a) Lịch sử phát triển
Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác cho các quá trình thủy phân liên kết peptide trong các peptide hoặc protein. Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hoá đƣợc phát hiện sớm hơn cả. Từ thế kỷ 18, nhà bác học ngƣời Pháp Recomur đã phát hiện trong dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hoá thịt. Năm 1836, Schwam đã quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch vị. Tuy nhiên, mãi đến 30 năm sau mới tách đƣợc enzyme này. Năm 1859, Corvisart đã tách đƣợc tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận đƣợc ở dạng chế phẩm nhƣng chế phẩm này vẫn còn chứa nhều protein và các tạp chất khác. Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng pháp hấp phụ trên colodion đã tách đƣợc tripxin với amylaza tuỵ tạng. Phƣơng pháp hấp thụ lựa chọn của Danilevxki có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme cũng nhƣ protein. Năm 1861 Brunke cũng đã tách đƣợc các pepxin từ dịch dạ dày chó ở dạng tƣơng đối tinh khiết. Năm 1872, Hommarster đã tách đƣợc chế phẩm chymozin (renin).
33
Các protease thực vật đƣợc phát hiện muộn hơn. Năm 1874, Group Besanez công bố đã nhận đƣợc protease từ hạt của một loại cây họ đậu ...
Các protease của vi sinh vật đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950 mặc dù từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện đƣợc khả năng phân giải của xạ khuẩn. Trong hơn mƣời năm nay, số công trình nghiên cứu về protease vi sinh vật đang tăng lên đáng kể nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease về động vật và thực vật [9].
b) Tính chất của enzyme protease
Protease là các enzyme xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptide (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tƣơng tự. Nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.
Dƣới tác dụng của protease, protein bị thuỷ phân theo sơ đồ sau: Protein → pepton → polypeptit → peptit→ axit amin
Đây là quá trình thuỷ phân tƣơng đối phức tạp và có sự tham gia của nhiều loại protease khác nhau gồm hai loại chính là exoprotease và endoprotease.
c) Phân loại enzyme protease
Để phân loại protease, ta dựa vào 2 cách sau:
Cách 1: Dựa vào trung tâm hoạt động:
Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm: Aminopeptidase: xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit ở đầu Nitơ của mạch polypeptide; Cacboxypeptidase: xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptide ở đầu cacbon của mạch polypeptide. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo-peptidase; Dipeptihydrolase: xúc tác sự thuỷ phân các liên kết dipeptide; Proteinase: xúc tác sự thuỷ phân các liên kết peptide nội mạch [2].
Cách 2 : Dựa vào cơ chế thuỷ phân, protease được phân thành hai nhóm chính:
Exoprotease: những enzyme thuỷ phân các liên kết đầu mút của chuỗi mạch polypeptide; Endoprotease: những enzyme xúc tác thuỷ phân các liên kết peptide ở giữa mạch polypeptide.
Ngƣời ta cũng phân loại các protease theo vùng pH hoạt động tối thích: protease axit, trung tính, và kiềm tính. Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác vì pH hoạt động tối thích của enzyme còn phụ thuộc vào bản
34
chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa [2].
d) Nguồn thu enzyme proteaza
Protease thu nhận từ thực vật: chúng ta có thể thu một lƣợng lớn protease từ thực vật. Tuy nhiên việc thu nhận protease từ thực vật gặp nhiều vấn đề: phải có đất trồng trọt, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết khí hậu, đất đai, phải trải qua một thời gian dài... Tuy vây, một số các protein thu nhận từ thực vật có chất lƣợng rất tốt nhƣ Papain, Bromelain, Ficin ...
Protein thu nhận từ động vật: Các protein có nguồn gốc từ động vật nhƣ tripxin, chymotrypxin, pepxin... có thể thu đƣợc với số lƣợng tinh khiết. Tuy nhiên việc sản xuất nó phải phụ thuộc vào vật nuôi cần giết mổ, các điều kiện nông nghiệp...
Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật: Khả năng không đáp ứng đƣợc nhu cầu trên thế giới của enzyme động vật và thực vật dẫn đến sự quan tâm ngày càng tăng của enzyme vi sinh vật. Vi sinh vật là nguồn cung cấp enzyme tuyệt vời do tính đa dạng sinh hoá và tính nhạy cảm về kỹ thuật di truyền của chúng. Protease vi sinh vật chiếm khoảng 40% tổng lƣợng enzyme bán trên thế giới [2], chúng có nhiều ƣu điểm hơn so với protease của động vật và thực vật do các tính chất của chúng phù hợp với khả năng ứng dụng công nghệ sinh học. Các protease có thể đƣợc thu nhận từ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn.
e) Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ vi sinh vật
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng nhƣ tổng hợp protease ở vi sinh vật nói riêng cũng chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố khác nhau nhƣ: độ ẩm môi trƣờng, nhiệt độ nuôi, pH môi trƣờng, độ thông khí, thành phần môi trƣờng…
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển, khả
năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng nhƣ tính chất của enzyme đƣợc tổng hợp. Tùy từng vi sinh vật, nhiệt độ thích hợp có khác nhau: các loại nấm mốc phát triển thích hợp ở nhiệt độ 22-320C, còn các vi khuẩn ở nhiệt độ cao hơn 36-550C. Nói chung đa số vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp
Ảnh hưởng của pH môi trường: Khi dùng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi
trƣờng ít ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật. Hơn nữa pH môi trƣờng hầu nhƣ không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Đối với
35
nấm mốc pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease vào khoảng 6 - 6,5. Các vi khuẩn phát triển tốt và tạo thành nhiều enzyme ở pH gần trung tính 6,6 - 7,4.
Khi dùng phƣơng pháp bề sâu, pH môi trƣờng có ảnh hƣởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự tích luỹ protease trong môi trƣờng. Đáng lƣu ý là pH môi trƣờng thƣờng có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật. pH ban đầu của môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau không giống nhau. Đối với các nấm mốc, pH này vào khoảng 3,8 – 5,6, còn đối với vi khuẩn là 6,2 – 7,4 [2].
Ảnh hưởng của độ thông khí của môi trường: Tuỳ theo tính chất của từng loài vi
sinh vật khác nhau và sản phẩm cần thu nhận ở chúng mà sự ảnh hƣởng của yếu tố này là khác nhau. Trong một số trƣờng hợp, thiếu oxy tuy kiềm hãm sự sinh trƣởng của vi sinh vật nhƣng lại làm tăng quá trình sinh tổng hợp protease và có thể ngƣợc lại.
Độ thông khí của môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên ảnh hƣởng này có khác nhau tuỳ theo vi sinh vật. Trong một số trƣờng hợp, thiếu oxy tuy có kiềm hãm sự sinh trƣởng của vi sinh vật nhƣng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease. Lƣợng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau (Aleeva 1973-Aravina và cộng sự năm 1976). Ngay cả đối với một số vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hƣởng khác nhau đến quá trình tổng hợp các protease khác nhau (Crivova và tập thể năm 1977). Trong một số trƣờng hợp, sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm tổng hợp protease.
Đối với nấm mốc, chế độ sục khí thích hợp 10-12m3
không khí vô trùng (có nhiệt độ không cao quá 400C) trên 1m3 môi trƣờng trong 1h với thời gian nuôi 68-73h. Với thời gian nuôi ngắn hơn trong các thùng lên men giống (48h) và trong các thùng lên men sản xuất (48-52h) thì lƣợng không khí cần sục vào môi trƣờng để nuôi
Asp.oryzae phải là 30m3/m3 môi trƣờng/giờ đối với thùng nhân giống và m3/m3 môi trƣờng/ giờ cho thùng sản xuất. Khi nuôi Bacillus subtilis trong các thùng nhân giống có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng với lƣợng là 40 m3
/m3 môi trƣờng/1h. Và nuôi vi khuẩn này trong các thùng lên men trong sản xuất (trong 48h ở 370C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng với lƣợng 60 m3
/m3 môi trƣờng/h.
36
Ảnh hưởng của thành phần môi trường: Thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn
đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lƣợng enzyme trong môi trƣờng cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ nồng độ thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng các chất cảm ứng vì protease là enzyme cảm ứng.
Đối với một vi sinh vật nhất định, điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp các enzyme khác nhau thì không giống nhau. Nắm vững các qui luật ảnh hƣởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinh vật sinh tổng hợp định hƣớng một loại enzyme xác định.
* Ảnh hƣởng của nguồn cacbon: Nguồn cacbon thƣờng dùng để nuôi cấy vi sinh vật thƣờng dùng là các glucid: monosacarit, disacarit và cả polysacarit. Các chất này ảnh hƣởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng nhƣ tổng hợp protease ở vi sinh vật. Đặc tính tác dụng của nguồn cacbon tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật.
Nguồn cacbon và nitơ tự nhiên thƣờng dùng trong môi trƣờng nuôi cấy là bột mỳ, bột đậu tƣơng, cám và nƣớc chiết của chúng.
Trong số monosacarit, glucose ảnh hƣởng rất khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng nhƣ sinh tổng hợp protease.
* Ảnh hƣởng của nguồn nitơ: Các chất có thể dùng làm nguồn nitơ trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của chúng) hoặc các muối vô cơ (muối amôn, muối nitrat). Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng cả nitơ của HNO3, HNO2. Nồng độ dạng nitơ trong môi trƣờng có ảnh hƣởng rõ rệt và có quy luật đến quá trình tổng hợp protease ngoại bào ở vi sinh vật.
Nguồn nitơ hữu cơ thƣờng có ảnh hƣởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò nhƣ chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng dùng là: các loại bột khác nhau (có gluten), nƣớc chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein…
Ngoài việc chọn nguồn và lƣợng cacbon, nitơ thích hợp còn cần phải chải chọn tỷ lệ thích hợp giữa C : N. Bên cạnh đó photpho và lƣu huỳnh cũng có ảnh hƣởng quan trọng đến quá trình sinh tổng hợp protease.
Ngoài các yếu tố kể trên các nguyên tố vi lƣợng (Steiner 1961), NaCl (Kovaleva và tập thể 1977), vitamin (Emxêva 1975) và một số yếu tố khác (Aravina và tập thể
37
1977) cũng có ảnh hƣởng đến lƣợng protease trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật.
1.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis của các tác giả trong nước
Năm 1997, TS. Lê Đức Mạnh đã tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu thu nhận và ứng dụng α-amylase trong công nghiệp sản xuất bia” dùng Bacillus subtilis CNTP-B- 08 có khả năng sinh tổng hợp α-amylase cao, hoạt độ của nó từ môi trƣờng nuôi cấy bề mặt là 2610SKB/g để thay thế một malt đại mạch bằng các loại nguyên liệu sẵn có trong nƣớc nhƣ: ngô 30%, gạo 30%, đại mạch 40%, do đó giá thành sản phẩm hạ.
Năm 2004, tác giả Vũ Ngọc Bội đã có công trình “Nghiên cứu quá trình thuỷ phân protein từ Bacillus subtilis S5” trong điều kiện nhiệt độ là 50oC, pH tự nhiên, tỉ lệ phế phẩm 0,3% và nồng độ muối thích hợp là 3%.
Năm 1998, tác giả Lê Đức Mạnh đã có nghiên cứu “Nghiên cứu thu nhận và bảo quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis”. Protease của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 42 – 48oC, nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn thì protease sẽ bị mất hoạt độ đáng kể chỉ còn lại khoảng 40%, pH thích hợp cho protease hoạt động là 6,4 – 7. Protease của vi khuẩn khá bền với nhiệt độ, ở nhiệt độ 50oC, hoạt độ của protease không giảm sau 6 giờ. Ở nhiệt độ cao hơn thì hoạt độ protease giảm dần theo thời gian và đặc biệt ở nhiệt độ 70oC hoạt độ của protease giảm rất nhanh.
Năm 2004, Th.S Đỗ Thị Bích Thuỷ và TS. Trần Thị Xô đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số ảnh hƣởng lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis”. Kết quả của nghiên cứu cho thấy nguồn cacbon và nitơ có tác dụng kích thích cao nhất là tinh bột tan và casein. Thành phần nuôi cấy chủng Bacillus subtillis trong phòng thí nghiệm bao gồm: Pepton 1%, cao thịt 0,3%, muối 0,5%, tinh bột tan 1,75%, cao nấm 0,1%, ph ban đầu là 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất ứng với môi trƣờng tối ƣu để Bacillus subtillis sinh protease mạnh nhất là 35oC.
1.3 Các lĩnh vực ứng dụng của chitin/chitosan
Chitin và chitosan có thể dễ dàng bị vi khuẩn phân hủy, tức là chúng cũng thân thiện với môi trƣờng hơn các loại polymer tổng hợp. Hiện nay chitosan đƣợc ứng
38
dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: y học, thực phẩm, nông nghiệp, môi trƣờng…
1.3.1 Trong y học
Chitin và chitosan là nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bỏng, viêm loét dạ dày, hạ cholesterol, trị béo phì, giảm đau, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xƣơng khớp và chống đƣợc cả bệnh ung thƣ.
Tác nhân hạ cholesterol: Chitosan có chức năng hạ cholesterol trong ruột động vật. Ngƣời ta đã tiến hành thí nghiệm với thỏ và thấy khi đƣợc cho ăn thức ăn giàu cholesterol 0.9% trong 39 ngày, lƣợng cholesterol huyết thanh tăng từ 79 lên 650 mg/ trên 1kg thể trọng. Trong trƣờng hợp với khẩu phần ăn nhƣ trên nhƣng có bổ sung 2% chitosan, lƣợng cholesterol huyết thanh chỉ tăng khoảng 300 mg/1kg thể trọng, trong đó lƣợng cholesterol có ích (HDL – cholesterol) giảm không đáng kể. Và từ lâu, một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ
Điều trị béo phì: Khi vào đƣờng tiêu hóa, chitosan có khả năng bao các hạt cầu béo và kéo chúng thải ra ngoài theo (động vật không tiêu hóa chitosan) nhờ đó nó đƣợc ứng dụng làm thuốc giảm béo. Nƣớc ta hiện nay đã có thuốc Chitozan để giảm béo.
Các vật liệu y sinh học và dƣợc phẩm: chitin và các dẫn xuất đƣợc sử dụng nhƣ những vật liệu y sinh học hay vật liệu để bao gói các loại thuốc tan chậm. Film chitosan bao thuốc cũng có công dụng nhƣ các dạng con nhộng thƣơng phẩm và đƣợc sử dụng nhƣ vật liệu dùng để cấy giải phóng chậm các loại thuốc chống ung thƣ. Chitosan cũng đƣợc đƣa vào công thức các loại thuốc uống làm gia tăng sự hấp thu của thuốc vào máu.
Vật liệu vá vết thƣơng: Các vết thƣơng ở mô động, thực vật có thể đƣợc bao bằng một tấm màng hay một miếng xốp chitin và chitosan dạng bông hoặc dạng bột mịn. Các vết thƣơng cũng có thể đƣợc trị liệu bằng các dung dịch hay kem chitin và chitosan. Kết quả là sự phát triển của các tế bào ở vùng mô bị thƣơng đƣợc kích thích, chitinase và lysozyme đƣợc tăng cƣờng dẫn đến mau lành vết thƣơng và hạn chế nhiễm trùng. Tại cuộc chiến Iraq vừa qua, Mỹ cũng đã sử dụng loại băng cứu thƣơng
39
kiểu mới, kỹ thuật cao, có thành phần cấu tạo bởi chất chitosan. So với các loại băng thƣờng, tốc độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần.
Chữa bệnh khớp: Điển hình trên thị trƣờng dƣợc hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin đang đƣợc thịnh hành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ƣu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng phụ, không độc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho