỏ tôm : Đầu tôm + vỏ tôm

VSV : Vi sinh vật

QMAFAM : Quantity of Mesophilic Aerobic and Facultative Anaerobic

Microorganisms

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp chitosan từ phế liệu chế

biến thủy sản

- Mã số: Đ 2013-02-53

- Chủ nhiệm: TS Bùi Xuân Đông

- Thành viên tham gia: KS Phạm Thị Kim Thảo, KS Nguyễn Xuân Hoàng, KS Trương Văn Thiên

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng

- Thời gian thực hiện: từ 10/04 – 30/12/2013

2 Mục tiêu:

Ứng dụng phương pháp sinh học để sản xuất chitin/chitosan nhằm hạn chế sử dụng hóa chất, gây ô nhiễm môi trường

3 Tính mới và sáng tạo:

Sử dụng khả năng xúc tác phản ứng của enzyme protease trong nội tạng cá và

enzyme protease của vi khuẩn B subtilis để loại bỏ protein ra khỏi chitin trong vỏ tôm

4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu:

Trên cơ sở nghiên cứu quá trình khử protein trong vỏ tôm bằng biện pháp ứng dụng công nghệ sinh học và thực nghiệm sản xuất chitin/chitosan ở quy mô pilot theo công nghệ mới được nghiên cứu đã thu được các kết quả như sau:

- Sản phẩm chitin sản xuất ứng dụng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá có chất lượng tốt với hàm lượng protein nhỏ hơn 0,5%, và chỉ tiêu vi sinh vật đạt chuẩn an toàn (SanPin 2.3.2.1078-01 – LB Nga); chitosan sản xuất từ loại chitin này có độ deacetyl là 79-89% và độ nhớt cao đến 18 dl/g phù hợp với các báo cáo khoa học trong nước và quốc tế

- Sản phẩm chitin sản xuất ứng dụng vi khuẩn B subtilis có chỉ tiêu cảm quan

thấp, và vi sinh vật tổng số tương đối cao ở mức 3,3x105

nhưng vẫn nằm trong giới

hạn an toàn (SanPin 2.3.2.1078-01 – LB Nga); chitosan sản xuất từ loại chitin này có

độ nhớt là 18,1 dl/g – có chất lượng bảo đảm so với báo cáo trong nước và quốc tế

5 Tên sản phẩm:

- 2 sơ đồ dây chuyền công nghệ sản xuất chitin/chitosan

- các sản phẩm chitin, chitosan và chất màu carotenoid

6 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

- Hiệu quả về công tác giảng dậy:

Hướng dẫn thành công hai sinh viên làm đồ án tốt nghiệp nghiên cứu năm học 2012-2013 là: Trương Quang Thơm (08SH) và Võ Thị Ngọc Thùy (11SHLT)

- Chuyển giao kết quả nghiên cứu:

Dây chuyền công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng công nghệ sinh học được đăng tải trên chợ trực tuyến: Chợ công nghệ và thiết bị Việt nam http://www.techmartvietnam.vn

Ngày tháng năm

Cơ quan Chủ trì

DANANG UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

Project Leader: Doctor Bui Xuan Dong

Coordinator: Pham Kim Thao, Nguyen Xuan Hoang, Truong Van Thien

Implementing institution: Danang University of Technology – University of Danang

Duration: from April 10, 2013 to December 30, 2013

2 Objective(s): Produce chitin/ chitosan by bio-technique to eliminate the using of

chemicals to prevent environmental pollution

3 Creativeness and innovativeness: Applying the catalization of protease in internal

fish organs and protease from Bacillus subtilis to discard protein from chitin in shrimp

Chitin product prepared by Bacillus subtillis fermentation had low perceptible

showing and the total microorganism in the sample was quite high, at 3.3x10-5 but still

under the Safety Standard (SanPin 2.3.2.1078-01 – Russia) The viscosity of Chitosan produced from these chitin products was 18.1dl/g The product quality can be compared to products reported from inside and outside of Vietnam

5 Products:

- Two production lines of Chitin and Chitosan;

- Chitin, chitosan and carotenoid pigment products

6 Effects, transfer alternatives of research results and applicability:

- Teaching: Conducting two students to do their final research thesis, including Truong Quang Thom (08SH) and Vo Thi Ngoc Thuy (11SHLT)

- Hand over the research results: Production lines to produce chitin/ chitsan by bio-technique were placed in the online market: The Technology and Equipment Market of Vietnam (http://www.techmartvietnam.vn)

Date:……… IMPLEMENTING INSTITUTION PROJECT LEADER

MỞ ĐẦU

Trong nguyên liệu vỏ tôm, chitin liên kết rất chặt chẽ với protein, lipid và các chất khoáng (pha rắn) Việc thu nhận chitin từ nguồn nguyên liệu này xây dựng trên căn bản là đưa protein và các chất khoáng về trạng thái lỏng (pha lỏng), và từ đó loại bỏ chúng ra khỏi chitin Để sản xuất chitin đạt các tiêu chuẩn chất lượng quốc tế cần loại

bỏ hoàn toàn protein và khoáng chất, cũng như lipid

Hiện nay phương pháp hóa học được dùng phổ biến để thu nhận chitin bằng cách

sử dụng các hóa chất đậm đặc, tức là xử lý nguyên liệu trong những điều kiện “khắc nghiệt” (môi trường axit mạnh, bazơ mạnh, nhiệt độ cao và thời gian kéo dài), thường dẫn tới làm giảm chất lượng chitin thương phẩm Các hư hỏng của sản phẩm chitin thường gặp khi thu nhận theo phương pháp hóa học là: biến dạng cấu trúc phân tử, giảm độ nhớt của dung dịch chitin và chitosan Bên cạnh đó việc bảo quản và sử dụng các hóa chất có độ đậm đặc cao mà đòi hỏi sự tiếp xúc trực tiếp của công nhân gây nhiều quan ngại trong vấn đề bảo đảm an toàn và sức khỏe cho người lao động Theo phương pháp hóa học có thể thu nhận được sản phẩm phân giải protein là hỗn hợp các axit amin tự do hòa lẫn cùng các chất độc hại, các chất độc hại sinh ra do protein bị thủy phân sâu dẫn đến phân giải cả các axit amin nên việc sử dụng sản phẩm dịch thủy phân gặp phải nhiều hạn chế, ví dụ không sử dụng được trong thực phẩm hay trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Các hướng sử dụng chitin và dẫn xuất từ chitin trong thực tế trong những năm gần đây không ngừng được mở rộng dẫn tới cần tìm kiếm và thử nghiệm các phương pháp mới để thu nhận các polymer sinh học này Một vấn đề có tính thời sự còn tồn tại là nghiên cứu phương pháp xử lý nguyên liệu vỏ tôm tạo điều kiện thu hồi chitin và toàn

bộ các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có trong nó, bên cạnh việc hướng tới phát triển bền vững trên cơ sở giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Mục tiêu của nghiên cứu này là ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản nhằm thu được các sản phẩm chính như: chitin, chitosan và các sản phẩm phụ như chất màu carotenoid và chế phẩm enzyme protease

từ nội tạng cá

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin/chitosan

Vỏ tôm, ghẹ, cua, mai mực và nhiều loại vỏ giáp xác khác chiếm 15 tới 35% tổng khối lượng khai thác, là nguồn nguyên liệu quý để điều chế các hợp chất polymer tự nhiên – như aminopolysaccharide (chitin và chitosan), và những dẫn xuất của chúng là các oligosaccharite và glucosamine, những sản phẩm ngày nay đã trở nên thiết yếu trong các lĩnh vực khác nhau Ví dụ:

+ sử dụng làm các chất phụ gia thực phẩm, hay thành phần của thực phẩm chức năng

+ sử dụng làm các chế phẩm y dược (để giảm cân, điều hòa áp huyết, giảm colesteron; các chế phẩm chống ung thư và các loại thuốc kháng thể)

