Hiện nay chitosan đƣợc sử dụng rất phổ biến trong sản xuất thực phẩm. Có thể sử dụng để thu hút nƣớc và béo (quá trình nhũ hóa), kết hợp với thuốc nhuộm (quá trình đồng hóa), quá trình đông đặc. Chitosan cũng đƣợc chứng minh là có khả năng tạo dạng màng mỏng để sử dụng nhƣ là những lớp màng mỏng hoặc những lớp bao không độc hại (có thể ăn đƣợc). Màng bao Chitosan có thể cải thiện khả năng bảo quản các loại thực phẩm dễ bị thối rữa bằng cách giảm lƣợng không khí bên trong bao gói cũng nhƣ giảm quá trình thoát hơi nƣớc.
Có thể nhúng trực tiếp thực phẩm vào dung dịch chitosan pha sẵn rồi để khô, tạo thành một lớp màng mỏng tự nhiên trên bề mặt sản phẩm: trứng, thịt cá, rau quả, giá đỗ, bánh gạo, nhúng cải bắp trƣớc khi làm kim chi…
41
xích…
Hoặc cho chitosan trực tiếp vào sản phẩm dạng lỏng: xử lý nƣớc quả, làm trong giấm, bảo quản tàu hũ, đồng hóa sữa, kem và mayonaise, bảo quản mì…[12, 19, 24].
42
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu:
Nguyên liệu đƣợc sử dụng bao gồm:
a) Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc phân lập và giữ giống tại phòng thí nghiệm CNSH - Khoa Hoá - trƣờng Đại học Bách Khoa - Đại học Đà Nẵng;
b) Vỏ đầu tôm đƣợc thu nhận từ công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền trung: Công ty chế biến và xuất khẩu thủy sản Thọ Quang;
Phụ phẩm sau khi thu nhận từ nhà máy chế biến thủy sản đƣợc sấy cho khô ròn ở nhiệt độ 400C rồi nghiền nhỏ và bảo quản làm nguồn nguyên liệu thu nhận chitin, và sau đó từ chitin thu nhận chitosan.
Trong nghiên cứu này nguyên liệu vỏ tôm đƣợc thu nhận từ hai loại tôm phổ biến trong chế biến trên địa bàn TP Đà Nẵng hiện nay là tôm sú (tiger shrimp – Penaeus monodon Fabricius) và tôn thẻ chân trắng (White Shrimp - Penaeus vannamei). Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên hỗn hợp 2 loại đầu vỏ tôm này.
a b
Hình 2.1 – Sự khác nhau của một số nguyên liệu tôm, vỏ của chúng dùng để thu nhận chitin/chitosan
43
c) Nội tạng cá để thu nhận chế phẩm enzyme protease đƣợc thu gom từ công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền trung: Công ty chế biến và xuất khẩu thủy sản Thọ Quang. Nội tạng cá sau khi đƣợc thu nhận từ nhà máy về đƣợc rửa sạch, xử lý bằng nƣớc muối 5%, sau đó đƣợc bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ -220C phục vụ thu nhận chế phẩm enzyme protease.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị:
Hoá chất chính:
- Các hoá chất tinh khiết nhƣ : HCl đậm đặc, Foocmol 40%, cồn tuyệt đối, KOH 0,01N, H2SO4…
- Các chỉ thị màu : thimolphtalein, phenolphtalein… - Pepton, casein, cao thịt, cao nấm…
- Và các hóa chất phục vụ các thí nghiệm phân tích khác.
Thiết bị:
- Tủ ổn nhiệt, máy lắc, thiết bị tiệt trùng, tủ lạnh đông, tủ cấy vô trùng. - Thiết bị li tâm
- Thiết bị cô đặc chân không - Thiết bị phân tích đạm Kjeldahl.
- Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm CNSH khác.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Định lượng nước
Vỏ tôm đƣợc sấy ở 1200C trong 3 giờ, đến khối lƣợng không đổi. Để nguội, sau đó cân xác định lƣợng nƣớc theo công thức:
2.2.2 Định lượng muối Calci carbonat
Muối calci carbonat trong vỏ tôm đƣợc định lƣợng bằng cách ngâm vỏ tôm đã đƣợc xay nhỏ và sấy khô trong dung dịch HCl 10% trong 6 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau đó lọc, lấy nƣớc cái dùng acid H2SO4 30% kết tủa Ca2+ trong dung dịch. Từ trọng lƣợng CaSO4 kết tủa và sấy khô suy ra hàm lƣợng calci carbonat
44
2.2.3 Định lượng chitin
Sauk hi loại bỏ calci carbonat và protein, chitin đƣợc đun nóng với dung dịch K2CO3 đậm đặc ở 1600C chitin không tan. Lọc, rửa sạch, sấy ở 1000C, thu đƣợc chitin.
2.2.4 Phương pháp xác định độ deacetyl của chitosan
Đơn vị phần trăm độ deacety trong sản phẩm chitosan đƣợc xác định bằng mức độ deacetyl (đây là tỉ lệ của khối lƣợng glucosamine so với số monomer chung trong phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thƣờng từ 70-90%.
2.2.5 Một số phương pháp xác định khác:
-Hàm lƣợng lipid (%), protein (%), tro (%) và hàm lƣợng nƣớc (%) đƣợc xác định theo GOST 7636-85 (LB Nga)
-Hàm lƣợng khoáng đƣợc phân tích theo chuẩn của AOAC (1990) - Phƣơng pháp xác định N-formon theo Sorensen
- Hoạt độ enzyme, và chế phẩm enzyme protease xác định theo phƣơng pháp Anson cải tiến
- Phƣơng pháp xác định QMAFAM (CFU/g) theo GOST 10444.15 – 94 (LB Nga) - Độ khử khoáng trong vỏ tôm đƣợc xác định theo công thức KK=[(mK1- mK2)/mK1]x100%; mk1, mk2-hàm lƣợng chất khoáng ban đầu và sau khi khử khoáng trong vỏ tôm .
-Độ khử protein trong vỏ tôm đƣợc xác định theo công thức KK=[(mP1- mP2)/mP1]x100%; mP1, mP2-hàm lƣợng protein ban đầu và sau khi khử protein trong vỏ tôm.
-Độ deacety trong sản phẩm chitosan đƣợc xác định theo tỉ lệ của khối lƣợng glucosamine so với số monomer chung trong phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thƣờng từ 70-90%; Độ nhớt của chitosan đƣợc xác định trên nhớt kế Roto Brookfield
45
Tổng quan các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về chitin/chitosan
Tính chất vật lí và hóa học của chitin/chitosan Các phƣơng pháp thu nhận chitin: hóa học, sinh học Phƣơng pháp thu nhận chitosan Các lĩnh vực ứng dụng chitin/chitosa n Ứng dụng vi khuẩn B. subtilis trong sản xuất chitin
Xây dựng các mô hình thí nghiệm giải quyết các vấn đề cần nghiên cứu của đề tài
Nghiên cứu thành phần
hóa học của vỏ đầu tôm học và hoạt độ enzyme của nội Nghiên cứu thành phần hóa tạng cá
Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy và khả năng sinh protease của
B.subtilis
Tách chiết enzyme protease từ nội tạng cá
Khử màu của vỏ đầu tôm
Khử khoáng của vỏ đầu tôm
Nghiên cứu khử protein của đầu vỏ tôm
Khử protein bằng chế phẩm enzyme protease, tách chiết từ nội tạng cá Khử protein bằng chế phẩm enzyme protease Khử khoáng lần 2 Chitin Chitosan Đánh giá chất lƣợng chitin Đánh giá chất lƣợng chitosan
46
Hình 2.2 – Sơ đồ mô hình các bƣớc thực hiện trong nghiên cứu 2.4 Xử lý số liệu
Số liệu trong nghiên cứu này là trung bình của ba lần phân tích. Kết quả đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab Professional v16.1.0.0. . Giá trị của p < 0,05 đƣợc xem là có ý nghĩa về mặt thống kê
47
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của vỏ tôm, nguyên liệu nội tạng cá và phƣơng pháp bảo quản nguyên liệu nội tạng cá. nội tạng cá và phƣơng pháp bảo quản nguyên liệu nội tạng cá.
3.1.1 Thành phần hóa học của một số nguyên liệu chứa chitin, phổ biến ở thành phố Đà Nẵng thành phố Đà Nẵng
Phân tích thành phần hóa học của vỏ tôm sau khi đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 400
C nhận thấy hàm lƣợng chitin tƣơng đối cao từ 33-35% tổng khối lƣợng vỏ tôm khô. Bên cạnh đó hàm lƣợng protein là 12-14%, điều này đòi hỏi cần có biện pháp phù hợp để loại bỏ lƣợng protein tƣơng đối lớn trong nguyên liệu này. Đồng thời hàm lƣợng chất khoáng rất cao 37-40% tổng khối lƣợng nguyên liệu, nên cần sử dụng phƣơng pháp loại khoáng ở độ pH phù hợp để đạt hiệu suất tốt nhất trong thu nhận chitin/chitosan.
Bảng 3.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm
STT Loại
nguyên liệu Thành phần hóa học, %
Protein Lipid Chất khoáng Chitin Nƣớc 1 Vỏ tôm sú 14±1,3 1,5±0,2 37±1,9 33±1,2 14,5±1,9 2 Vỏ tôm thẻ chân trắng 12±1,2 0,4±0,1 40±2,1 35±2,5 12,6±1,7 3 Hỗn hợp vỏ tôm sú và vỏ tôm thẻ chân trắng 13±1,6 0,95±0,5 38,5±2,4 39,5±1,6 8,05±1,5
Ngoài ra, hàm lƣợng lipid trong hỗn hợp vỏ tôm sú và vỏ tôm thẻ chân trắng gần 1%, các lipid này chứa chất màu đặc trƣng của vỏ tôm là carotenoid, carotenoid có thể gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng chitin về tính cảm quan, nhƣng chúng ta có thể tận dụng chất màu này để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nên cần có biện pháp phù hợp để thu hồi nguồn chất mà tự nhiên quý giá này.
48
3.1.2 Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá
Các kết quả thí nghiệm xác định thành phần hóa học của nguyên liệu dùng để tách chiết chế phẩm enzyme protease đƣợc trình bày trong bảng 3.2.
Từ bảng 3.2 ta thấy sau quá trình bảo quản lạnh đông hàm lƣợng nƣớc trong nguyên liệu giảm xuống. Nguyên nhân là do khả năng giữ nƣớc của nguyên liệu giảm. Hàm lƣợng protein bị giảm từ 12% xuống 11%, nguyên nhân có thể là do protein bị phân giải dƣới tác dụng của vi sinh vật hoặc bị thất thóat khi chúng ta tiến hành giã đông nguyên liệu.
Bảng 3.2 - Thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá
Nguyên liệu Hàm lƣợng, %
Protein Lipid Nƣớc Tro
Nguyên liệu tƣơi 12±1,0 16,36±1,3 70±2,0 1,64±0,2 Nguyên liệu đông lạnh 11±1,2 17,4±1,6 67±1,4 2,6±0,4
Điều đáng quan tâm khi phân tích đặc điểm công nghệ của nguyên liệu là hàm lƣợng lipid tƣơng đối cao (16-18%), đây sẽ là trở ngại về mặt công nghệ khi chúng ta tiến hành tách lƣợng lipid này ra khỏi dịch enzyme.
3.1.3 Kết quả nghiên cứu bảo quản nguyên liệu nội tạng cá phục vụ thu hồi chế phẩm enzyme protease phẩm enzyme protease
Nội tạng cá sử dụng để thu nhận chế phẩm enzyme protease đƣợc thu gom trong quá trình mổ và tách fi-lê. Nguyên liệu là hỗn hợp nội tạng của hai loài cá: cá nục sò (Decapterus maruadsi) và cá nục dài (Decapterus lajang Bleeker) – thức ăn chủ yếu của chúng là các loài động vật: chân chèo (Copepoda), có vỏ (Ostracoda), lƣỡng túc (Amphipoda) [Nguyễn Nhật Thi, 1991].
Nội tạng cá sau khi rửa sạch cần đƣợc bảo quản trong môi trƣờng lạnh (4 ÷ 50
C) hoặc ở điều kiện lạnh đông sâu (-18 ÷ -200C) phụ thuộc vào việc thu hồi chế phẩm enzyme protease.
49
50C đảm bảo không làm giảm hoạt độ enzyme protease nội tại trong nguyên liệu với thời gian bảo quản không đƣợc vƣợt quá 12 giờ.
Phƣơng pháp tối ƣu hơn là bảo quản nội tạng cá trong điều kiện lạnh đông sâu ở nhiệt độ -18 ÷ -200C. Để xác định thời gian tối ƣu để bảo quản nguyên liệu chúng tôi dựa trên quan điểm xác định lƣợng ni-tơ formol (Nf) bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol Sorensen và lƣợng ni-tơ tổng số (Nt) của Kjeldahl. Nhiều tài liệu đã chứng minh rằng nguyên liệu thủy sản chƣa hƣ hỏng khi tỉ lệ Nf/Nt thấp hơn 10% [Chernogorsev, 1960].
Nhƣ vậy từ đồ thị hình 3.1 chúng tôi đã xác định đƣợc thời gian bảo quản tối ƣu nội tạng cá ở nhiệt độ -18 ÷ -200C là 2 tháng, sau khi thu gom từ nhà máy.
Hình 3.1 - Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên chỉ tiêu chất lƣợng nội tạng
cá bảo quản ở nhiệt độ -18 ÷ -200
C
3.2 Chọn phƣơng pháp thu hồi chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá, khảo sát hoạt độ của chế phẩm enzyme protease thu đƣợc. khảo sát hoạt độ của chế phẩm enzyme protease thu đƣợc.
50
Hình 3.2 - Biểu đồ sự phụ thuộc hoạt độ các nhóm enzyme protease trong các vùng pH khác nhau
Các kết quả xác định hoạt độ enzyme trong nguyên liệu nội tạng cá tƣơi và đông lạnh sau thời gian bảo quản 1 tháng ở các độ pH = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 đƣợc biểu diễn trên hai đƣờng cong ở hình 3.2
Theo hình 3.2 ta thấy có 2 vùng pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme trong nội tạng cá là vùng pH kiềm (7 ÷ 8) và vùng pH acid (2 ÷ 2,5) . Tuy nhiên theo một số tài liệu tham khảo thì vùng pH kiềm không thích hợp để tách chiết enzyme protease vì dịch enzyme rất dễ bị nhiễm khuẩn, còn vùng pH acid thích hợp hơn cho việc tách chiết enzyme protease với hoạt độ tƣơng đối cao (2,5 Kat), mặt khác ở pH này enzyme protease khó nhiễm khuẩn hơn. Vì vậy trong các phần tiếp theo sẽ tiến hành tách chiết enzyme protease trong điều kiện pH acid.
Dựa vào những tính chất của enzyme cần thu nhận và các chất khác trong thành phần nội tạng cá chúng tôi thực hiện theo quy trình ở hình 3.3 và thu đƣợc 2 chế phẩm enzyme protease ở dạng lỏng từ nguyên liệu tƣơi và nguyên liệu đông lạnh, chế phẩm enzyme protease thu đƣợc đƣợc bảo quản ở 0 ÷ 50
51
Hình 3.3 - Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme protease từ nội tạng cá
Bảng 3.3 - Một số tính chất của chế phẩm protease thu nhận từ nguyên liệu tƣơi và nguyên liệu đông lạnh
Chỉ tiêu đánh giá Chế phẩm enzyme protease
từ nguyên liệu tƣơi từ nguyên liệu đông lạnh
Độ đồng nhất của dung dịch
Độ đồng nhất cao Độ đồng nhất cao
Màu sắc Màu vàng nhạt Màu vàng tới nâu
pH 2 ÷ 2,5 2 ÷ 2,5
Mùi vị Mùi đặc trƣng của các sản
phẩm từ cá
Mùi đặc trƣng của các sản phẩm từ cá
Khối lƣợng riêng, g/ml 1,1 1,15
Hoạt độ, kat 2,31 2,1
Một số đặc điểm của chế phẩm enzyme protese thu nhận từ nguyên liệu nội tạng cá tƣơi và đông lạnh đƣợc trình bày trong bảng 3.3
52
Theo bảng 3.3 ta thấy tính chất của chế phẩm enzyme thu đƣợc từ nguồn nguyên liệu tƣơi và nguồn nguyên liệu đông lạnh không có có sự khác biệt lớn. Ở chế phẩm enzyme thu đƣợc từ nguyên liệu đông lạnh có màu sẫm hơn, nguyên nhân của sự khác biệt này là có thể do quá trình bảo quản (1 tháng) một phần protein trong nguyên liệu bị biến tính, và một số phản ứng oxy hóa lipid.
Trong hình 3.4 là hình ảnh chế phẩm enzyme thu đƣợc ở dạng lỏng
Hình 3.4 - Chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá đông lạnh
Từ kết quả xác định hoạt độ chế phẩm enzyme protease theo phƣơng pháp Anson cải tiến trong bảng 3.3 ta thấy rằng hoạt độ chế phẩm enzyme protease giảm so với trong nguyên liệu tƣơi trong vùng pH acid tƣơng ứng (2,5). Nguyên nhân của sự giảm này là do trong quá trình tách chiết một phần protein bị biến tính và hỏng.
Chế phẩm enzyme protease đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 4-50C để phục vụ nghiên cứu quá trình loại bỏ protein bằng phản ứng thủy phân trong vỏ tôm ở các nghiên cứu tiếp theo. Việc thu gom và tách chiết chế phẩm protease từ nội tạng cá tƣơi có nhiều lợi thế, nhƣng trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chỉ dùng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá đƣợc bảo quản đông lạnh.
3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản lên hoạt tính của chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá
53
Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá đông lạnh đƣợc trình bày trên hình 3.5.
Hình 3.5 – Sự phụ thuộc của hoạt độ của chế phẩm enzyme protease vào nhiệt độ môi trƣờng
Hình 3.6 - Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên hoạt độ enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá
54
protease rõ ràng rằng, chế phẩm enzyme protease có hoạt lực cao nhất ở vùng nhiệt độ 40-450C
Để xác định thời gian tối ƣu bảo quản chế phẩm enzyme protease ở nhiệt độ 4- 50C, chúng tôi đã tiến hành xác định hoạt độ sau mỗi 15 ngày bảo quản. Kết quả xác định đƣờng thể hiện trên hình 3.6
Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng có thể bảo quản chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá đến 6 tháng mà không ảnh hƣởng đến chất lƣợng. Điều này đƣợc lí giải bởi vai trò của HCl nhƣ là một chất bảo quản, bên cạnh đó ở pH thấp cũng hạn chế tối đa ảnh hƣởng của các vi khuẩn gây hỏng chế phẩm enzyme.
3.4 Các kết quả nghiên cứu sản xuất chitin/chitosan ứng dụng enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá