Chitin và chitosan là nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bỏng, viêm loét dạ dày, hạ cholesterol, trị béo phì, giảm đau, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xƣơng khớp và chống đƣợc cả bệnh ung thƣ.
Tác nhân hạ cholesterol: Chitosan có chức năng hạ cholesterol trong ruột động vật. Ngƣời ta đã tiến hành thí nghiệm với thỏ và thấy khi đƣợc cho ăn thức ăn giàu cholesterol 0.9% trong 39 ngày, lƣợng cholesterol huyết thanh tăng từ 79 lên 650 mg/ trên 1kg thể trọng. Trong trƣờng hợp với khẩu phần ăn nhƣ trên nhƣng có bổ sung 2% chitosan, lƣợng cholesterol huyết thanh chỉ tăng khoảng 300 mg/1kg thể trọng, trong đó lƣợng cholesterol có ích (HDL – cholesterol) giảm không đáng kể. Và từ lâu, một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ
Điều trị béo phì: Khi vào đƣờng tiêu hóa, chitosan có khả năng bao các hạt cầu béo và kéo chúng thải ra ngoài theo (động vật không tiêu hóa chitosan) nhờ đó nó đƣợc ứng dụng làm thuốc giảm béo. Nƣớc ta hiện nay đã có thuốc Chitozan để giảm béo.
Các vật liệu y sinh học và dƣợc phẩm: chitin và các dẫn xuất đƣợc sử dụng nhƣ những vật liệu y sinh học hay vật liệu để bao gói các loại thuốc tan chậm. Film chitosan bao thuốc cũng có công dụng nhƣ các dạng con nhộng thƣơng phẩm và đƣợc sử dụng nhƣ vật liệu dùng để cấy giải phóng chậm các loại thuốc chống ung thƣ. Chitosan cũng đƣợc đƣa vào công thức các loại thuốc uống làm gia tăng sự hấp thu của thuốc vào máu.
Vật liệu vá vết thƣơng: Các vết thƣơng ở mô động, thực vật có thể đƣợc bao bằng một tấm màng hay một miếng xốp chitin và chitosan dạng bông hoặc dạng bột mịn. Các vết thƣơng cũng có thể đƣợc trị liệu bằng các dung dịch hay kem chitin và chitosan. Kết quả là sự phát triển của các tế bào ở vùng mô bị thƣơng đƣợc kích thích, chitinase và lysozyme đƣợc tăng cƣờng dẫn đến mau lành vết thƣơng và hạn chế nhiễm trùng. Tại cuộc chiến Iraq vừa qua, Mỹ cũng đã sử dụng loại băng cứu thƣơng
39
kiểu mới, kỹ thuật cao, có thành phần cấu tạo bởi chất chitosan. So với các loại băng thƣờng, tốc độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần.
Chữa bệnh khớp: Điển hình trên thị trƣờng dƣợc hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin đang đƣợc thịnh hành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ƣu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng phụ, không độc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho ngƣời bệnh (điều này có ý nghĩa rất quan trọng). Nƣớc Mỹ đã tiêu thụ đƣợc hơn 1 tỷ viên nang Glucosamin. Những năm gần đây, loại thuốc chữa khớp này còn đựợc phổ cập rộng ở nhiều nƣớc trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta cũng có thuốc Glusivac đặc trị thoái hóa khớp [19].
1.3.2 Trong xử lý nước thải và làm trong nước sinh hoạt
Dùng chitosan để hấp thụ các ion kim loại nặng gây ô nhiễm môi trƣờng sinh thái nhƣ Cu, Hg, Cr, Pb, Ni, Cd.
Chitosan cationit tạo các phức hợp đa điện ly với những polymer polyanionic và tạo phức hợp chelate với các ion kim loại để tạo kết tủa. Các phản ứng này đƣợc ứng dụng để làm trong nƣớc thải ô nhiễm. Vào năm 1975, muối chitosan acetate lần đầu tiên đƣợc một công ty Nhật giới thiệu nhƣ một tác nhân cationit tự nhiên để đông tụ và loại các chất thải trong nƣớc cống. Hiện nay hệ thống này vẫn còn đƣợc sử dụng để xử lý nƣớc thải sinh hoạt, tái sử dụng nƣớc thải (ví dụ nƣớc hồ bơi), thu hồi các protein và khoáng từ nƣớc thải công nghiệp, bao bọc các hạt béo, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong nƣớc tiểu và tách các chất độc nội bào từ dung dịch loãng. Chitosan cũng đƣợc sử dụng nhƣ một chất hấp phụ để tách các đồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nƣớc ô nhiễm và thu hồi uranium từ nƣớc biển và nƣớc ngọt [27].
1.3.3 Trong nông nghiệp
Làm phân bón rau sạch: Chitin và chitosan chủ yếu đƣợc bón ở dạng bột, dạng miếng hay dạng dung dịch vào đất nông nghiệp hay môi trƣờng nuôi cấy lỏng. Ngoài ra dung dịch chitosan có thể đƣợc phun lên lá cây.
40
Xử lý hạt giống: hạt giống có thể đƣợc nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt bằng một màng chitin hay chitosan mỏng hay bột mịn. Khi đƣợc bao phủ nhƣ vậy, hoạt động của chitinase của hạt đƣợc tăng cƣờng trong giai đoạn nảy mầm. Sự tăng cƣờng chitinase trong hạt sẽ làm gia tăng khả năng tự vệ sinh học của hạt qua việc nhiễm VSV, kết quả là làm cho cây trồng phát triển tốt.
1.3.4 Trong mỹ phẩm
Chitosan là nguyên liệu sản xuất kem dƣỡng da, kem chống tia tử ngoại…
Các muối hữu cơ của chitosan phân tử thấp hòa tan trong ethanol loãng và đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần của keo xịt tóc.
CM-chitin và HP-chitosan cationic hòa tan trong nƣớc và bền trong một khoảng pH rộng, chúng đƣợc sử dụng nhƣ một thành phần của mỹ phẩm chăm sóc da. Chitosan, CM-chitosan, HP-chitosan có chức năng tạo độ ẩm cho da, ngăn cản sự hủy hoại cơ học tóc. Đặc tính giữ độ ẩm tƣơng ứng với dung dịch propylenglycol 20% và dung dịch hyaluronic loãng. Những dẫn xuất trên của chitosan có thể ngăn chặn sự nhiễm khuẩn trên da và hoạt hóa tế bào da dẫn đến sự ngăn chặn sự lão hóa của da [19, 27].
1.3.5 Trong thực phẩm
Hiện nay chitosan đƣợc sử dụng rất phổ biến trong sản xuất thực phẩm. Có thể sử dụng để thu hút nƣớc và béo (quá trình nhũ hóa), kết hợp với thuốc nhuộm (quá trình đồng hóa), quá trình đông đặc. Chitosan cũng đƣợc chứng minh là có khả năng tạo dạng màng mỏng để sử dụng nhƣ là những lớp màng mỏng hoặc những lớp bao không độc hại (có thể ăn đƣợc). Màng bao Chitosan có thể cải thiện khả năng bảo quản các loại thực phẩm dễ bị thối rữa bằng cách giảm lƣợng không khí bên trong bao gói cũng nhƣ giảm quá trình thoát hơi nƣớc.
Có thể nhúng trực tiếp thực phẩm vào dung dịch chitosan pha sẵn rồi để khô, tạo thành một lớp màng mỏng tự nhiên trên bề mặt sản phẩm: trứng, thịt cá, rau quả, giá đỗ, bánh gạo, nhúng cải bắp trƣớc khi làm kim chi…
41
xích…
Hoặc cho chitosan trực tiếp vào sản phẩm dạng lỏng: xử lý nƣớc quả, làm trong giấm, bảo quản tàu hũ, đồng hóa sữa, kem và mayonaise, bảo quản mì…[12, 19, 24].
42
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu:
Nguyên liệu đƣợc sử dụng bao gồm:
a) Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc phân lập và giữ giống tại phòng thí nghiệm CNSH - Khoa Hoá - trƣờng Đại học Bách Khoa - Đại học Đà Nẵng;
b) Vỏ đầu tôm đƣợc thu nhận từ công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền trung: Công ty chế biến và xuất khẩu thủy sản Thọ Quang;
Phụ phẩm sau khi thu nhận từ nhà máy chế biến thủy sản đƣợc sấy cho khô ròn ở nhiệt độ 400C rồi nghiền nhỏ và bảo quản làm nguồn nguyên liệu thu nhận chitin, và sau đó từ chitin thu nhận chitosan.
Trong nghiên cứu này nguyên liệu vỏ tôm đƣợc thu nhận từ hai loại tôm phổ biến trong chế biến trên địa bàn TP Đà Nẵng hiện nay là tôm sú (tiger shrimp – Penaeus monodon Fabricius) và tôn thẻ chân trắng (White Shrimp - Penaeus vannamei). Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên hỗn hợp 2 loại đầu vỏ tôm này.
a b
Hình 2.1 – Sự khác nhau của một số nguyên liệu tôm, vỏ của chúng dùng để thu nhận chitin/chitosan
43
c) Nội tạng cá để thu nhận chế phẩm enzyme protease đƣợc thu gom từ công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền trung: Công ty chế biến và xuất khẩu thủy sản Thọ Quang. Nội tạng cá sau khi đƣợc thu nhận từ nhà máy về đƣợc rửa sạch, xử lý bằng nƣớc muối 5%, sau đó đƣợc bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ -220C phục vụ thu nhận chế phẩm enzyme protease.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị:
Hoá chất chính:
- Các hoá chất tinh khiết nhƣ : HCl đậm đặc, Foocmol 40%, cồn tuyệt đối, KOH 0,01N, H2SO4…
- Các chỉ thị màu : thimolphtalein, phenolphtalein… - Pepton, casein, cao thịt, cao nấm…
- Và các hóa chất phục vụ các thí nghiệm phân tích khác.
Thiết bị:
- Tủ ổn nhiệt, máy lắc, thiết bị tiệt trùng, tủ lạnh đông, tủ cấy vô trùng. - Thiết bị li tâm
- Thiết bị cô đặc chân không - Thiết bị phân tích đạm Kjeldahl.
- Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm CNSH khác.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Định lượng nước
Vỏ tôm đƣợc sấy ở 1200C trong 3 giờ, đến khối lƣợng không đổi. Để nguội, sau đó cân xác định lƣợng nƣớc theo công thức:
2.2.2 Định lượng muối Calci carbonat
Muối calci carbonat trong vỏ tôm đƣợc định lƣợng bằng cách ngâm vỏ tôm đã đƣợc xay nhỏ và sấy khô trong dung dịch HCl 10% trong 6 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau đó lọc, lấy nƣớc cái dùng acid H2SO4 30% kết tủa Ca2+ trong dung dịch. Từ trọng lƣợng CaSO4 kết tủa và sấy khô suy ra hàm lƣợng calci carbonat
44
2.2.3 Định lượng chitin
Sauk hi loại bỏ calci carbonat và protein, chitin đƣợc đun nóng với dung dịch K2CO3 đậm đặc ở 1600C chitin không tan. Lọc, rửa sạch, sấy ở 1000C, thu đƣợc chitin.
2.2.4 Phương pháp xác định độ deacetyl của chitosan
Đơn vị phần trăm độ deacety trong sản phẩm chitosan đƣợc xác định bằng mức độ deacetyl (đây là tỉ lệ của khối lƣợng glucosamine so với số monomer chung trong phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thƣờng từ 70-90%.