1.1.1 Giới thiệu về chitin

Chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cùng với xellulo là những hợp chất hữu

cơ phổ biến nhất trên bề mặt trái đất Nó là nguồn tài nguyên dồi dào, ước tính vào khoảng 100 nghìn tỷ tấn/năm Nhưng khác với xellulo, chitin còn là nguồn sinh khối

tự nhiên ít được khai thác

Chitin lần đầu tiên được Giáo sư khoa học tự nhiên, giám đốc vườn thực vật thuộc Viện hàn lâm khoa học của TP Nensi (Pháp) – Henri Braconnot phát hiện năm 1811 khi nghiên cứu thành phần của nấm và ông đặt tên là “fungin” Năm 1823 A.Odier điều chế chitin từ cánh bọ cánh cứng và đặt tên là “chitin” (Tiếng Hy-lạp citwu- nghĩa

là áo) Còn chitosan lần đầu tiên phát hiện năm 1859 bởi nhà khoa học C Rouget, cũng từ thời điểm này giới khoa học bắt đầu nghiên cứu thực nghiệm và sử dụng những polymer này

Những công trình đầu tiên ở Nga, liên quan tới việc điều chế chitin được thực hiện dưới sự chỉ đạo của Viện sĩ P Sorugin những năm 1934-1935 Các thử nghiệm

sử dụng chitosan được F Cadov thực hiện năm 1941

Hiện nay nhằm mục đích phát triển các nghiên cứu về chitin/chitosan ở Nga có Hiệp hội liên bang về chitin (The Russian chitin society: www.chitin.ru), được thành lập từ năm 2000

Chitin là một poly (1,4) - 2 acetamido - 2 deoxy -  - D glucose Công thức cấu tạo của chitin được trình bày trên hình 1.1

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của chitin

Liên kết  (1,4) glucoside của mỗi mắt xích cấu tạo nằm lệch nhau một góc 1800tạo nên mạch xoắn Liên kết này kém bền, dễ bị cắt đứt bởi tác nhân ion H+ của axit

Sự có mặt của nhóm amino trong chitin làm cho chúng có những đặc tính sinh học chuyên biệt và có thể tham gia các phản ứng đặc trưng Chitin là polymer có những tính chất xác định, bao hàm cả khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật và có hoạt tính sinh học Nên chitin còn được quan tâm nghiên cứu như một loại vật liệu chức năng đặc biệt mới

Điều khác biệt của chitin so với các polysaccharide khác là phân tử chitin tích điện dương mạnh, nó giúp cho chitin tạo ra liên kết với các phân tử mang điện tích âm trên bề mặt

Trong mỗi nguyên liệu khác nhau thì chitin có sự khác biệt về thành phần cấu tạo

và hàm lượng chitin khác nhau [12, 21, 25]

1.1.2 Giới thiệu về chitosan

Chitin có thể chuyển hóa thành nhiều dẫn xuất khác nhau, hay hặp nhất là

chitosan Chitosan là poly (1,4) -2-amino-2-deoxy-β-D-glucan Nó được tạo thành khi N-deacetyl của phân tử chitin, có công thức cấu tạo như trên hình 1.2

Chitosan có một số ưu việt so với chitin, có thể kể đến như là tính tan trong nước

và trong dung dịch acid Khối lượng phân tử chitosan phụ thuộc vào điều kiện xử lý chitin hay vỏ tôm, thông thường từ 10 đến 1000 kDal Đơn vị phần trăm độ deacety được xác định bằng mức độ deacetyl (đây là tỉ lệ của khối lượng glucosamine so với

số monomer chung trong phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thường từ 70-90%

Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của chitosan

1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của chitin/chitosan

Do đặc trưng về cấu tạo nên chitin và chitosan có tính chất đặc trưng của nhóm amino (-NH) và nhóm hydroxyl (-OH) Chúng có khả năng liên kết với nhiều kim loại nặng tạo nên hợp chất gọi là chelate Chitin có đặc tính hoạt hóa thấp do trong phân tử chitin chỉ có hai nhóm hydroxyl trên mỗi mắt xích (monomer) có thể tham gia vào phản ứng hóa học Chitosan nhờ có nhóm amino tự do nên có năng lượng tự do lớn, tạo điều kiện cho chitosan có thể hòa tan trong các dung dịch của các acid hữu cơ và một số acid vô cơ

Ngoài ra, các polymer này còn có thể bị thủy phân do chứa các liên kết glucoside

và liên kết peptide Có thể dễ dàng tạo ra các nhóm ưa nước bằng cách biến tính chitin/chitosan, nên mở ra khả năng mô hình hóa tính chất của chúng

Chitin có 3 trạng thái tinh thể là: α, β và γ – chitin Phổ biến nhất và bền vững nhất là α-chitin, trong phân tử có các liên kết đối song song, chính nhờ các liên kết hydro Phân tử β và γ – chitin kém bền vững hơn và ít gặp hơn

Chitosan cũng có thể tồn tại ở dạng tinh thể, sự tạo ra polymer chitosan phụ thuộc vào trạng thái vật lí của nó

Chitin/chitosan bền vững dưới tác dụng của kiềm, nhưng có thể bị thủy phân dưới tác dụng của các acid Khi bị thủy phân hoàn toàn bởi dung dịch acid HCl hoặc acid sunfuric ở nhiệt độ cao chitin và chitosan bị thủy phân đến monosaccharide-D-glucosamine Ở điều kiện mềm hơn có thể tạo thành hỗn hợp các oligosaccharide Dung dịch HCl thường được dùng để thủy phân từng phần, sản phẩm tạo ra trực tiếp

là glucosamine từ các đoạn oligosaccharide với khả năng polymer hóa 2-4 Xử lý bằng siêu âm có thể làm phân hủy chitin và chitosan

Sự thủy phân liên kết glucoside của phân tử chitin/chitosan dưới tác dụng của các yếu tố khác nhau (oxy hóa, xử lý nhiệt) làm đứt mạch polymer của chúng, làm giảm khối lượng phân tử, tăng khả năng hòa tan, tính chất này thường được ứng dụng để điều chế dung dịch, và sau đó dùng vào các mục đíc khác nhau

Sự thủy phân liên kết amid (peptit) của chitin tạo ra chitosan Về nguyên tắc không có danh giới rõ ràng giữa chitin và chitosan Ở trạng thái tự nhiên chitin luôn có một số nhóm amino tự do (5-15%) Thông thường chitosan được cho là sản phẩm, có thể hòa tan trong các dung dịch acid hữa cơ loãng (như acid acetic), tương ứng với độ deacetyl không dưới 55-60%.Sự thủy phân của các liên kết peptide trong dung dịch acid và bazơ hoặc dưới tác dụng của các enzyme (chitosanase) Một phương pháp deacetyl với hiệu xuất cao thường thủy phân bằng bazơ mạnh Quá trình deacetyl làm biến đổi cấu trúc polymer, dẫn đến làm giảm khối lượng phân tử polymer

Trong tự nhiên chitin/chitosan bị phân giải bởi nhiều sinh vật khác nhau, chúng có khả năng sinh enzyme chitinase và chitosanase

Phần lớn enzyme chitinase trong vi sinh vật thủy phân liên kết glucosamin theo cơ chế khác nhau Chitinase trong thực vật bậc bao không có chitin như thành phần cấu tạo Enzyme chitosanase thủy phân chitosan bằng cơ chế cắt endo Như vậy chitosan có thể bị phân giải dưới tác động của nhiều chế phẩm enzyme khác nhau như glycanase, lipase và protease từ những nguồn khác nhau Enzyme cellulose

N-acetyl-β-(1,4)-T viride phân giải chitosan đến chitooligosacharide Enzyme papain xúc tác thủy phân chitosan và làm giảm độ nhớt của chitosan

Xử lý chitin bằng các enzyme thủy phân mở ra khả năng sản xuất glucosamin bằng các enzyme chitinase Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm N-acetyl lên quá trình thủy phân với lysim chứng minh rằng, độ deacetyl tối ưu bằng 0,7, khi đó có

N-acetyl-D-thể thu được các đoạn oligosaccharide đến tetramer

Oligosaccharide có độ dài polymer từ 2-8 ứng dụng như phụ gia thực phẩm, thành phần chế phẩm y dược được điều chế bằng cách phân giải chitosan bằng enzyme

chitosanase từ vi khuẩn Bacillus № 7-M bền ở pH từ 5-11

Chitosan hòa tan cũng được điều chế bằng phương pháp enzyme như sau: xử lý chitosan với độ deacetyl 60-90% bằng enzyme chitosanase trong môi trường acid ở nhiệt độ 30-60 0C Sản phẩm thu nhận được, tách ra bằng phương pháp siêu âm, có khả năng hòa tan trong nước [21,25]

1.1.4 Các phương pháp thu nhận chitin

Chitin là polymer không tan nên không thể thu nhận trực tiếp từ vỏ tôm, cua Để thu nhận chitin cần thực hiện tuần tự việc tách protein và các chất khoáng, cấu trúc nên lớp vỏ cứng chứa chitin, nghĩa là chuyển protein và khoáng chất về trạng thái hòa tan, và loại bỏ chúng Từ những phương pháp thu nhận chitin đã biết chúng ta có thể phân chia chúng thành hai nhóm phương pháp cơ bản: nhóm 1 - phương pháp hóa học, xử lý bằng acid, kiềm…; nhóm 2 - các phương pháp công nghệ sinh học, ứng dụng các chế phẩm enzyme và các vi sinh vật phân giải protein

Hình 1.3 – Sơ đồ tổng quát thu nhận chitin bằng phương pháp hóa học a) Xử lý hóa học:

Phần lớn các phương pháp thu nhận của nhóm này xây dựng trên một hoặc hai bước làm sạch chitin khỏi protein và các hợp chất khoáng - gọi là khử protein và khử khoáng Một số phương pháp khác có thêm bước khử lipid và các chất khác [13] Thu nhận chitin từ những nguồn nguyên liệu khác nhau có sơ đồ tổng quát như hình 1.3

Phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và chất lượng chitin cần thu nhận, cũng như để thu nhận chitosan từ chitin mà số lượng các bước khử protein và khử khoáng khác nhau, trật tự có thể thay đổi theo sơ đồ như hình 1.4

Hình 1.4 - Các phương án thu nhận chitin

từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

Các phương án này thể hiện việc thu nhận chitin từ các nguồn nguyên liệu khác nhau, phụ thuộc vào yêu cầu về chất lượng sản phẩm chitin Ví dụ để xử lý vỏ tôm, bọ cánh cứng (lớp vỏ mỏng) chỉ cần công đoạn xử lý kiềm (xử lý 1 lần) Xử lý kép (2 lần

xử lý kiềm và acid) để khử hoàn toàn protein khỏi chitin Các khoáng chất còn lại xử

lý bằng acid không vượt quá 1-3% Việc lặp lại bước khử khoáng có thể thu nhận chitin không chứa tạp chất, bước này cần thực hiện với các nguyên liệu có lớp vỏ dày (như vỏ cua,…) [17]

Việc áp dụng tuần tự các bước KK và KP có một số lợi ích về chất lượng chitin Việc áp dụng tuần tự này ảnh hưởng lên chất lượng chitin thu nhận được và từ chitin thu nhận chitosan Ví dụ, khi xử lý nguyên liệu chứa chitin theo sơ đồ KK-KP độ nhớt của của chitosan thu được cao hơn rất nhiều so với sơ đồ công nghệ KP-KK

Hiệu suất các quá trình KK và KP phụ thuộc vào độ nghiền nhỏ của vỏ tôm, vỏ cua, nghĩa là tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với các chất hóa học, nhưng khi

nghiền nhỏ nguyên liệu cũng làm hiệu suất sản phẩm giảm do thất thoát trong quá trình xử lý [18]

Các thông số của công đoạn KP và KK của các nghuyên liệu khác nhau cũng khác nhau Theo phương pháp Hackman [12] vỏ crab được xử lý bằng dung dịch HCl 2N trong 5h ở nhiệt độ phòng, sau đó hỗn hợp được nghiền nhỏ và khử protein bằng dung dịch acid NaOH ở 1000C trong 12h Để khử hoàn toàn protein cần thực hiện các công đoạn trong 4 lần Phương pháp Whisler và BeMiller [12] thực hiện khử protein của nguyên liệu nghiền nhỏ trong dung dịch NaOH 10% trong thời gian 72 h, khử màu bằng etanol 95%, sau đó rửa bằng dung môi hữu cơ, khử protein bằng dung dịch HCl 37% trong 4h Khử khoáng theo phương pháp Horowits, Rosoman và Blumental [12] được thực hiện trước khi khử protein, nguyên liệu xử lý bằng dung dịch acid fomic 90% trong 18h ở nhiệt độ phòng, sau đó khử protein bằng dung dịch NaOH 10% trong 2,5h đun nóng Các nhà khoa học đều không nghiên cứu ảnh hưởng của trật tự các bước khử khoáng, khử protein lên chất lượng chitin/chitosan Nhưng sau này, người ta

đã phát hiện trật tự KK, KP ảnh hưởng đến chất lượng chitosan thu nhận được

Từ các phương pháp trên, có một điều rõ ràng là các công đoạn đều thực hiện ở điều kiện khắc nghiệt, nguyên liệu chứa chitin được xử lý trong dung dịch acid và dung dịch kiềm một thời gian dài và ở nhiệt độ cao để khử protein Điều này dẫn đến biến dạng cấu trúc, và một phần đã khử deacetyl (KA) của chitin

Hình 1.5 – Kriel

Tại LB Nga từ những năm 1970-1980 (ở Vladivostoc, Murmansk, VNIRO) đã ứng dụng công nghệ sản xuất chitin và chitosan từ vỏ nhuyễn thể (kriel) và vỏ tôm

(hình 1.5) Chitin được thu nhận nhờ khử protein bằng dung dịch NaOH 1N trong 30 phút ở nhiệt độ 70-800C, sau đó khử khoáng bằng dung dịch HCl 1N trong 30 phút ở nhiệt độ phòng

Để tăng hiệu suất quá trình khử protein bằng dung dịch kiềm nhẹ, các nhà khoa học đã ứng dụng các chất có hoạt tính bề mặt Phương pháp thu nhận chitin từ vỏ nhuyễn thể (kril), được đề xuất bởi A.I Gamzazade cùng cộng sự [22]: vỏ nhuyễn thể (krel) được khử protein trong dung dịch NaOH 2-5% ở nhiệt độ phòng trong 6-8h Trong công đoạn khử protein dùng phối hợp các chất hoạt động bề mặt anion (sodium dodecyl sulfate, muối natri acid aurino), làm giảm nồng độ NaOH, bên cạnh đó làm tăng hiệu suất khử màu và lipid

Phương pháp sản xuất chitin từ vỏ nhuyễn thể (kriel) ứng dụng ở Ba lan [23] xây dựng trên cơ sở xử lý sử dụng nguyên liệu đông lạnh Nguyên liệu được giá đông, nghiền nhỏ, sau đó rửa sạch và khử khoáng bằng dung dịch acid HCl 3,5% trong 1,5h

ở nhiệt độ phòng Sau đó tiến hành loại bỏ lipid và và chất màu bằng hỗn hợp giấm và etanol (acetate ester) Khử protein bằng dung dịch NaOH 3,5% ở nhiệt độ 250C trong 2h Sự phát triển công nghệ sản xuất chitin ở các quốc gia chỉ khác nhau ở việc chọn hóa chất phục vụ quá trình KK và KP [14]

Ở Ấn độ trong công nghiệp sản xuất chitin từ phế liệu chế biến tôm Matapenaeus dobsoni Khử protein được tiến hành trong dung dịch NaOH 0,5% đun nóng trong 30 phút Phần dung dịch được tách khỏi chitin và tận dụng để sản xuất protein Bước khử protein được thực hiện lần thứ hai bằng dung dịch NaOH 3% Nguyên liệu tiếp tục được khử màu bằng dung dịch hypochloride chứa 0,3-0,5% clo lỏng, sau đó rửa bằng nước và tiến hành khử khoáng bằng dung dịch HCl 1,25N ở nhiệt độ phòng trong 3h Chitin sản xuất ra được dùng đế sản xuất chitosan

Ở Mỹ người ta sử dụng công nghệ sản xuất chitin của các nhà khoa học Peniston K.P và Jonson E.L [25] Nguyên liệu chứa chitin được nghiền nhỏ ở dạng ẩm ướt tới kích thước 1,3-1,8 mm và tiến hành KP ở nhiệt độ 65-710C trong thời gian 1-2h trong dung dịch NaOH 0,05-0,2N theo cơ chế chảy ngược.Trong dung dịch NaOH trước khi dùng để khử protein cho thêm 0,1% Na2SO4, để kích họat quá trình thủy phân Sau đó tách ra phần dung dịch chứa protein để sản xuất protein, phần rắn chuyển qua công đoạn khử khoáng bằng HCl

Tất cả các phương pháp thống kê trên đây chỉ khác nhau ở trình tự thực hiện hai công đoạn KK và KP, và các thông số của công đoạn trên căn bản phương pháp hóa học

Khử khoáng (KK) là công đoạn quan trọng trong sản xuất chitin Độ khử khoáng xác định bằng độ nhớt và các thông số vật lý, hóa học khác, độ khử khoáng của chitin cũng giống như của chitosan, tức là mang cùng một ý nghĩa Để khử khoáng (khử CaCO3 và Ca3(PO4)2) từ nguyên liệu chứa chitin người ta thường dùng acid HCl, acid formic, HNO3 và acid sunfuric Hạn chế ở đây là khi xử lý chitin bằng acid có thể dẫn tới phá hủy một phần cấu trúc và độ deacetyl của chitin, giảm độ nhớt của dung dịch chitosan

Có các phương pháp khác thu nhận chitin, không giống như các phương pháp tiêu chuẩn như trên Đó là phương pháp của Foster và Hackaman [12] thực hiện ở điều kiện “mềm”, không dẫn tới làm hỏng cấu trúc và độ deacetyl của chitin Tất cả công nghệ chỉ bao gồm 1 bước xử lý nguyên liệu chứa chitin trong dung dịch etilendiamin tetraaxetic axit (EDTA) Vỏ cua được xử lý một thời gian dài – 2-3 tuần trong dung dịch EDTA khi pH = 9 Một số loại nguyên liệu mỏng như vỏ tôm, nhuyễn thể (kriel) sau khi nghiền nhỏ chỉ mất 15 phút xử lý Sau khi xử lý chitin chứa 1% tro và 5% protein

Peniston K.P và Jonson E.L [26] còn đề cử phương pháp: nghiền nhỏ nguyên liệu chứa chitin đến kích thước 3-6 mm Sau đó hỗn hợp cho vào thiết bị phản ứng cùng với NaOH 0,5-2% trong thời gian 1-4h ở nhiệt độ 50-700C để khử protein Sau

đó tiến hành theo mô hình KK và KP bằng dung dịch NaOH 30-50% ở nhiệt độ

120-1500C Khi đó xảy ra đồng thời quá trình deacetyl của chitin chuyển hóa CaCO3 về dạng Ca(OH)2 theo phương trình:

Ở nước thải sau công đoạn này chứa các thành phần như hydroxit natri, acetat natri va cacbonat natri Dung dịch NaOH có thể tái sử dụng Hiện tượng này hay gặp

là hiện tượng ăn mòn da

Điểm tồn tại chung của tất cả các phương pháp trên là xử lý nguyên liệu trong

điều kiện và môi trường “khắc nghiệt” của acid và bazơ, như vậy cần các thiết bị bền vững với khả năng chống ăn mòn, như vậy làm tăng giá thành sản xuất và sản phẩm Ngoài gia khi thiết kế nhà máy cần thiết kế các khu vực pha chế hóa chất, cũng như bảo quản chúng, gây nguy hại đến an toàn sản xuất và môi trường Protein sau khi tách khỏi acid và bazơ từ dịch thủy phân chứa nhiều muối, làm hạn chế khi sử dụng chúng

b) Tổng quan các quá trình sinh học sản xuất chitin

Ứng dụng enzyme tạo điều kiện “mềm” để xử lý nguyên liệu chứa chitin, có thể gộp nhiều công đoạn làm một nên đơn giản hóa công nghệ Đồng thời giảm thiểu tính khắc nghiệt của môi trường phản ứng lên thiết bị và tăng tuổi thọ của chúng

Phương pháp đơn giản nhất để thu nhận chitin là lợi dụng quá trình tự phân hủy dưới tác dụng của enzyme có trong nguyên liệu (quá trình tự giải) Những phương pháp này được ứng dụng để sản xuất chitin từ phụ phẩm kriel [27] và vỏ cua [28] Quá trình khử protein (KP) được tiến hành bằng cách nhào trộn nguyên con kriel với nguyên liệu chứa chitin theo tỉ lệ 1:2 ở nhiệt độ 500C Hỗn hợp thu được cần nhào trộn liên tục trong 5 giờ Độ chuyển dịch protein từ nguyên liệu vào pha lỏng đạt 68% Kết quả thu được chitin chứa 34% khoáng chất và 12% protein Như vậy phương pháp này không loại bỏ được hoàn toàn protein ra khỏi chitin, tức là quá trình KP không hoàn toàn và cần công đoạn phụ để loại bỏ protein Ngoài ra, trong hỗn hợp phản ứng chứa enzyme chitinase, tác động lên chitin, làm giảm khối lượng phân tử của chitin

Từ quan điểm để đạt được hiệu suất khử protein cao, một phương pháp có tính

ứng dụng cao hơn là sử dụng vi khuẩn phân giải protein stam Pseudomanas

maltophilia [29] Nguyên liệu vỏ cua (crab) được khử khoáng bằng dung dịch HCl 2N

trong thời gian 2 ngày ở nhiệt độ phòng, sau đó nghiền nhỏ đến kích thước 0,5 cm Môi trường nuôi cấy được bổ sung 0,8 g nguyên liệu chứa chitin với so với 80 ml dung dịch K2HPO4 0,2%, tiếp tục cho vào hỗn hợp dung dịch HCl để điều chỉnh pH

về pH 7,0 P maltophilia cấy trong ống nghiệm, lắc đều đặn ở nhiệt độ 300C Cuối quá trình chitin được rửa sạch bằng nước Hàm lượng protein trong chitin giảm xuống còn 1% Phương pháp khử protein trong vỏ nhuyễn thể (kriel) tươi bằng vi khuẩn

Bacillus Subtilis, độ thủy phân protein đạt 98% sau 36 giờ, thu được chitin chứa

protein dưới 1% [30]

Các nhà khoa học đã nghiên cứu các phương pháp sản xuất chitin từ vỏ cua, vỏ ghẹ ứng dụng các enzyme khác nhau Phương pháp thu nhận chitin [12] bằng cách KK bằng HCl 1,4N ở nhiệt độ phòng trong 24h Sau đó khử protein bằng enzyme papain, pepsin hoặc tripsin

Phương pháp của Rogozina và cộng sự [31] thì công đoạn KK và KP được gộp làm một bằng enzyme nguồn gốc vi sinh vật hoạt động trong môi trường acid:

24h Chế phẩm enzyme protease được thu hối từ nấm Aspergillus niger, A fietidus, A

orizai Chitin thu được không chứa tro, chứa 5-10% protein Có thể loại bỏ hoàn toàn

protein ở công đoạn cuối bằng dung dịch kiềm

Tại LB Nga, trong công nghiệp người ta sản xuất chitin từ vỏ nhuyễn thể (kriel) bằng phương pháp sử dụng enzyme proteinase protosubtilina G20X [32] và pankreatuna [33] hoạt động trong môi trường kiềm

Các phương pháp công nghệ sinh học thu nhận chitin có nhược điểm chung là không loại bỏ hết protein ra khỏi chitin (độ tinh sạch dưới 95%), có thể ảnh hưởng xấu đến chất lượng chitin, và ứng dụng của chitin Ngoài ra, khi lựa chọn chế phẩm enzyme cần đặc biệt chú trọng đến khả năng chúng có chứa enzyme chitinase, vì trong quá trình xử lý nguyên liệu nếu hoạt lực chitinase mạnh có thể dẫn đến phá hỏng cấu trúc của chitin thành phẩm

1.1.5 Thu nhận chitosan

a) Deacetyl hóa (DA) chitin

Dẫn xuất deacetyl hóa đầu tiên khi biến tính chitin là chitosan, là polymer cao phân tử của glucosamin, hòa tan trong dung môi acid hữu cơ và vô cơ loãng (ngoại trừ acid sunfuric)

Điểm khác biệt giữa chitin và chitosan là khả năng hòa tan của chitosan trong dung dịch acid, nên có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp và y dược Để thu nhận chitosan cần khử nhóm acetyl từ N-acetyl-D-glucosamin (chitin) hay còn gọi

là phản ứng deacetyl hóa (DA) Phản ứng điều chế chitosan thu gọn như hình 1.6 Phản ứng DA đi kèm với việc cắt đứt liên kết glucosit của polymer Như vậy, chitosan là chất trùng hợp phân tán theo khối lượng phân tử - polymer D-glucosamin,

chứa 5-15% các nhóm acetal amid và gần 1% các nhóm có liên kết với acid amin và các peptid

Hình 1.6 – Phản ứng tóm tắt quá trình điều chế chitosan

Bề ngoài chitosan có cấu trúc hình vẩy với đường kính nhỏ hơn 10 mm hoặc dạng bột với độ nghiền nhỏ khác nhau, có màu trắng đến màu kem, hay gặp chitosan màu hơi ngả vàng, màu hơi nâu hoặc màu hồng, chitosan không mùi Tính chất khác của chitosan dạng khô là tính dẫn điện và có vị đắng Theo độ độc thì chitosan thuộc lớp 4

và không độc

Quá trình DA thường được tiến hành trong dung dịch kiềm mạnh ở nhiệt độ cao Thí nghiệm đầu tiên thu nhận chitosan là làm nóng chẩy chitin với kiềm rắn ở 1800

C Theo phương pháp này thu được chitosan với độ deacetyl tới 95%, nhưng làm biến dạng mạnh cấu trúc (đến 20 đơn vị) của chitosan

Phổ biến trong kĩ thuật người ta thực hiện quá trình DA bằng dung dịch kiềm 50%, vì đó là môi trường “mềm” hơn Có nhiều cách khác nhau để biến tính theo phương pháp này Thực hiện quá trình DA trong dung dịch kiềm có thể đạt độ deacetyl lên đến 100% khi thực hiện lại nhiều lần và ít làm biến dạng cấu trúc chitin Khi thu nhận chitosan trong những điều kiện như trên một mặt là quá trình DA, đồng thời xảy ra quá trình song song là làm hỏng cấu trúc chitin, nghĩa là làm đứt các liên

30-kết glucosit, dẫn tới giảm khối lượng phân tử và giảm độ nhớt của chitosan

Trong sản xuất chitosan theo phương pháp trên, tức là các quá trình xảy ra trong môi trường kiềm mạnh và nhiệt độ cao nên cần sử dụng các thiết bị chuyên dụng làm

từ hợp kim niken hoặc phủ ngoài bằng niken Thông thường để thực hiện quá trình

DA sử dụng các thiết bị phản ứng làm từ thép hợp kim chịu nhiệt, có bộ phận nhào trộn và lớp vỏ dẫn hơi

Công đoạn khó khăn, phức tạp nhất trong công nghệ sản xuất chitosan là tái sử dụng và xử lý nước thải là dung dịch kiềm với nồng độ cao Trong nhiều trường hợp quá trình DA thực hiện bằng dung dịch kiềm 30-50%, mặc dù trong quá trình phản ứng nồng độ kiềm giảm, nhưng thải ngay nước thải vào hệ thống là điều không được cho phép Cho nên khi thiết kế nhà máy sản xuất chitosan cần có phương án xử lý nước thải và bộ phận thu nhận protein từ trong nước thải

Có hàng loạt phương pháp thay thế một phần hay hoàn toàn nước trong quá trình

DA bằng các dung môi khác nhau hoặc các chất mang nhiệt Ví dụ trong [34] chất mang nhiệt được sử dụng là paraphin lỏng, hexan, rượu isopropyl Khi giảm mạnh lượng nước và dung dịch kiềm trong quá trình DA, giảm sự phá hỏng cấu trúc polymer, độ deacetyl đạt 92%

Phương pháp Brossignac [12] không sử dụng nước, người ta thay thế nước hoàn toàn bằng etanol với monoetylenglicol Khi DA bằng KOH ở nhiệt độ 1200C độ acetyl đạt 83%

Takeda [34] nghiên cứu phương pháp xử lý chitin trong khí trơ hydrocylamin ở

Từ những nghiên cứu của các nhà khoa học như trên đã liệt kê về quá trình deacetyl trong kiềm có thể rút ra một số nhận định Trước hết, độ bền của chitin trong quá trình DA được lý giải bởi sự có mặt của liên kết hydro giữa nhóm carboxyl và nguyên tử ni-tơ của nhóm amid trong cấu trúc micell Để phá vỡ liên kết (liên kết bền

vững) cần tiến hành ở nhiệt độ cao (100-1600C) Khi tăng nhiệt độ và giữ nồng độ bazơ ở mức thấp (30%) độ deacetyl đạt giá trị 98%, đôi khi khối lượng phân tử giảm làm cho độ nhớt của chitosan cũng giảm theo Để bảo toàn khối lượng phân tử trong quá trình xử lý chitin cần giảm nhiệt độ Phản ứng deacetyl xảy ra nhanh nhất ở giờ đầu tiên trong quá trình xử lý, thường đạt hiệu suất 70% khi nồng độ bazơ là 50% ở nhiệt độ 1000C Phản ứng chậm lại ở giờ thứ 5 khi độ deacetyl đạt 80% Như vậy, kéo dài quá trình xử lý không làm tăng được độ deacetyl, mà còn ảnh hưởng đến cấu trúc của chitosan

Cấu trúc chitin là cấu trúc mạng tinh thể nên độ hòa tan và độ hút nước của chitin thấp Kích thước của chitin sau khi nghiền ảnh hưởng đến độ đồng nhất của sản phẩm chitosan sau khi deacetyl Nghiền nhỏ chitin làm tăng bề mặt tiếp xúc của chitin với hóa chất từ nội phân tử Khi kích thước hạt chitin quá lớn quá trình deacetyl xảy ra không hoàn toàn, lớp bề mặt của chitin bị deacetyl nhiều hơn so với các lớp phía trong Khi hòa tan trong acid axetic những lớp mặt ngoài tạo thành dung dịch, lớp phía trong của hạt chitin không bị deacetyl hoàn toàn chỉ hút nước Hiện tượng deacetyl không hoàn toàn như trên của chitosan làm ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng của chúng Trong trường hợp chúng ta nghiền chitin với kích thước đủ nhỏ và đồng đều thì các hạt chitin được deacetyl như nhau tạo điều kiện thu được sản phẩm với độ đồng nhất cao hơn

Môi trường để thực hiện quá trình deacetyl ảnh hưởng lớn đến độ biến dạng cấu trúc của chitin, ví như sự có mặt của oxy Các nhà khoa học đã thực hiện hàng loạt các nghiên cứu để loại bỏ oxy ra khỏi môi trường phản ứng DA Một giải pháp đơn giản nhất là nén chặt nguyên liệu, hút hết khí ra khỏi môi trường phản ứng và đưa khí ni-tơ vào rồi môi trường kín Thực hiện quá trình DA trong môi trường như trên so với thực hiện ngoài không khí là làm tăng khối lượng phân tử và độ nhớt của sản phẩm chitosan, không làm giảm độ deacetyl

Yếu tố quan trọng trong quá trình DA là liên tục khuấy đảo hỗn hợp phản ứng Thực tế sử dụng cả thiết bị có bộ phận khuấy đảo và không có bộ phận khuấy đảo với các nguyên liệu polymer khác nhau Trong trường hợp sử dụng thiết bị khuấy đảo cần chú trọng đến độ đặc của hỗn hợp phản ứng, xác định bằng tỉ lệ giữa pha lỏng và pha rắn Tỉ lệ khối lượng tối ưu giữa chitin và dung dịch kiềm là 1:5 - 1:12, tỉ lệ này lựa

chọn phụ thuộc vào chất lượng chitin Một hỗn hợp như vậy dễ dàng khuấy đảo, mà không cần sử dụng lượng NaOH dư thừa

Chitin có cấu trúc và thành phần hóa học giống như cellulose, nên có tính chất gần giống nhau Như đã biết, cellulose có tính hút nước (sự trương nở) trong các dung dịch kiềm loãng Những tính chất tương tự cũng được phát hiện ở chitin Ví như, khi chúng ta thực hiện 12 lần đông lạnh và giá đông chitin, sau đó cho chitin vào dung dịch kiềm 15-20%, thì xảy ra sự trương nở mạnh của chitin, độ tan cũng tăng Sự trương nở và hòa tan của chitin trong dung dịch kiềm ở nhiệt độ thấp là do sự giãn mạch của cấu trúc chitin, mở ra khả năng làm biến tính và thu nhận polymer với chất lượng đồng nhất Các nhà khoa học đã nghiên cứu phương pháp thu nhận dung dịch chitin kiềm tính bằng một chu kì đông lạnh và giá đông và sau đó tiến hành các phản ứng DA trong môi trường đồng nhất [26]

Tóm lại, tất cả các phương pháp DA đã biết được ứng dụng trong sản xuất chitosan ở quy mô công nghiêp đều thực hiện ở nhiệt độ cao và môi trường kiềm mạnh Người ta đã nghiên cứu phương pháp DA “lạnh” [27], các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng (không thấp hơn 20-220C) sử dụng các thiết bị làm từ thép không rỉ hoặc vật liệu polymer Nồng độ NaOH giảm xuống 30-40% với tỉ lệ chitin: dung dịch kiềm là 1:10 - 1:15 Ở điều kiện mềm như trên có thể thu được chitosan với độ nhớt và

độ deacetyl cao

b) Sấy chitosan Nghiền và bảo quản

Sau khi deacetyl và rửa đến pH trung hòa sản phẩm chitosan có khả năng hydrat hóa mạnh, chitosan trương nở chứa hơn 70% nước

Hình 1.7 - Máy sấy, tạo hạt loại FL

Để bảo quản chitosan cần sấy ở nhiệt độ 50-550C Khi sấy ở nhiệt độ cao chitosan

bị đóng tảng, tối màu và giảm độ hòa tan, giảm khả năng ứng dụng của chitosan Chế

độ sấy tốt nhất của chitosan thực hiện trong máy sấy sôi phân tầng ở 500C Chitosan với khối lượng phân tử thấp và tan trong nước thì phải sấy phun Chitosan khô có độ

ẩm 8-10% (hình 1.7)

Để ứng dụng chitosan trong y dược để làm bao bọc thuốc và làm viên cần nghiền nhỏ chitosan đến kích thước 100-200 mkM Chitosan còn giữ cấu trúc tinh thể của chitin nên khó nghiền nhỏ, nên để thu được chitosan ở dạng bột cần nghiền nhỏ, sau

đó cắt, mài và đập trong máy phay hay máy nghiền bi (hình 1.8)

Khó khăn nhất trong việc nghiền chitosan là sấy không đúng quy cách hoặc chitosan bị sừng hóa, trong những trường hợp này chitosan có độ bền cao, rất khó nghiền nhỏ

Trong quá trình bảo quản chitosan, quan sát dưới ánh sáng thấy màu của chitosan biến đổi đến màu nâu và giảm độ hòa tan Cho nên cần bảo quản chitosan trong bao bì kín, không cho ánh sáng đi qua (ví dụ, trong hộp, túi, bao) trong các phòng kín, khô ráo và nhiệt độ thường

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacsillus subtilis và enzyme protease

1.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc giới Bacteria, ngành Firmicuter, lớp Bacili, bộ

Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus, loài subtilis

Hình 1.9 - Vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nhuộm gram

Hình 1.10 - Hình ảnh đĩa khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus subtilis

Năm 1835, vi khuẩn này được tìm ra và đặt tên là Vibrio subtilis bởi Christian

Gottfried Ehrenberg Đến năm 1872 được Ferdinand Cohn đổi thành Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là loại trực khuẩn gram dương, có hình que đứng riêng lẽ hoặc

kết thành chuỗi hoặc thành sợi và có khả năng sinh ngoại bào tử Ngoại bào tử được hình thành khi gặp các điều kiện bất lợi của môi trường như thiếu hụt các thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ quá cao, hoặc các sản phẩm phụ tạo thành trong môi trường ức chế hoạt động của vi khuẩn, Bào tử có thể tồn tại trong môi trường một thời gian

khá dài và khi gặp điều kiện thuận lợi trở lại, nó sẽ nảy mầm và hình thành nên tế bào

vi khuẩn mới

Vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính proteaza và amilaza, có khả năng phân huỷ

nhiều dạng hợp chất hữu cơ đặc biệt là protein và tinh bột

Trước đây, người ta nghĩ rằng đây là loại trực khuẩn hiếu khí bắt buộc, nhưng

điều đó không chính xác Trong điều kiện yếm khí vi khuẩn Bacillus subtilis vẫn phát

triển, mặc dù có kém hơn trong điều kiện hiếu khí Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 35 – 450C (môi trường nuôi cấy kà 370C) và nhiệt độ tối đa là 600

C Môi trường có pH dưới 4,5 chúng ngừng phát triển [4]

Vi khuẩn này được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên, nhiều nhất trên cỏ khô, vì vậy còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô

Trên đây là hình ảnh của vi khuẩn Bacillus subtilis được soi dưới kính hiển vi sau

khi nhuộm gram và hình ảnh khẩn lạc thu nhận được sau khi nuôi cấy (hình 1.9) Khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng đục, mép viền răng cưa, bề mặt khuẩn lạc không nhẵn bóng mà nhăn và có những nếp gấp nhỏ (hình 1.10)

1.2.2 Giới thiệu về enzyme protease

a) Lịch sử phát triển

Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác cho các quá trình thủy phân liên kết peptide trong các peptide hoặc protein Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hoá được phát hiện sớm hơn cả Từ thế kỷ 18, nhà bác học người Pháp Recomur đã phát hiện trong dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hoá thịt Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị Tuy nhiên, mãi đến

30 năm sau mới tách được enzyme này Năm 1859, Corvisart đã tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm nhưng chế phẩm này vẫn còn chứa nhều protein và các tạp chất khác Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colodion đã tách được tripxin với amylaza tuỵ tạng Phương pháp hấp thụ lựa chọn của Danilevxki có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme cũng như protein Năm 1861 Brunke cũng đã tách được các pepxin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết Năm 1872, Hommarster đã tách được chế phẩm chymozin (renin)

Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn Năm 1874, Group Besanez công

bố đã nhận được protease từ hạt của một loại cây họ đậu

Các protease của vi sinh vật được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950 mặc dù từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải của xạ khuẩn Trong hơn mười năm nay, số công trình nghiên cứu về protease vi sinh vật đang tăng lên đáng kể nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease về động vật và thực vật [9]

b) Tính chất của enzyme protease

Protease là các enzyme xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptide (CO-NH) trong phân

tử protein và các cơ chất tương tự Nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Dưới tác dụng của protease, protein bị thuỷ phân theo sơ đồ sau:

Protein → pepton → polypeptit → peptit→ axit amin

Đây là quá trình thuỷ phân tương đối phức tạp và có sự tham gia của nhiều loại protease khác nhau gồm hai loại chính là exoprotease và endoprotease

c) Phân loại enzyme protease

Để phân loại protease, ta dựa vào 2 cách sau:

Cách 1: Dựa vào trung tâm hoạt động:

Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm: Aminopeptidase: xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit ở đầu Nitơ của mạch polypeptide; Cacboxypeptidase: xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptide ở đầu cacbon của mạch polypeptide Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo-peptidase; Dipeptihydrolase: xúc tác sự thuỷ phân các liên kết dipeptide; Proteinase: xúc tác sự thuỷ phân các liên kết peptide nội mạch [2]

Cách 2 : Dựa vào cơ chế thuỷ phân, protease được phân thành hai nhóm chính:

Exoprotease: những enzyme thuỷ phân các liên kết đầu mút của chuỗi mạch polypeptide; Endoprotease: những enzyme xúc tác thuỷ phân các liên kết peptide ở giữa mạch polypeptide

Người ta cũng phân loại các protease theo vùng pH hoạt động tối thích: protease axit, trung tính, và kiềm tính Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của enzyme còn phụ thuộc vào bản

chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [2]

d) Nguồn thu enzyme proteaza

Protease thu nhận từ thực vật: chúng ta có thể thu một lượng lớn protease từ thực vật Tuy nhiên việc thu nhận protease từ thực vật gặp nhiều vấn đề: phải có đất trồng trọt, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết khí hậu, đất đai, phải trải qua một thời gian dài Tuy vây, một số các protein thu nhận từ thực vật có chất lượng rất tốt như Papain, Bromelain, Ficin

Protein thu nhận từ động vật: Các protein có nguồn gốc từ động vật như tripxin, chymotrypxin, pepxin có thể thu được với số lượng tinh khiết Tuy nhiên việc sản xuất nó phải phụ thuộc vào vật nuôi cần giết mổ, các điều kiện nông nghiệp

Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật: Khả năng không đáp ứng được nhu cầu trên thế giới của enzyme động vật và thực vật dẫn đến sự quan tâm ngày càng tăng của enzyme vi sinh vật Vi sinh vật là nguồn cung cấp enzyme tuyệt vời do tính đa dạng sinh hoá và tính nhạy cảm về kỹ thuật di truyền của chúng Protease vi sinh vật chiếm khoảng 40% tổng lượng enzyme bán trên thế giới [2], chúng có nhiều ưu điểm hơn so với protease của động vật và thực vật do các tính chất của chúng phù hợp với khả năng ứng dụng công nghệ sinh học Các protease có thể được thu nhận từ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn

e) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ vi sinh vật

Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật nói riêng cũng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm môi trường, nhiệt độ nuôi, pH môi trường, độ thông khí, thành phần môi trường…

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển, khả

năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Tùy từng vi sinh vật, nhiệt độ thích hợp có khác nhau: các loại nấm mốc phát triển thích hợp ở nhiệt độ 22-320C, còn các vi khuẩn ở nhiệt độ cao hơn 36-550C Nói chung đa số vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

Ảnh hưởng của pH môi trường: Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi

trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật Hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Đối với

nấm mốc pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease vào khoảng 6 - 6,5 Các

vi khuẩn phát triển tốt và tạo thành nhiều enzyme ở pH gần trung tính 6,6 - 7,4

Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự tích luỹ protease trong môi trường Đáng lưu ý là pH môi trường thường có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật pH ban đầu của môi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau không giống nhau Đối với các nấm mốc, pH này vào khoảng 3,8 – 5,6, còn đối với vi khuẩn là 6,2 – 7,4 [2]

Ảnh hưởng của độ thông khí của môi trường: Tuỳ theo tính chất của từng loài vi

sinh vật khác nhau và sản phẩm cần thu nhận ở chúng mà sự ảnh hưởng của yếu tố này là khác nhau Trong một số trường hợp, thiếu oxy tuy kiềm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình sinh tổng hợp protease và có thể ngược lại

Độ thông khí của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protease Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo vi sinh vật Trong một số trường hợp, thiếu oxy tuy có kiềm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau (Aleeva 1973-Aravina và cộng sự năm 1976) Ngay cả đối với một số vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp các protease khác nhau (Crivova và tập thể năm 1977) Trong một số trường hợp, sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm tổng hợp protease

Đối với nấm mốc, chế độ sục khí thích hợp 10-12m3

không khí vô trùng (có nhiệt

độ không cao quá 400C) trên 1m3 môi trường trong 1h với thời gian nuôi 68-73h Với thời gian nuôi ngắn hơn trong các thùng lên men giống (48h) và trong các thùng lên men sản xuất (48-52h) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi

Asp.oryzae phải là 30m3/m3 môi trường/giờ đối với thùng nhân giống và m3/m3 môi

trường/ giờ cho thùng sản xuất Khi nuôi Bacillus subtilis trong các thùng nhân giống

có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng với lượng là 40 m3

/m3 môi trường/1h Và nuôi vi khuẩn này trong các thùng lên men trong sản xuất (trong 48h ở

370C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng với lượng 60 m3

/m3môi trường/h

Ảnh hưởng của thành phần môi trường: Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn

đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ nồng độ thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng các chất cảm ứng vì protease là enzyme cảm ứng Đối với một vi sinh vật nhất định, điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp các enzyme khác nhau thì không giống nhau Nắm vững các qui luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinh vật sinh tổng hợp định hướng một loại enzyme xác định

* Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Nguồn cacbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường dùng là các glucid: monosacarit, disacarit và cả polysacarit Các chất này ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật Đặc tính tác dụng của nguồn cacbon tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật

Nguồn cacbon và nitơ tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mỳ, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng

Trong số monosacarit, glucose ảnh hưởng rất khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như sinh tổng hợp protease

* Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Các chất có thể dùng làm nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của chúng) hoặc các muối vô cơ (muối amôn, muối nitrat) Nhiều vi sinh vật còn

có thể sử dụng cả nitơ của HNO3, HNO2 Nồng độ dạng nitơ trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt và có quy luật đến quá trình tổng hợp protease ngoại bào ở vi sinh vật Nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease

vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: các loại bột khác nhau (có gluten), nước chiết của cám, nấm men đã

tự phân giải, pepton, protein…

Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon, nitơ thích hợp còn cần phải chải chọn tỷ

lệ thích hợp giữa C : N Bên cạnh đó photpho và lưu huỳnh cũng có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình sinh tổng hợp protease

Ngoài các yếu tố kể trên các nguyên tố vi lượng (Steiner 1961), NaCl (Kovaleva

và tập thể 1977), vitamin (Emxêva 1975) và một số yếu tố khác (Aravina và tập thể

1977) cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật

1.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis của các tác giả trong nước

Năm 1997, TS Lê Đức Mạnh đã tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu thu nhận và

ứng dụng α-amylase trong công nghiệp sản xuất bia” dùng Bacillus subtilis

CNTP-B-08 có khả năng sinh tổng hợp α-amylase cao, hoạt độ của nó từ môi trường nuôi cấy

bề mặt là 2610SKB/g để thay thế một malt đại mạch bằng các loại nguyên liệu sẵn có trong nước như: ngô 30%, gạo 30%, đại mạch 40%, do đó giá thành sản phẩm hạ Năm 2004, tác giả Vũ Ngọc Bội đã có công trình “Nghiên cứu quá trình thuỷ

phân protein từ Bacillus subtilis S5” trong điều kiện nhiệt độ là 50oC, pH tự nhiên, tỉ lệ phế phẩm 0,3% và nồng độ muối thích hợp là 3%

Năm 1998, tác giả Lê Đức Mạnh đã có nghiên cứu “Nghiên cứu thu nhận và bảo

quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis” Protease

của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 42 – 48oC, nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn thì protease sẽ bị mất hoạt độ đáng kể chỉ còn lại khoảng 40%, pH thích hợp cho protease hoạt động là 6,4 – 7 Protease của vi khuẩn khá bền với nhiệt độ, ở nhiệt

độ 50oC, hoạt độ của protease không giảm sau 6 giờ Ở nhiệt độ cao hơn thì hoạt độ protease giảm dần theo thời gian và đặc biệt ở nhiệt độ 70oC hoạt độ của protease giảm rất nhanh

Năm 2004, Th.S Đỗ Thị Bích Thuỷ và TS Trần Thị Xô đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu một số ảnh hưởng lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis” Kết

quả của nghiên cứu cho thấy nguồn cacbon và nitơ có tác dụng kích thích cao nhất là

tinh bột tan và casein Thành phần nuôi cấy chủng Bacillus subtillis trong phòng thí

nghiệm bao gồm: Pepton 1%, cao thịt 0,3%, muối 0,5%, tinh bột tan 1,75%, cao nấm 0,1%, ph ban đầu là 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất ứng với môi trường tối ưu

để Bacillus subtillis sinh protease mạnh nhất là 35o

C

1.3 Các lĩnh vực ứng dụng của chitin/chitosan

Chitin và chitosan có thể dễ dàng bị vi khuẩn phân hủy, tức là chúng cũng thân thiện với môi trường hơn các loại polymer tổng hợp Hiện nay chitosan được ứng

dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: y học, thực phẩm, nông nghiệp, môi trường…

1.3.1 Trong y học

Chitin và chitosan là nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bỏng, viêm loét dạ dày,

hạ cholesterol, trị béo phì, giảm đau, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp và chống được cả bệnh ung thư

Tác nhân hạ cholesterol: Chitosan có chức năng hạ cholesterol trong ruột động vật Người ta đã tiến hành thí nghiệm với thỏ và thấy khi được cho ăn thức ăn giàu cholesterol 0.9% trong 39 ngày, lượng cholesterol huyết thanh tăng từ 79 lên 650 mg/ trên 1kg thể trọng Trong trường hợp với khẩu phần ăn như trên nhưng có bổ sung 2% chitosan, lượng cholesterol huyết thanh chỉ tăng khoảng 300 mg/1kg thể trọng, trong

đó lượng cholesterol có ích (HDL – cholesterol) giảm không đáng kể Và từ lâu, một

số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ

Điều trị béo phì: Khi vào đường tiêu hóa, chitosan có khả năng bao các hạt cầu béo và kéo chúng thải ra ngoài theo (động vật không tiêu hóa chitosan) nhờ đó nó được ứng dụng làm thuốc giảm béo Nước ta hiện nay đã có thuốc Chitozan để giảm béo

Các vật liệu y sinh học và dược phẩm: chitin và các dẫn xuất được sử dụng như những vật liệu y sinh học hay vật liệu để bao gói các loại thuốc tan chậm Film chitosan bao thuốc cũng có công dụng như các dạng con nhộng thương phẩm và được

sử dụng như vật liệu dùng để cấy giải phóng chậm các loại thuốc chống ung thư Chitosan cũng được đưa vào công thức các loại thuốc uống làm gia tăng sự hấp thu của thuốc vào máu

Vật liệu vá vết thương: Các vết thương ở mô động, thực vật có thể được bao bằng một tấm màng hay một miếng xốp chitin và chitosan dạng bông hoặc dạng bột mịn Các vết thương cũng có thể được trị liệu bằng các dung dịch hay kem chitin và chitosan Kết quả là sự phát triển của các tế bào ở vùng mô bị thương được kích thích, chitinase và lysozyme được tăng cường dẫn đến mau lành vết thương và hạn chế nhiễm trùng Tại cuộc chiến Iraq vừa qua, Mỹ cũng đã sử dụng loại băng cứu thương

kiểu mới, kỹ thuật cao, có thành phần cấu tạo bởi chất chitosan So với các loại băng thường, tốc độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần

Chữa bệnh khớp: Điển hình trên thị trường dược hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin đang được thịnh hành trên toàn thế giới So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ưu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng phụ, không độc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho người bệnh (điều này có ý nghĩa rất quan trọng) Nước Mỹ đã tiêu thụ được hơn 1 tỷ viên nang Glucosamin Những năm gần đây, loại thuốc chữa khớp này còn đựợc phổ cập rộng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam Nước ta cũng có thuốc Glusivac đặc trị thoái hóa khớp [19]

1.3.2 Trong xử lý nước thải và làm trong nước sinh hoạt

Dùng chitosan để hấp thụ các ion kim loại nặng gây ô nhiễm môi trường sinh thái như Cu, Hg, Cr, Pb, Ni, Cd

Chitosan cationit tạo các phức hợp đa điện ly với những polymer polyanionic và tạo phức hợp chelate với các ion kim loại để tạo kết tủa Các phản ứng này được ứng dụng để làm trong nước thải ô nhiễm Vào năm 1975, muối chitosan acetate lần đầu tiên được một công ty Nhật giới thiệu như một tác nhân cationit tự nhiên để đông tụ

và loại các chất thải trong nước cống Hiện nay hệ thống này vẫn còn được sử dụng để

xử lý nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước thải (ví dụ nước hồ bơi), thu hồi các protein và khoáng từ nước thải công nghiệp, bao bọc các hạt béo, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong nước tiểu và tách các chất độc nội bào từ dung dịch loãng Chitosan cũng được sử dụng như một chất hấp phụ để tách các đồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước ô nhiễm và thu hồi uranium từ nước biển và nước ngọt [27]

1.3.3 Trong nông nghiệp

Làm phân bón rau sạch: Chitin và chitosan chủ yếu được bón ở dạng bột, dạng miếng hay dạng dung dịch vào đất nông nghiệp hay môi trường nuôi cấy lỏng Ngoài

ra dung dịch chitosan có thể được phun lên lá cây

Xử lý hạt giống: hạt giống có thể được nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt bằng một màng chitin hay chitosan mỏng hay bột mịn Khi được bao phủ như vậy, hoạt động của chitinase của hạt được tăng cường trong giai đoạn nảy mầm

Sự tăng cường chitinase trong hạt sẽ làm gia tăng khả năng tự vệ sinh học của hạt qua việc nhiễm VSV, kết quả là làm cho cây trồng phát triển tốt

1.3.4 Trong mỹ phẩm

Chitosan là nguyên liệu sản xuất kem dưỡng da, kem chống tia tử ngoại…

Các muối hữu cơ của chitosan phân tử thấp hòa tan trong ethanol loãng và được

sử dụng như một thành phần của keo xịt tóc

CM-chitin và HP-chitosan cationic hòa tan trong nước và bền trong một khoảng

pH rộng, chúng được sử dụng như một thành phần của mỹ phẩm chăm sóc da Chitosan, CM-chitosan, HP-chitosan có chức năng tạo độ ẩm cho da, ngăn cản sự hủy hoại cơ học tóc Đặc tính giữ độ ẩm tương ứng với dung dịch propylenglycol 20% và dung dịch hyaluronic loãng Những dẫn xuất trên của chitosan có thể ngăn chặn sự nhiễm khuẩn trên da và hoạt hóa tế bào da dẫn đến sự ngăn chặn sự lão hóa của da [19, 27]

1.3.5 Trong thực phẩm

Hiện nay chitosan được sử dụng rất phổ biến trong sản xuất thực phẩm Có thể sử dụng để thu hút nước và béo (quá trình nhũ hóa), kết hợp với thuốc nhuộm (quá trình đồng hóa), quá trình đông đặc Chitosan cũng được chứng minh là có khả năng tạo dạng màng mỏng để sử dụng như là những lớp màng mỏng hoặc những lớp bao không độc hại (có thể ăn được) Màng bao Chitosan có thể cải thiện khả năng bảo quản các loại thực phẩm dễ bị thối rữa bằng cách giảm lượng không khí bên trong bao gói cũng như giảm quá trình thoát hơi nước

Có thể nhúng trực tiếp thực phẩm vào dung dịch chitosan pha sẵn rồi để khô, tạo thành một lớp màng mỏng tự nhiên trên bề mặt sản phẩm: trứng, thịt cá, rau quả, giá

đỗ, bánh gạo, nhúng cải bắp trước khi làm kim chi…

Hoặc cũng có thể tạo thành màng trước rồi mới cho sản phẩm vào: bánh mì, xúc