ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ VÀ ĐỘ DI ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG BẰNG BUỒNG ĐẾM MAKLER,BUỒNG ĐẾM NEUBAUER VÀ MÁY PHÂN TÍCH TINH TRÙNG TỰ ĐỘNG SQA - IIB

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI HÀ THỊ BÍCH NGỌC ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ VÀ ĐỘ DI ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG BẰNG BUỒNG ĐẾM MAKLER, BUỒNG ĐẾM NEUBAUER VÀ MÁY PHÂN TÍCH TINH TRÙNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HÀ THỊ BÍCH NGỌC

ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ VÀ ĐỘ DI ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG BẰNG BUỒNG ĐẾM MAKLER, BUỒNG ĐẾM NEUBAUER VÀ MÁY PHÂN TÍCH TINH TRÙNG TỰ ĐỘNG SQA - IIB

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HÀ THỊ BÍCH NGỌC

ĐÁNH GIÁ MẬT ĐỘ VÀ ĐỘ DI ĐỘNG CỦA TINH TRÙNG BẰNG BUỒNG ĐẾM MAKLER, BUỒNG ĐẾM NEUBAUER VÀ MÁY PHÂN TÍCH TINH TRÙNG TỰ ĐỘNG SQA - IIB

Chuyên nghành : Mô học - Phôi thai học

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp và gia đình.

Trước tiên tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Bình, Chủ nhiệm Bộ môn Mô Phôi - Trường Đại học Y

Hà Nội, người thầy đã định hướng, tận tình dìu dắt, hướng dẫn, bổ sung cho tôi nhiều kiến thức chuyên ngành và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi vô cùng biết ơn TS Nguyễn Khang Sơn – Phó trưởng Bộ môn Mô Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã giúp cho tôi nhiều kiến thức

và ý kiến quý báu để cho tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin chân trọng cảm ơn các Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ trong hội đồng khoa học thông qua đề cương và bảo vệ luận văn, đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị trong Bộ môn

Mô Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới cha, mẹ, chồng con, anh chị

em trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội ngày 20 tháng 11 năm 2011

Hà Thị Bích Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Đánh giá mật độ và độ động của tinh

trùng bằng buồng đếm Makler, buồng đếm Neubauer và máy phân tích tinh trùng tự động SQA-IIB” là đề tài do bản thân tôi thực hiện.

Các số liệu trong bản luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa từng đượccông bố ở bất kỳ ở một công trình nghiên cứu nào khác

Hà Thị Bích Ngọc

CHỮ VIẾT TẮT

FSH : Follicle Stimulating Hormon

GnRH : Gonadotropin Releasing Hormon

SQA-IIB : Sperm Quality Analysis – Institue for Independent Business /

Phân tích chất lượng tinh trùng - Viện nghiên cứu kinh doanhđộc lập

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tinh trùng lần đầu tiên được mô tả bởi Leeuwenhoek và Hamm vào đầunăm 1677, nhưng chưa hiểu được vai trò của TT trong quá trình thụ tinh Chođến năm 1830, Prevost và Dumas đã chứng minh tinh trùng rất cần thiết cho

sự thụ tinh [Trích dẫn theo 24] Trước những năm 1950, vẫn chưa xác địnhđược mối quan hệ giữa chất lượng tinh trùng với khả năng có thai [2 5][60]

Makleod (1942), Makleod và Gold (1953), Eliasson (1971) và Helliga(1949, 1976) đã có những phân tích tinh dịch trên cơ sở khoa học và các k ỹthuật của họ vẫn được coi là tài liệu tham khảo cho nhiều p hương pháp tiêntiến sau này [Trích dẫn theo 34]

Phân tích tinh dịch bao gồm một tập hợp các số đo, mô tả (mật độ, độ

di động, hình thái) của tinh trùng và các thông số tinh dịch [36]

Aitken R.J và cộng sự (1991) đã cho thấy: Có thể đánh giá được chấtlượng tinh dịch bằng cách đếm số lượng về mật độ, di động và hình thái củatinh trùng Đồng thời tác giả nghiên cứu thấy 75% đàn ông có khả năng sinhsản khi có số lượng tinh trùng > 20 triệu /ml tinh dịch [26]

Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, việc khám bệnh đãchẩn đoán tìm ra nguyên nhân vô sinh cho các cặp vợ chồng ngày càng đượcquan tâm nhiều hơn Cùng với sự phát triển của nền kinh tế-xã hội, đời sốngcủa con người càng được nâng cao thì tỉ lệ vô sinh đang ngày càng gia tăng [7][33]

Một thực tế, ở Việt Nam vẫn thường nghĩ nguyên nhân vô sinh là dongười vợ, nên việc chẩn đoán vô sinh nữ đã được nghiên cứu và áp dụng rấtnhiều Trong khi đó, chẩn đoán vô sinh nam mới được quan tâm trong nhữngnăm gần đây [13]

6

Nguyên nhân vô sinh nam do rất nhiều nguyên nhân và yêu cầu phảiđánh giá toàn diện để có được chẩn đoán chính xác Việc phân tích tinh dịch

đồ, là một xét nghiệm rất cần thiết không thể thiếu khi thăm khám một cặp vợchồng vô sinh Đồng thời phân tích chính xác các thông số của tinh dịch sẽgóp phần quan trọng cho việc đánh giá mức độ vô sinh nam để đưa ra cácphương pháp điều trị hợp lý nhất cho bệnh nhân [32] [42]

Hiện nay, tại Việt Nam, ở các trung tâm xét nghiệm có phương pháplàm tinh dịch đồ khác nhau Tuy nhiên, để so sánh về chất lượng và độ chínhxác của các phương pháp còn ít nghiên cứu Trên thực tế, đánh giá được kếtquả chính xác của tinh dịch đồ có ảnh hưởng không nhỏ đến việc chẩn đoán

và theo dõi điều trị trong vô sinh, mặt khác tránh được lãng phí cho người

bệnh và xã hội Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh

giá mật độ và độ di động của tinh trùng bằng buồng đếm Makler, buồng đếm Neubauer và máy phân tích tinh trùng tự động SQA – IIB”.

Mục tiêu của đề tài:

1- So sánh kết quả đánh giá mật độ và độ di độngcủa tinh trùng ở các mẫu tinh dịch trong giới hạn bình thường bằng buồng đếm Makler, buồng đếm Neubauer và máy phân tích tinh trùng tự động SQA- IIB.

2- Đánh giá ưu, nhược điểm của 3 phương pháp này.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình vô sinh

1.1.1 Khái niệm vô sinh và tỉ lệ vô sinh.

Một cặp vợ chồng có sức khỏe bình thường, sau 12 tháng chung sốngsinh hoạt tình dục bình thường mà không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thainào nhưng người vợ không có thai thì được xếp vào nhóm vô sinh [13]

Trên phạm vi toàn thế giới tỉ lệ các cặp vợ chồng mắc vô sinh rất khácnhau, ước tính khoảng 3-5% [44] Theo tài liệu của WHO tỉ lệ mắc vô sinhvào khoảng 8% trong các cặp vợ chồng [60]

Ở Việt Nam theo số liệu điều tra dân số cho thấy tỉ lệ vô sinh vào năm

1980 là 7-10% thì đến năm 1982 tỉ lệ này đã tăng lên khoảng 13 -15% tổng sốcác cặp vợ chồng đang ở độ tuổi sinh đẻ [13]

Tại hội thảo nam học do Tổ chức Y tế thế giới (WHO) tiến hàn h tạiThành phố Hồ Chí Minh (1995), tác giả Anek Aribarg đã công bố tỉ lệ vô sinh

ở Thái Lan chiếm 12% trong số các cặp vợ chồng đang độ tuổi sinh đẻ [29].Theo Irvin DS (1998), tần xuất vô sinh nam được báo cáo bởi nhiềunghiên cứu lớn thay đổi từ < 25% đến trên 60%, số lượng tinh trùng của namgiới đã giảm còn phân nửa so với 50 năm trước [46]

1.1.2 Nguyên nhân vô sinh và tỉ lệ

Có 2 loại vô sinh: Vô sinh nguyên phát (VSNP) là chưa có thai lần nào,

vô sinh thứ phát (VSTP) là trong tiền sử đã từng có thai ít nhất một lần V ôsinh nam là nguyên nhân do người chồng, vô sinh nữ là khi nguyên nhân dongười vợ Có thể nguyên nhân VS là do cả hai vợ chồng VS không rõ nguyên

nhân là trường hợp khám và làm hết các xét nghiệm thăm dò mà không pháthiện ra được nguyên nhân nào có thể giải thích được [12].

Theo tác giả Gerd Ludwig (1990), các nghiên cứu trước cho thấy tỉ

lệ nguyên nhân vô sinh do nam và nữ rất khác nhau, nhưng tác giả lại chorằng nguyên nhân VS do người vợ và VS do người chồng là tương đương nhau[42]

Theo nghiên cứu của John (1993) và Hull (1995) đã đưa ra kết quảnghiên cứu : 10-30% các cặp vợ chồng VS là do ngu yên nhân phốihợp[45] [43]

Theo Barker (1993), ở các cặp vợ chồng vô sinh: 1/3 nguyên nhân

do nam, 1/3 nguyên nhân do nữ và 1/3 còn lại do cả hai [Trích dẫn theo 51]

Ở Anh trong số các cặp vợ chồng vô sinh, theo tác giả Khan Khalid và

CS (2005) cho thấy nguyên nhân VS nam là 25%, VS nữ là 50%, còn 2 5%chưa tìm được nguyên nhân [50]

Ở Việt Nam qua điều tra cho thấy, nguyên nhân VS do vợ và chồng làtương đương nhau khoảng 40%, nguyên nhân phối hợp là 10%, không rõnguyên nhân là 10% [15] Theo nghiên cứu của tác giả Vũ Văn Chúc ở Bệnhviện bà mẹ và trẻ sơ sinh trên 1000 trường hợp VS, thấy VS do nam chiếm38,3%, do nữ 39,1%, do cả hai là 21,5% [3]

Theo tác giả Ngô Gia Hy (1994), trong số các cặp VS thì nguyên nhân

do chồng chiếm 40%, do vợ là 50%, do cả hai vợ chồng là 10% [8] NguyễnBửu Triều đưa ra tỉ lệ VS do chồng từ 30 -40% trong các cặp VS [18] Tác giảPhan Văn Quý (1997) lại cho rằng tỉ lệ này lên tới 46,5% [16]

Nghiên cứu của Phan Hoài Trung (1999) cho thấy VSNP là 80,18%,VSTP là 19,82% [20]

Theo tác giả Nguyễn Xuân Bái (2002) khi nghiên cứu 1000 cặp vợchồng VS, thấy có 62% VSNP, 38% VSTP [2].

Nghiên cứu của tác giả Lasen (2000), tiến hành ở 10 trong số 28 quốcgia ở Châu Phi nhận thấy tỉ lệ VSNP khoảng hơn 3% trong số các cặp vợchồng ở độ tuổi sinh đẻ, còn tỉ lệ VSTP lại cao hơn nhiều [54]

Các nguyên nhân chính gây VS ở nam là do không có tinh trùng, thiểutinh, tinh trùng không di động, tinh trùng bất thường

Như vậy qua nghiên cứu cho thấy tỉ lệ VS nói chung và VS nam nóiriêng ngày càng tăng cao Do đó việc chẩn đoán VS nam phải sớm và chínhxác để làm tỉ lệ VS xuống mức thấp nhất

1.2 Nghiên cứu về tính chất tinh dịch và quá trình sinh tinh trùng.

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu tinh trùng.

Đầu năm 1677 người ta đã bắt đầu quan sát tinh trùng ở người bằngcách sử dụng kính hiển vi điện tử cải tiến, Leeuwenhoek và Hamm là nhữngngười đầu tiên quan sát tinh trùng ở người [24] [59]

Từ đầu thế kỷ 19 người ta đã biết rằng tinh trùng rất cần thiết cho sựthụ tinh, kể từ đó một loạt các xét nghiệm về tinh dịch đã được phát triển vớ

i hy vọng làm rõ có hay không một người đàn ông có thể thụ thai với đốitác của mình [26]

1.2.2 Tính chất tinh dịch và quá trình sinh tinh trùng.

Tinh dịch là một hỗn dịch gồm tinh trùng và dịch tiết của các tuyến phụthuộc đường dẫn tinh Trong đó tinh trùng chiếmkhoảng 5%, dịch túi tinhchiếm 46-80%, dịch tuyến tiền liệt khoảng 13-33%, dịch mào tinh 5%, dịchtuyến hành niệu đạo và tuyến niệu đạo chiếm 2-5% [7] [19] [21]

Quá trình sinh tinh trùng phụ thuộc đầu tiên vào sự phát triển của tinhhoàn trong bào thai, bắt đầu vào khoảng tuần từ 4-6 tuần tuổi thai Vào giaiđoạn này, các tế bào mầm sinh dục nguyên thủy ở gờ sinh dục bắt đầu tăngsinh Một số tế bào sinh dục nguyên thủy sẽ thoái hoá, số còn lại biệt hoá

thành tiền tinh nguyên bào và ngưng ở giai đoạn này Đến khoảng từ lúc sinhđến 6 tháng tuổi, các tế bào này bắt đầu biệt hoá thành tinh nguyên bào vàtăng sinh Sau đó, đến tuổi dậy thì các tinh nguyên bào này bắt đầu quá trìnhgiảm phân để tạo ra các tinh bào.

Tinh trùng được sinh ra tại các ống sinh tinh trong tinh hoàn Sau đó,tinh trùng đi vào mào tinh để trải qua giai đoạn trưởng thành cuối cùng trướckhi xuất tinh Nếu không có hiện tượng phóng tinh, tinh trùng sẽ chết, thoáihoá và bị hấp thu bởi biểu mô của mào tinh

● Ống sinh tinh

Ống sinh tinh là cấu trúc giải phẫu quan trọng, nơi diễn ra quá trình hìnhthành tinh trùng Bao gồm các thành phần: màng đáy, biểu mô sinh tinh, các

tế bào sertoli

Hình 1.2 Cấu tạo ống sinh tinh [6]

Tinh trùng được tạo ra từ tế bào dòng tinh nằm trong các ống sinh tinhcủa tinh hoàn và được biệt hóa hoàn toàn trong đường dẫn tinh

Quá trình sinh tinh diễn ra qua các giai đoạn : gián phân, giảm phân vàthay đổi hình dạng, quá trình này kéo dài khoảng 70 ± 4 ngày Số lượng TTđược tạo ra mỗi ngày khoảng 150 triệu [11] [18]

Khi mới ra khỏi ống sinh tinh, tinh trùng chưa có khả năng tự di chuyển

và thụ tinh Trong khi được vận chuyển trong những đoạn đầu của đường dẫntinh, tinh trùng có những biến đổi về hình thái, hoá học để tự di chuyển và cókhả năng thụ tinh, quá trình này diễn ra từ 12 -21 ngày [13] [19]

1.2.3 Các rối loạn trong quá trình tạo tinh trùng và bài tiết tinh trùng.

Nhiều tác giả đã nghiên cứu thấy rằng, khả năng sinh sản của nam phụ

thuộc vào số lượng và chất lượng của tinh trùng trong mỗi lần xuất tinh giớ i[8] [18].

Rối loạn quá trình tạo tinh trùng

Quá trình tạo tinh trùng có thể bị rối loạn do nguyên nhân ngoài tinhhoàn và tại tinh hoàn: Rối loạn chức năng vùng dưới đồi - tuyến yên, thiếu hụtthụ thể androgen, rối loạn các tuyến nội tiết Các bệnh lý tại tinh hoàn nhưtinh hoàn ẩn, tinh hoàn lạc chỗ…

● Rối loạn bài tiết tinh trùng: có thể do các dị tật bẩm sinh như: teo ốngdẫn tinh hai bên, teo chỗ nối đầu và thân mào tinh hoàn, hoặc do các d ị tậtmắc phải khi phẫu thuật (mổ thoát vị )…

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy các yếu tố bên ngoài cũng ảnhhưởng nhiều đến chất lượng tinh trùng Trịnh văn Bảo (1993) khi nghiên cứutinh dịch của 362 cựu chiến binh Việt Nam thấy mật độ tinh trùng giảm, tỉ lệtinh trùng dị dạng tăng ở nhóm đã từng tiếp xúc với chất độc da cam trongchiến tranh hoá học ở Việt Nam [1]

Theo tác giả Hồ Mạnh Tường (2000) các yếu tố gây giảm chất lượng và

số lượng tinh trùng ở nam giới như uống rượu, bia, hút thuốc lá, bệnh lâynhiễm qua đường tình dục; dùng kháng sinh không đúng chỉ định; thói quentrong sinh hoạt làm tăng nhiệt độ ở tinh hoàn dẫn đến hậu quả làm giảm sảnxuất tinh trùng như mặc quần chật, lái xe, tắm bồn nước nóng, sóng điện thoại

di động [21] Theo Lê Minh Chính (2001) trong vô sinh nam, nguyên nhân doviêm nhiễm sinh dục là 29,36%, do liên quan đến hoá chất sử dụng nôngnghiệp là 16,5% [5]

Trên thế giới tác giả Taresenko và CS đã có báo cáo về hiện tượng íttinh trùng và giảm sinh lực của nam giới làm việc trong nhà máy sản xuấtacid boric và trong cộng đồng nơi mà có hàm lượng cao của Bo trong nước

giếng phun Nghiên cứu của Parizek năm 1964 cho thấy Cadimi có ảnh hưởngtới tất cả các loại tế bào sinh tinh, trừ tinh trùng trưởng thành Một báo cáokhác cho thấy có 76 trong 133 công nhân sản xuất thuốc trừ sâu có hiện tượng

ít tinh trùng [Trích dẫn theo 9]

Theo tác giả Dhaliwal L.K và CS (2000), sau khi nghiên cứu 400 cặp

vợ chồng vô sinh, các tác giả cho rằng tuổi của người chồng liên quan đến tỉ

lệ mang thai Các bất thường đường niệu, sinh dục có mối tương quan với mật

độ TT thấp, bất thuờng về di động, hình thái [39]

Còn giáo sư Wang Yifei (1999), cho rằng ô nhiễm môi trường trongquá trình công nghiệp hoá và đô thị hoá cũng là nguyên nhân làm suy giảmmật độ tinh trùng Những cặp vợ chồng bị thiếu cân hay béo phì, ở nữ gây rốiloạn kinh nguyệt còn ở nam ảnh hưởng số lượng, chất lượng tinh dịch [68]

1.3 Những nghiên cứu về mật độ và độ di động của tinh trùng ở trên thế giới và ở Việt Nam.

1.3.1 Ở Việt Nam.

Mặc dù lĩnh vực hỗ trợ sinh sản mới đặc biệt phát triển ở Việt Namtrong vòng hơn mười năm nay, nhưng những nghiên cứu vô sinh nam cũng đãđược một số tác giả quan tâm tới từ rất lâu

Tác giả Trần Ngọc Can (1972), đã tiến hành nghiên cứu 30 nam giớ i

đã có con và hầu hết vợ đang mang thai, kết quả cho thấy : mật độ TT thấpnhất là 48 triệu/ml, tỉ lệ TT di động thấp nhất là 40% và di động khỏe thấpnhất là 30% [4]

Theo tác giả Nguyễn Khắc Liêu (1999), trong số vô sinh thứ phát thì vôsinh nam không có tinh trùng chiếm 7,1% [12]

Trần Xuân Dung (2000), qua phân tích 501 bệnh án của các cặp vợchồng vô sinh thấy có > 50% các trường hợp VS do giảm số lượng TT và khảnăng hoạt động của TT [6].

Nghiên cứu của Trần Đức Phấn và CS (2001) trên 420 mẫu tinh dịchngười chồng của các cặp VS thấy có: 56% chất lượng tinh dịch dịch dưới mứcbình thường; trong đó nguyên nhân do TT di động kém là 51,9%, do số lượng

TT ít là 16,43%, do không có TT trong tinh dịch là 10,24% [14]

Nguyễn Xuân Bái (2001), nghiên cứu 1000 cặp vợ chồng VS nhậnthấy, chỉ có 40% số cặp vợ chồng có tinh dịch đồ bình thường, còn 60% cótinh dịch đồ bất thường, và trong số tinh dịch bất thường thì bất thường vềkhả năng di động TT chiếm tỉ lệ cao nhất: 28,7%; tiếp đến là mật độ TT :25,4% Đồng thời tác giả cũng chỉ ra, những người chồng không có TT trongtinh dịch, hoặc TT ít, yếu và dị dạng ở những cặp VSNP chiếm tỉ lệ caohơn nhiều so với những cặp VSTP (p< 0,001 và p< 0,05); khả năng của TT

di động kém gặp nhiều hơn ở những mẫu có tỉ lệ hình thái bất thường cao(p < 0,001), và có mật độ TT thấp ( p< 0,001); tỉ lệ TT có hình thái bất thườngcao thường gặp ở những mẫu có mật độ TT ít ( p <0,001) [2]

Nguyễn Xuân Quý và CS (2004), khảo sát đặc điểm của 396 cặp vợchồng đến điều trị tại khoa hiếm muộn Bệnh viện phụ sản Từ Dũ, kết quả:77,3% có bất thường tinh dịch đồ, trong đó vô tinh chiếm tỉ lệ 10,1%, thiểutinh là 27,3%, tỉ lệ tinh dịch đồ có TT di động kém là 71,9% [17]

1.3.2 Trên thế giới.

Trên thế giới cũng có rất nhiều các nghiên cứu về đặc điểm của tinh dịch.Tác giả Amaler R.D và CS sau khi nghiên cứu đã kết luận, nhữngtrường hợp có mật độ TT cao > 650triệu/ ml thì khả năng di động của TT kémmặc dù TT có hình thái bình thường [25]

Lee Hy (1970) phân tích tinh dịch trên 840 trường hợp, kết quả 51%không có TT, 34% TT ít; Abmeds (1974) phân tích tinh dịch cho 326 ngườikết quả 14,5% số lượng TT giảm Tại khoa Phụ sản Trường Đại học Charlesnước cộng hoà Czech, Rezacova và CS (1999) đã tiến hành xét nghiệm tinhdịch ở101 người chồng ở các cặp vô sinh, kết quả c ó 44% số cặp có tinh dịch

đồ bất thường Một công trình nghiên cứu hồi cứu trên một quần thể lớn,những cặp VS được thực hiện tại bệnh viện Trường Đại học Count y ở Mỹ chokết quả: có 52% số mẫu tinh dịch có ít nhất một thông số bất thường ( mật độ,

di động, hình thái ); trong đó 51% số mẫu bất thường về tỉ lệ TT di động ;18% số mẫu bất thường về mật độ TT, 14% số mẫu bất thường về hình thái và4% không có TT trong tinh dịch [trích dẫn theo 27]

Tại Venezuela từ 1981-1995, một nghiên cứu hồi cứu trên 2313 namgiới của những cặp VS cho thấy: Có 9,1% số nam giới không có TT; 18,8% bịthiểu tinh; 63,1% có mật độ TT khoảng 20-200 triệu/ml và 9% có mật độ TT

> 200 triệu/ml [38]

Guzick D.S và CS (2001), khi so sánh 765 cặp vợ chồng vô sinh và

696 cặp vợ chồng không vô sinh, nhận thấy: Đối với các cặp VS; mật độ tinhtrùng < 13,5 triệu/ml, độ di động (a+b) < 32% Đối với các cặp vợ chồng bìnhthường, mật độ TT > 48 triệu/ml, độ di động > 63% [Trích dẫn theo 23]

Theo tác giả Cooper và CS (2010), lấy mẫu tinh dịch của 4500 ngườ iđàn ông có khả năng sinh sản tại 14 quốc gia trên 4 lục địa kết quả: Tổng số

TT 39 triệu/ một lần xuất tinh; mật độ TT >15 triệu/ml, di động 32% [33]

Theo thời gian mật độ TT có xu hướng giảm đi; ở Đan Mạch tác giảBostofte khi nghiên cứu 1000 mẫu tinh dịch thấy mật độ TT năm 1952 là 73triệu/ml, nhưng 20 năm sau chỉ còn là 54,5%triệu/ml Ở Thụy Điển cũng tácgiả này nghiên cứu 185 mẫu tinh dịch thấy mật độ TT giảm rõ rệt từ mức 109triệu/ml vào năm 1960 xuống 65 triệu/ml vào năm 1980 Tại Mỹ, sự suy giảm

mật độ là 1,5 triệu/ml/năm Còn ở Anh theo kháo sát của các chuyên gia Anh

đã ghi nhận số lượng TT hiện nay giảm khoảng 2% mỗi năm Ở Châu Âu là3,13 triệu/ml/năm [trích dẫn theo 60]

Takahashi và CS (1989) khi kiểm tra 173 mẫu tinh dịch của các bệnhnhân nam VS tại khoa Niệu học Trường Đại học Y khoa Cfu (Nhật Bản), thấy

có 62 mẫu không có TT (35,8%), 34 mẫu giảm số lượng TT nghiêm trọng(19,6), 17 mẫu giảm số lượng mức độ vừa (9,8%) và 60 mẫu có tinh dịch đồbình thường (34,7%) [trích dẫn theo 20]

Tác giả Ayalac, Steiber E (1996) đã nghiên cứu thấy rằng những bệnhnhân có số lượng TT < 20 triệu/ml thì khả năng sinh sản suy giảm đáng kể,tuy nhiên các tác giả cũng nhấn mạnh rằng những bệnh nhân đó chưa hẳn

là VS [trích dẫn theo 13]

Theo giáo sư Wang Yifei (1999), ở Trung Quốc số lượng TT giảmmạnh từ 100 triệu/ml tinh dịch 40 năm trước xuống chỉ còn 2 -40 triệu/mltinh dịch trong những năm gần đây [68]

Theo nghiên cứ của tác giả Cooper và CS (2010) cho thấy một số ngườ iđàn ông có mật độ TT > 20 triệu/ml lại có tỉ lệ TT di động thấp, ngược lại cóngười đàn ông có mật độ TT < 20 triệu/ml vẫn có khả năng sinh sản vì có tỉ lệ

TT di động cao (> 60%) [33]

1.4 Tinh dịch đồ

1.4.1 Tiêu chuẩn của một tinh trùng bình thường.

Tinh trùng được coi là bình thường: khi cả đ ầu, cổ, đuôi đều bìnhthường [47] [64]

- Đầu: Hình bầu dục có chiều dài từ 5 -6 μm; rộng từ 2,5 -3,5 μm; tỉ

lệ dài/ rộng =1,5 -1,75; túi cực đầu chiếm 40 -70% vùng đầu

- Cổ: Thon gắn thẳng trục với đầu; chiều ngang khoảng 1μm; chiều dàibằng 3/2 chiều dài đầu.

- Đuôi: Thẳng, thon nhỏ hơn phần cổ, dài 45 μm không cuộn

Hình 1.4 Tinh trùng bình thường

Tinh trùng di động tiến tới là TT di chuyển thẳng về phía trước; TTđược coi là di động nhanh khi trong một giây nó di chuyển một khoảng cáchlớn hơn 5 lần chiều dài đầu hay 1/2 chiều dài đuôi; TT di động tròn gọi là TT

di động nhưng không tiến tới [66]

1.4.2 Tiêu chuẩn của một mẫu tinh dịch đồ bình thường.

Tại các thời điểm khác nhau và ở các quốc gia khác nhau, các nhànghiên cứu đã đưa ra những mẫu tiêu chuẩn của một mẫu tinh dịch đồ bìnhthường khác nhau

* Tinh dịch đồ bình thường theo Guerker (1956) [trích dẫn từ 2].

Cuốn sách laboratory manual for the examination of Human Semen-cervical

mucus interaction do WHO phát hành lần đầu tiên vào năm 1980 Phiên bản

lần hai vào năm 1987, và lần ba vào năm 1992, lần thứ tư vào năm 1999, vàphiên bản cuối cùng lần thứ năm là phiên bản được xuất bản mới nhất trongnăm 2010 [67]

* Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 1999) [66]

- Tỉ lệ tinh trùng di động : ≥ 25% di động tiến tới nhanh (loại

a), hoặc ≥ 50% di động tiến tới nhanh

1999 tổ chức Y tế thế giới đã đưa ra thông số tỉ lệ TT tiến tới nhanh và chậm.

+ Các chỉ tiêu về mật độ tinh trùng và tỉ lệ di động, hình thái bìnhthường ngày càng giảm thấp, nhưng để có một kết quả chính xác phải tuântheo phương pháp làm tinh dịch đồ nghiêm ngặt của WHO

+ Đánh giá TT di động theo phiên bản của WHO năm 1999, đề nghị TT

di động tiến tới được phân thành 2 loại nhanh và chậm, với tốc độ tiến tới25μm/giây cho TT loại A, tiến tới chậm hơn cho TT loại B Điều này khó xácđịnh đặc điểm tiến tới trước một cách chính xác mà không chủ quan Do đónăm 2010 WHO đã đưa ra tiêu chuẩn đánh giá sự di động của TT như sau: Diđộng tiến tới (PR)TT di động tiến tới trước, tốc độ di chuyển không quantrọng; di động không tiến tới (NP), TT di chuyển khó khăn, di động tại chỗ;

TT không di động (IM) [66] [67]

Như vậy cùng với thời gian, các thông số về tinh dịch đồ ngày càngđược chi tiết hóa, bổ sung và hoàn thiện hơn

1.4.3 Các phương pháp đánh giá tinh dịch.

Tinh dịch đồ là xét nghiệm cơ bản có thể cung cấp các thông tin chi tiết

về các chỉ số của tinh trùng trong tinh dịch nam giới Chất lượng mẫu tinhdịch có thể được đánh giá bằng máy phân tích tự động hoặc bằng các phươngpháp thủ công (sử dụng buồng đếm) Hiện nay có nhiều loại buồng đếm vànhiều loại máy phân tích tự động Trong số đó buồng đếm Makler, buồngđếm Neubauer và máy phân tích tự động SQA-IIB vẫn đang được nhiều trungtâm xét nghiệm sử dụng

1.4.3.1 Buồng đếm Makler[55].

Buồng đếm Makler được phát minh bởi nhà khoa học Israel, Maklervào năm 1978, được thiết kế đặc biệt cho tinh dịch không pha loãng và đãđược sử dụng trong nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới

Buồng đếm TT Makler có chiều sâu chỉ 10 µm, bằng 1/10 chiều sâucủa buồng đếm tế bào thông thường, đây là loại buồng có chiều sâu nhỏ nhấthiện nay

■Buồng đếm được làm từ hai mảnh kính quang học phẳng:

a Thân buồng đếm có nền tảng là khối kim loại tròn (A) và 2 tay cầm (H).Trong phần trung tâm của phần đáy là một đĩa thủy tinh tròn (D), là nơi đặtmẫu Ở phần ngoại vi của đĩa là 4 cọc có chất liệu bằng thạch anh (P), nângcao hơn so với bề mặt của phần trung tâm là 10 μm

b Nắp buồng đếm là một tấm kính tròn, gắn bên trong của một vòng kim loại.Mặt dưới của tấm kính được khắc chìm với 100 ô vuông, diện tích mỗi ôvuông là 0,1x0,1mm, tổng diện tích 1mm2

Khi đặt nắp buồng đếm vào đúng vị trí của thân buồng đếm - tựa trên 4 cọc thạch anh, sẽ tạo ra khoảng trống dày 10 µm giữa hai bề mặt thủy tinh(của thân và nắp buồng đếm) Đây là vùng chứa mẫu tinh dịch để đọc kết quả.

Trước khi sử dụng, lớp kính phải hoàn toàn sạch sẽ và không bị bụi bẩn

■ Phương pháp đếm: Trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu

1.4.3.2 buồng đếm Neubauer [61].

Buồng đếm Neubauer cải tiến được chia làm 2 buồng riêng biệt, mỗi

buồng được khắc trên bề mặt những lưới ô vuông cực nhỏ có kích thước 3×3

mm, Neubauer được dùng với lam phủ đặc biệt, dày (0,44mm) dán chặt trênhai gờ của buồng đếm

Hình 1.6 Buồng đếm Neubaer

Mỗi buồng đếm được chia thành 9 lưới ô vuông kích thước 1×1mm và được đánh số từ 1-9, thể tích 1 lưới ô vuông 100nl Chiều sâu buồng đếm100µm

Bốn lưới ô vuông mang số 1, 3, 7 và 9, mỗi lưới có 4 hàng, mỗi hàng chia thành 4 ô vuông lớn có thể tích 6,25nl/ ô vuông

Hai lưới ô vuông mang số 2 và 8, mỗi lưới có 4 hàng, mỗi hàng chiathành 5 ô vuông lớn, có thể tích 5nl/ ô vuông

Lưới ô vuông số 5 (ô trung tâm) có 25 ô vuông lớn, một ô vuông lớn có

16 ô vuông nhỏ Mỗi ô vuông lớn được giới hạn bởi 3 đường kẻ song song.Lưới ô vuông số 5 có 5 hàng, mỗi hàng được chia thành 5 ô vuông lớn có thểtích 4nl/ ô vuông

Lưới ô vuông số 4, 5, 6 mỗi lưới có 5 hàng, thể tích một hàng 20nl

1.4.3.3 Máy đếm tinh trùng tự động SQA-IIB [56].

Hình 1.7 Máy phân tích tinh trùng tự động SQA-IIB.

SQA (Sperm Quality Analysis), máy phân tích chất lượng TT, là mộtthiết bị kết hợp một loạt các thuật toán để tính toán đánh giá các thông số củatinh dịch

SQA có một tế bào quang điện phát hiện sự biến đổi về mật độ quanghọc gây ra bởi sự vận động của TT Các tín hiệu tương tự được chuyển đổi kỹthuật số để cung cấp các chỉ số của tinh trùng

Các thông số được thực hiện trên máy phân tích TT tự động SQA-IIB.+ Tổng số mật độ tinh trùng chức năng (TFSC- Total FuncitionalSperm Concentration) Đơn vị tính 0,1 triệu/ml Thời gian trong 40 giây

+ Tổng số mật độ tinh trùng triệu/ml

+ Tỉ lệ % tinh trùng tiến tới : Là tỉ lệ % TT di động tiến tới về phía trước

+ Chỉ số di động của tinh trùng (SMI - Sperm Mobility Index).Là chỉ

số tinh trùng có khả năng di động

+ Tỉ lệ % tinh trùng có hình dáng bình thường

1.4.4 Các nghiên cứu về các phương pháp phân tích tinh dịch

Trên thế giới đã có một số tác giả đã nghiên cứu so sánh kết quả giữacác phương pháp phân tích tinh dịch đồ

Sau khi nghiên cứu chỉ số di động của TT bằng máy đếm tự động IIB và phương pháp thủ công quan sát dưới kính hiển vi của 968 mẫu tinhdịch của những người đàn ông khỏe mạnh Tác giả Bartoow và CS (1991), đãđưa ra kết luận, tỉ lệ di động của TT phân tích bằng SQA-IIB so với phươngpháp thông thường đáng tin cậy [31]

SQA-Theo nghiên cứu của tác giả Imade G.E và CS (1993).Khi nghiên cứuphân tích 50 mẫu tinh dịch bằng hai buồng đếm Makler và Neubauer đã thuđược kết quả: Mật độ trung bình của buồng đếm Neubauer là 78,6 ± 10,1 vàcủa buồng đếm Makler là 119,1 ± 14,1 triệu TT/ml Tác giả kết luận có sựkhác biệt về mật độ TT giữa hai buồng đếm (P < 0,05) [49]

Theo nghiên cứu của tác giả Sukcharoen và CS (1994), khi phân tíchmật độ tinh trùng ở 55 mẫu tinh dịch bằng sử dụng buồng đếm Makler vàbuồng đếm Neubauer đã kết luận: Mật độ TT của hai phương pháp khôngkhác nhau khi mật độ TT > 40 triệu/ml và có sự chênh lệch khi mật độ tinhtrùng < 40 triệu/ml (p < 0,001) [61]

Còn theo tác giả David Mortimer (1994), do những đặc tính về tínhnăng, khiến cho các thế hệ máy thử tinh dịch đồ hiện nay chưa đạt được độchính xác tương đương với các quy trình chuẩn do người thực hiện, vì vậy

việc sử dụng máy để thử tinh dịch đồ thay thế cho phương pháp thông thườngkhông được khuyến khích [37].

Tác giả Johnston và CS (1995), sau khi nghiên cứu đã kết luận: Phântích tinh dịch bằng SQA-IIB dễ sử dụng, có sự tương quan giữa các chỉ số diđộng của TT, mật độ TT, ngoài ra có một số thông số tinh dịch khác hỗ trợcho việc đánh giá chất lượng, giúp cho chuẩn đoán nhanh chóng chất lượng

TT để sàng lọc bệnh nhân (như trong thụ tinh ống nghiệm) [46]

Theo tác giả Yeung và CS (1997), việc sử dụng kỹ thuật bằng buồngđếm Neubauer và buồng đếm Makler để đánh giá mật độ và độ di động, tácgiả cho rằng mật độ có giá trị chính xác bằng kỹ thuật, còn độ di động kh iphân tích đánh giá có thể thiếu độ chính xác do tính chủ quan của người quansát, ngoài ra di động của TT bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, độ sâu và tính chấtcủa buồng đếm [69]

Vào năm 1998, Hiệp hội Sinh sản và phôi học người Châu Âu, đãthống nhất và đi đến khuyến cáo về việc sử dụng các máy để thử tinh dịch đồ:

Do những đặc tính và tính năng, khiến cho các hệ thống máy thử tinh dịch đồhiện nay chưa đạt được độ chính xác tương đương với quy trình chuẩn dongười thực hiện, do đó việc sử dụng máy thử tinh dịch đồ để thay thế quytrình chuẩn của WHO là không phù hợp [Trích dẫn theo 66]

Tác giả Makler và CS (1999), nghiên cứu 26 mẫu tinh dịch bằng máyđếm SQA-IIB với buồng đếm Neubauer theo tiêu chuẩn của WHO, tác giả đãchỉ ra sự chênh lệch đáng kể giữa hai phương pháp Có sự khác biệt gấp đôitrong 53% trường hợp, gấp ba lần trong 33% trường hợp Ở những mẫu có <8% di động, hoặc không có TT di động thì SQA-IIB có kết quả là mật độ 0,

di động 0, tác giả cho rằng SQA-IIB thiếu độ chính xác và tin cậy, do đó máy

có thể cung cấp các thông tin sai lệch, mà điều đó có ảnh hưởng rất lớn trongquyết định điều trị vô sinh theo phương pháp nào [56]

Nghiên cứu của tác giả Matisnez và CS (2000), khi đánh giá phân tíchchất lượng TT bằng máy phân tích tự động SQA –IIB, các tham số SMI đượcphân tích với độ nhạy cao, từ nghiên cứu cho thấy SQA-IIB là một phươngpháp sàng lọc tốt để loại trừ Oligozoospermia (mật độ TT ít < 15 triệu/ml) vàAsthenozoospermia (Tinh trùng yếu; PR < 32%), tác giả cũng chỉ ra phươngpháp này không thích hợp đánh giá hình thái [57].

Ngược lại theo nghiên cứu của YA Hồ Cẩm Đào và CS (2006) khi sosánh buồng đếm Makler, buồng đếm Neubauer, và máy phân tích tự động với

54 mẫu, kết quả mật độ trung bình ở các phương pháp là : Makler 52,36 ±7,78; Neubauer 44,84 ± 4,86, máy phân tích tự động 28,53 ± 2,06 Các tác giả

đã kết luận không có sự khác biệt về mật độ giữa buồng đếm Neubauer vàbuồng đếm Makler (P > 0,05) Có sự khác biệt về mật độ giữa buồng đếmMakler và Neubauer với máy phân tích tự động (P < 0,05) [70]

Một nghiên cứu gần đây (2007), của tác giả Jin-Chunlu và CS Khi tácgiả nghiên cứu 35 mẫu tinh dịch và chia thành 3 nhóm Nhóm thấp có mật độ

TT < 20 x 106 triệu/ml, nhóm trung bình có mật đô TT từ 20 – 100 x 106 /ml,nhóm cao > 100 x106 /ml Các tác giả tiến hành so sánh về mật độ trung bình

và mật độ trung bình của các nhóm bằng hai buồng đếm Makler và Neubauer,kết quả mật độ trung bình ở buồng đếm Makler là 78,9 ± 59,2; buồng đếmNeubauer là 79,3 ± 56,7 Mật độ trung bình ở các nhóm thấp, trung bình, cao

là : Makler (23,3 ± 4,1; 86,7 ± 10,2; 150,4 ± 16,2), Neubauer (29,3 ± 6,6; 93,3

± 10,9; 153,7 ± 23,0) Tác giả đã kết luận không có sự khác biệt về mật độgiữa hai buồng đếm [47]

Khi nghiên cứu so sánh đếm mật độ tinh trùng với 112 mẫu tinh dịch

từ những người khỏe mạnh, bằng buồng đếm Makler và buồng đếmNeubauer, Cardona-Maya W và CS (2008) đã thu được kết quả: mật độtrung bình ở buồng đếm Makler là 107,8 x 106, ở buồng đếm Neubauer là

106,2 x 106 Tác giả đã kết luận: mật độ TT thu được từ 2 buồng đếm là nhưnhau p > 0,05 [35].

Ở Việt Nam, các trung tâm hỗ trợ sinh sản, các trung tâm nam học,các phòng khám vô sinh đang ngày phát triển Mỗi trung tâm sử dụngphương pháp đánh giá chất lượng tinh dịch khác nhau Tuy nhiên, việc sosánh cách đánh giá chất lượng theo các phương pháp chưa có một thôngbáo chính thức nào

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu.

Lấy 30 mẫu tinh dịch có tinh dịch đồ bình thường của người chồng củacác cặp vợ chồng vô sinh, được làm xét nghiệm tinh dịch tại Labo bảo quảnmô-phôi, Bộ môn Mô - Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Thời gian từ tháng 1 năm 2011 đến tháng 8 năm 2011, địa điểm tại Labobảo quản mô và phôi, Bộ môn Mô – Phôi học, Trường Đại học Y Hà Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu.

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu:

- Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang

2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu:

2.3.4 Sơ đồ nghiên cứu.

SQA-IIB Cho cuvet vào lọ đựng mẫu, tinh

dịch được hút vào mao dẫn

Cắm cuvet vào máy SQA-IIB Máy tự phân tích kết quả

Mẫu tinh

dịch (Lắc

đều mẫu)

Makler

Cho một phần TD vào ống nghiệm,

để ống trong cốc nước 50-600 Nhỏ 10 µl vào buồng

đếm Makler

Đếm mật độ

Nhỏ 10 µl TD vào lam

hướng dẫn của WHO 2010

5% + formalin 35%

Nhỏ 10 µl

Buồng đếm Neubauer I

Buồng đếm Neubauer II

Đếm mật độ

Đếm mật độ

Tính độ khác biệt cho phép (WHO 2010)

2.4 Kỹ thuật và chỉ tiêu nghiên cứu.

2.4.1 Kỹ thuật nghiên cứu

2.4.1.1.Kỹ thuật lấy mẫu [Theo hướng dẫn của WHO 2010].

● Chuẩn bị lấy mẫu

- Bệnh nhân phải kiêng giao hợp từ 3-5 ngày

- Tại thời điểm làm xét nghiệm tinh dịch đồ người chồng không sốt,không dùng thuốc, không uống rượu

- Lấy mẫu tại phòng riêng gần phòng xét nghiệm để hạn chế sự thay đổinhiệt độ đột ngột của tinh dịch và để theo dõi thời gian tinh dịch ly giải.

- Bệnh nhân cần nắm rõ thông tin về cách lấy mẫu như phải thu thậptoàn bộ mẫu

- Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân trên bảng kết quả: Họ, tên, năm sinh, sốngay kiêng xuất tinh, thời gian lúc nhận mẫu và bắt đầu thực hiện xét nghiệm

-Lọ đựng tinh dịch phải sạch, trên thành lọ đựng mẫu có ghi tên, tuổibệnh nhân, ngày giờ lấy mẫu

● Cách lấy mẫu

- Bệnh nhân nên: Đi tiểu thật sạch trước khi lấy mẫu

- Tất cả lọ đựng mẫu, pipette, pipette tip, dùng để đựng và trộn mẫu đềuphải sạch

- Lọ đựng mẫu có miệng rộng để dễ thu thập tinh dịch, tránh rơi vãi rangoài, lọ được làm bằng loại nhựa đặc biệt không ảnh hưởng đến tinh trùng

- Tinh dịch được lấy bằng tay như thủ dâm và xuất tinh trực tiếp vào lọđựng mẫu

- Đặt lọ đựng mẫu trong tủ ấm 370 C 30 phút để theo dõi ly giải

- Tiến hành các bước thường quy để phân tích, xác định các thông sốcủa mẫu: thể tích, sự ly giải, độ nhớt, pH, mật độ, độ di động, hình thái …theotiêu chuẩn WHO (2010), đang được áp dụng thường quy tại Bộ môn Mô Phôihọc- Trường Đại học Y Hà Nội

2.4.1.2 Kỹ thuật đánh giá tinh trùng di động và mật độ tinh trùng bằng buồng đếm Neubauer (theo hướng dẫn của WHO 2010).

a Đánh giá tinh trùng di động:

Đánh giá độ di động bằng cách khảo sát sự di động tự nhiên của TT,sau đó tính tỉ lệ giữa tinh trùng di động trên tổng số TT trong cùng thể tích vàđược thể hiện bằng phần trăm.

Đánh giá di động khảo sát bằng mắt, sử dụng kính hiển vi quang họcvới độ phóng đại 400 lần Tiêu chuẩn đánh giá sự di động của TT theo 3 loại:

+ Di động tiến tới (PR): Tinh trùng di động tiến tới trước, tốc độ dichuyển không quan trọng

+ Di động không tiến tới (NP): Tinh trùng di chuyển khó khăn, di độngtại chỗ

+ Không di động (IM)

- Cách đánh giá phân loại di động:

+ Tạo tiêu bản ngay sau khi trộn mẫu thật đều, nhỏ 10 µl tinh dịch nênlam kính và đậy lam (22 x 22 mm), để tinh trùng ổn định trong 60 giây, khảosát mẫu dưới vật kính 40x,

+ Đánh giá một cách hệ thống ít nhất 5 vi trường để xếp loại TT

+ Đánh giá trên một vùng giới hạn của vi trường nếu mật độ TT quánhiều, đánh giá trên toàn bộ vi trường nếu mật độ ít

+ Đánh giá những tinh trùng còn nguyên vẹn đầu đuôi, đếm ít nhất

200 tinh trùng để giảm sai số và tránh chọn lựa vùng chỉ có đa số tinh trùng diđộng

-Chọn các điểm đánh giá trên tiêu bản:

+ Theo hệ thống hình zic zac

+ Cách cạnh lam phủ vật 5cm

-Chọn vị trí đánh giá trong vi trường

+ Trung tâm hoặc một góc vi trường

+ Toàn bộ vi trường nếu mật độ TT ít

- Dùng máy bách phân bạch cầu để phân loại tinh trùng Trong vùng chọngiới hạn, cùng một thời gian các TT di động tiến tới (PR) được đếm trước,sau đó không tiến tới (NP) và bất động (IM) Không nên đợi TT bơi vào vùngđánh giá mới đếm

- Trường hợp tổng số 200 tinh trùng đạt được trước khi tất cả các loại di độngcòn lại chưa được đếm từ vùng cùng đánh giá, nên đếm tiếp tục các loại diđộng còn lại cho dù hơn tổng số 200

- Tính trung bình cộng và tỉ lệ khác biệt giữ 2 lần đếm của PR, NP, IM

- Chọn tỉ lệ trung bình cao nhất trong 3 giá trị (PR, NP, IM) để so với tỉ lệkhác biệt cho phép (bảng 2.1)

- Nếu khác biệt vượt quá số cho phép, tạo tiêu bản khác đánh giá lại

- Nếu khác biệt chấp nhận được, kết quả là tỉ lệ trung bình PR, NP, IM

Bảng 2.1 Tỉ lệ khác biệt cho phép giữa tỉ lệ trung bình và khác biệt giữa 2

lần đếm (mỗi lần đếm 200)

Tỉ lệ trung

bình (%)

Tỉ lệ khác biệt cho phép

- Cách xác định độ pha loãng, cách pha loãng và chọn vùng đánh giá mật

độ tinh trùng dựa theo bảng 2.2

- Dựa vào độ pha loãng và số tinh trùng đếm được, các vùng khác nhaucủa buồng đếm được sử dụng để tính mật độ

Tỉ lệ trung bình

(%)

Tỉ lệ khác biệt cho phép

+ Đối với độ pha loãng 1/20 (1+19) và 1/5 (1+4), đếm tinh trùng trongnhững hàng của lưới ô vuông số 5 trước, tiếp tục ở lưới ô vuông số 4 và 6 khicần thiết.

+ Đối với độ pha loãng 1/2 (1+1), đếm TT trong tất cả 9 lưới ô vuôngkhi cần để đếm đủ 200 tinh trùng

Bảng 2.2 Quy định độ pha loãng, cách pha, vùng đếm tinh trùng

vi trường 20x

Độ pha loãng quy định

Thể tích tinh dịch (μl)

Thể tích dung dịch pha loãng (μl)

Vùng đánh giá lưới ô vuông

Dán lam phủ lên buồng đếm bằng cách dùng nước bôi ướt 2 gờ củabuồng đếm rồi đặt lam phủ lên hoặc hà hơi thổi lên 2 gờ của buồng đếm rồiđặt lam phủ lên Lam phủ phải được dán sát để đảm bảo độ sâu của buồngđếm 100μm.

■Chuẩn bị pha loãng:

+ Dùng pipette tự động chỉnh thể tích thích hợp hút dung dịch phaloãng NaHCO3 5% vào 2 ống nghiệm, độ pha loãng như nhau

+ Trộn đều mẫu thử

+Hút tinh dịch với thể tích thích hợp ngay sau khi trộn đều

+ Lau sạch tinh dịch bên ngoài của pipette-tip, cẩn thận không chạmvào nút tháo bỏ pipette-tip

+ Phân phối tinh dịch vào 2 ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng.+ Trộn đều bằng cách hút rửa pipette-tip

+ Trộn đều mẫu pha loãng thứ 1 trong 10 giây

■ Đặt mẫu vào buồng đếm:

+ Lấy ngay 10μl huyền dịch được trộn, tránh để tinh trùng lắng xuống.+ Đặt pipette-tip chạm vào cạnh dưới của lam phủ buồng đếm

+ Đẩy từ từ huyền dịch ra, làm đầy buồng đếm thứ nhất bởi lực maodẫn, không quá ít hay đầy tràn, lam phủ không được di chuyển khi đặt mẫu

+ Để yên 1 phút cho tinh trùng ổn định

+ Đánh giá mẫu trong vòng 10 – 15 phút (nếu để lâu mẫu sẽ bay hơiảnh hưởng đến vị trí của tinh trùng trong buồng đếm)

thứ 2.

+ Xử lý tương tự đối với mẫu pha loãng thứ 2 và làm đầy buồng đếm

■ Cách đếm tinh trùng trong lưới ô vuông:

+ Đếm tinh trùng dựa vào vị trí của đầu tinh trùng không dựa vào vị trícủa đuôi Ranh giới của ô vuông lớn là đường giữa của 3 đường viền song song

+ Đếm tất cả tinh trùng nằm trong ô vuông lớn, đếm TT có đầu nằmgiữa 2 đường viền bên trong, không đếm tinh trùng có đầu nằm giữa 2 đườngviền bên ngoài

+ Để tránh đếm lặp lại TT trong các ô vuông liền kề, tinh trùng nằmtrên đường phân chia giữa 2 ô vuông chỉ được đếm 1 lần Đếm TT có đầunằm trên đường phân chia phía dưới và bên trái của ô vuông

+ Cần ghi nhận nếu có nhiều TT đầu kim hoặc TT không đuôi trongmẫu Khi cần thiết có thể đánh giá mật độ của chúng giống như TT bìnhthường hoặc đánh giá qua phương pháp nhuộm

■ Đánh giá số lượng tinh trùng trên buồng đếm:

+ Khảo sát đánh giá với vật kính 40x

+ Đếm ít nhất 200 tinh trùng trên mỗi buồng của buồng đếm

+ Đánh giá lưới ô vuông số 5 trước, bắt đầu từ cạnh của lưới ô vuông.đếm tinh trùng theo từng hàng

+ Đếm ít nhất 200 tinh trùng, tiếp tục đếm đến hết hàng cho dù hơntổng số 200

+ Nếu đếm chưa đủ 200 tinh trùng trong 5 hàng của lưới ô vuông số 5,đếm tiếp tục những hàng trong lưới ô vuông số 4 và 6

+ Nếu số tinh trùng đếm ở các ô số 4,5 và 6 chưa đủ 200, không tiếptục đếm ở các ô số 1, 2, 3, 7, 8 và 9 do thể tích mỗi hàng trong các ô vuôngnày khác với thể tích mỗi hàng trong ô số 4, 5, và 6 Nên chọn độ pha loãngthấp hơn, có thể pha loãng 1/2 (1+1).

+ Ghi nhận số hàng đánh giá đạt ít nhất 200 tinh trùng Số hàng tương

tự sẽ được đếm ở buồng thứ 2 của buồng đếm Neubauer

+ Đếm số tinh trùng và số hàng bằng máy bách phân bạch cầu

+ Chuyển buồng thứ 2 của buồng đếm và thực hiện các bước giốngbuồng thứ 1

+ Đếm tinh trùng trong những hàng tương tự với số hàng đã đếm ởbuồng thứ 1 ngay khi đếm ít hơn 200 tinh trùng

+ Tính tổng và hiệu của hai số đếm

+ So sánh kết quả cho phép theo bảng 2.3

Nếu khác biệt chấp nhận được Tính mật độ

Nếu khác biệt vượt quá số cho phép Pha loãng và đánh giá lại

Không nên đánh giá 2 lần trên cùng 1 buồng của Neubauer hoặc đánh giá 2buồng với cùng 1 mẫu pha loãng, điều này có thể dẫn đến sai số khi lấy mẫu,sai số do pha loãng hoặc do trộn không đều

Bảng 2.3 Khác biệt cho phép giữa tổng số và hiệu số đếm trên 2 tiêu bản tính mật độ tinh (theo hướng dẫn của WHO 2010).

Thể tích 1 hàng trong lưới ô vuông số 4, 5 và 6 là 20nl→1nl = 1/20

+ Với độ pha loãng 1/5 (1+ 4), sử dụng lưới ô vuông số 4, 5, và 6

C = (N/n) × (1/20)× 5 TT/nl = (N/n) × (1/4) TT/nl (106/ml tinh dịch)+ Với độ pha loãng 1/20 (1+19), sử dụng lưới ô vuông số 4, 5 và 6

C = (N/n) × (1/20) × 20 TT/nl = (N/n) TT/nl (106/ml tinh dịch)

+ Với độ pha loãng 1/50 (1+49), sử dụng lưới ô vuông 4, 5 và 6

C = (N/n) × (1/20) × 50 TT/nl = (N/n) × 2,5 TT/nl (106/ml tinh dịch) Giới hạn tối thiểu của mật độ TT trong mẫu là 15.106