2.2.5 Một số phương pháp xác định khác:
-Hàm lƣợng lipid (%), protein (%), tro (%) và hàm lƣợng nƣớc (%) đƣợc xác định theo GOST 7636-85 (LB Nga)
-Hàm lƣợng khoáng đƣợc phân tích theo chuẩn của AOAC (1990) - Phƣơng pháp xác định N-formon theo Sorensen
- Hoạt độ enzyme, và chế phẩm enzyme protease xác định theo phƣơng pháp Anson cải tiến
- Phƣơng pháp xác định QMAFAM (CFU/g) theo GOST 10444.15 – 94 (LB Nga) - Độ khử khoáng trong vỏ tôm đƣợc xác định theo công thức KK=[(mK1- mK2)/mK1]x100%; mk1, mk2-hàm lƣợng chất khoáng ban đầu và sau khi khử khoáng trong vỏ tôm .
-Độ khử protein trong vỏ tôm đƣợc xác định theo công thức KK=[(mP1- mP2)/mP1]x100%; mP1, mP2-hàm lƣợng protein ban đầu và sau khi khử protein trong vỏ tôm.
-Độ deacety trong sản phẩm chitosan đƣợc xác định theo tỉ lệ của khối lƣợng glucosamine so với số monomer chung trong phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thƣờng từ 70-90%; Độ nhớt của chitosan đƣợc xác định trên nhớt kế Roto Brookfield
45
Tổng quan các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về chitin/chitosan
Tính chất vật lí và hóa học của chitin/chitosan Các phƣơng pháp thu nhận chitin: hóa học, sinh học Phƣơng pháp thu nhận chitosan Các lĩnh vực ứng dụng chitin/chitosa n Ứng dụng vi khuẩn B. subtilis trong sản xuất chitin
Xây dựng các mô hình thí nghiệm giải quyết các vấn đề cần nghiên cứu của đề tài
Nghiên cứu thành phần
hóa học của vỏ đầu tôm học và hoạt độ enzyme của nội Nghiên cứu thành phần hóa tạng cá
Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy và khả năng sinh protease của
B.subtilis
Tách chiết enzyme protease từ nội tạng cá
Khử màu của vỏ đầu tôm
Khử khoáng của vỏ đầu tôm
Nghiên cứu khử protein của đầu vỏ tôm
Khử protein bằng chế phẩm enzyme protease, tách chiết từ nội tạng cá Khử protein bằng chế phẩm enzyme protease Khử khoáng lần 2 Chitin Chitosan Đánh giá chất lƣợng chitin Đánh giá chất lƣợng chitosan
46
Hình 2.2 – Sơ đồ mô hình các bƣớc thực hiện trong nghiên cứu 2.4 Xử lý số liệu
Số liệu trong nghiên cứu này là trung bình của ba lần phân tích. Kết quả đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab Professional v16.1.0.0. . Giá trị của p < 0,05 đƣợc xem là có ý nghĩa về mặt thống kê
47
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của vỏ tôm, nguyên liệu nội tạng cá và phƣơng pháp bảo quản nguyên liệu nội tạng cá. nội tạng cá và phƣơng pháp bảo quản nguyên liệu nội tạng cá.
3.1.1 Thành phần hóa học của một số nguyên liệu chứa chitin, phổ biến ở thành phố Đà Nẵng thành phố Đà Nẵng
Phân tích thành phần hóa học của vỏ tôm sau khi đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 400
C nhận thấy hàm lƣợng chitin tƣơng đối cao từ 33-35% tổng khối lƣợng vỏ tôm khô. Bên cạnh đó hàm lƣợng protein là 12-14%, điều này đòi hỏi cần có biện pháp phù hợp để loại bỏ lƣợng protein tƣơng đối lớn trong nguyên liệu này. Đồng thời hàm lƣợng chất khoáng rất cao 37-40% tổng khối lƣợng nguyên liệu, nên cần sử dụng phƣơng pháp loại khoáng ở độ pH phù hợp để đạt hiệu suất tốt nhất trong thu nhận chitin/chitosan.
Bảng 3.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm
STT Loại
nguyên liệu Thành phần hóa học, %
Protein Lipid Chất khoáng Chitin Nƣớc 1 Vỏ tôm sú 14±1,3 1,5±0,2 37±1,9 33±1,2 14,5±1,9 2 Vỏ tôm thẻ chân trắng 12±1,2 0,4±0,1 40±2,1 35±2,5 12,6±1,7 3 Hỗn hợp vỏ tôm sú và vỏ tôm thẻ chân trắng 13±1,6 0,95±0,5 38,5±2,4 39,5±1,6 8,05±1,5
Ngoài ra, hàm lƣợng lipid trong hỗn hợp vỏ tôm sú và vỏ tôm thẻ chân trắng gần 1%, các lipid này chứa chất màu đặc trƣng của vỏ tôm là carotenoid, carotenoid có thể gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng chitin về tính cảm quan, nhƣng chúng ta có thể tận dụng chất màu này để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nên cần có biện pháp phù hợp để thu hồi nguồn chất mà tự nhiên quý giá này.
48
3.1.2 Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá
Các kết quả thí nghiệm xác định thành phần hóa học của nguyên liệu dùng để tách chiết chế phẩm enzyme protease đƣợc trình bày trong bảng 3.2.
Từ bảng 3.2 ta thấy sau quá trình bảo quản lạnh đông hàm lƣợng nƣớc trong nguyên liệu giảm xuống. Nguyên nhân là do khả năng giữ nƣớc của nguyên liệu giảm. Hàm lƣợng protein bị giảm từ 12% xuống 11%, nguyên nhân có thể là do protein bị phân giải dƣới tác dụng của vi sinh vật hoặc bị thất thóat khi chúng ta tiến hành giã đông nguyên liệu.
Bảng 3.2 - Thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá
Nguyên liệu Hàm lƣợng, %
Protein Lipid Nƣớc Tro
Nguyên liệu tƣơi 12±1,0 16,36±1,3 70±2,0 1,64±0,2 Nguyên liệu đông lạnh 11±1,2 17,4±1,6 67±1,4 2,6±0,4
Điều đáng quan tâm khi phân tích đặc điểm công nghệ của nguyên liệu là hàm lƣợng lipid tƣơng đối cao (16-18%), đây sẽ là trở ngại về mặt công nghệ khi chúng ta tiến hành tách lƣợng lipid này ra khỏi dịch enzyme.
3.1.3 Kết quả nghiên cứu bảo quản nguyên liệu nội tạng cá phục vụ thu hồi chế phẩm enzyme protease phẩm enzyme protease
Nội tạng cá sử dụng để thu nhận chế phẩm enzyme protease đƣợc thu gom trong quá trình mổ và tách fi-lê. Nguyên liệu là hỗn hợp nội tạng của hai loài cá: cá nục sò (Decapterus maruadsi) và cá nục dài (Decapterus lajang Bleeker) – thức ăn chủ yếu của chúng là các loài động vật: chân chèo (Copepoda), có vỏ (Ostracoda), lƣỡng túc (Amphipoda) [Nguyễn Nhật Thi, 1991].
Nội tạng cá sau khi rửa sạch cần đƣợc bảo quản trong môi trƣờng lạnh (4 ÷ 50
C) hoặc ở điều kiện lạnh đông sâu (-18 ÷ -200C) phụ thuộc vào việc thu hồi chế phẩm enzyme protease.
49
50C đảm bảo không làm giảm hoạt độ enzyme protease nội tại trong nguyên liệu với thời gian bảo quản không đƣợc vƣợt quá 12 giờ.
Phƣơng pháp tối ƣu hơn là bảo quản nội tạng cá trong điều kiện lạnh đông sâu ở nhiệt độ -18 ÷ -200C. Để xác định thời gian tối ƣu để bảo quản nguyên liệu chúng tôi