Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây an điền nón (hedyotis pilulifera (pit ) t n ninh rubiaceae)

Các nghiên cứu của Y học hiện đại đã cho thấy các dịch chiết hoặc những hợp chất phân lập từ các loài thuộc chi Hedyotis L.. Với lý do đó, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc điểm thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Hoài

HÀ NỘI 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Sau Đại học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Dược học cổ truyền và Thực vật Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược Huế, Ban chủ nhiệm và các cán bộ đồng nghiệp trong Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hoài, người đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thế Cường, ThS Hồ Việt Đức và ThS Lê Tuấn Anh đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn bên cạnh ủng hộ và động viên tôi trong quá trình học tập

Huế, ngày 12 tháng 10 năm 2015

Nguyễn Đình Quỳnh Phú

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Chi An điền (Hedyotis L.) 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.3 Tác dụng dược lý và công dụng 12

1.2 Cây An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh 18

1.2.1 Vị trí phân loại 18

1.2.2 Đặc điểm thực vật 18

1.2.3 Thành phần hóa học 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Hóa chất, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 19

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 20

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 27

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học loài nghiên cứu 27

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu cây An điền nón 29

3.1.3 Đặc điểm bột cây An điền nón 32

3.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 33

3.2.1 Định tính các nhóm chất chính trong cây 33

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây An điền nón 34

3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được từ cây An điền nón 39

Chương 4 BÀN LUẬN 50

4.1 Về thực vật 50

4.2 Về thành phần hóa học 51

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer

Hep-G2 : Liver hepato cellular carcinoma cell

HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation

1

H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance

HSQC : Heteronuclear single quantum correlation

IC50 : Inhibition concentration at 50%

MCF-7 : Breast carcinoma cell

MRSA : Methicilline resistant Staphylococcus aureus

MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid

NOESY : Nuclear overhauser effect spectroscopy

SGOT : Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase

SGPT : Serum Glutamic Pyruvic Transaminase

SK-Hep-1 : Human endothelial cell

TBA-MDA : Thiobarbituric acid-Malonyl dialdehyd

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Hedyotis L ở Việt Nam 2

Bảng 1.2 Một số alkaloid tiêu biểu được phân lập từ chi Hedyotis L 4

Bảng 1.3 Một số iridoid tiêu biểu được phân lập từ chi Hedyotis L 8

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong mẫu cây nghiên cứu 33

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất HP4 và hợp chất tham khảo 40

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất HP6 và hợp chất tham khảo 43

Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất HP3 và hợp chất tham khảo 46

Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR của hợp chất HP7 và hợp chất tham khảo 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Ảnh cành mang lá và hoa của cây An điền nón Hedyotis pilulifera 28

Hình 3.2 Ảnh hoa, quả và hạt của cây An điền nón Hedyotis pilulifera 28

Hình 3.3 Ảnh vi phẫu thân cây An điền nón 29

Hình 3.4 Ảnh vi phẫu lá cây An điền nón (vật kính 10) 30

Hình 3.5 Ảnh vi phẫu lá cây An điền nón (vật kính 40) 31

Hình 3.6 Ảnh một số đặc điểm bột thân cây An điền nón 32

Hình 3.7 Ảnh một số đặc điểm bột lá cây An điền nón 33

Hình 3.8 Sơ đồ tạo cao chiết phân đoạn từ phần trên mặt đất cây An điền nón 35

Hình 3.9 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn nước của cây An điền nón 37

Hình 3.10 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetate của cây An điền nón 38

Hình 3.11 Ảnh sắc ký đồ của 4 hợp chất phân lập được 38

Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất HP4 41

Hình 3.13 Tương tác HMBC, COSY, NOESY chính của hợp chất HP4 41

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất HP6 44

Hình 3.15 Tương tác HMBC, COSY, NOESY chính của hợp chất HP6 44

Hình 3.16 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chất HP3 46

Hình 3.17 Cấu trúc hóa học của hợp chất HP7 49

Hình 3.18 Tương tác HMBC, COSY, NOESY chính của hợp chất HP7 49

Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của 4 hợp chất phân lập được 52

Hình 4.2 Con đường sinh tổng hợp chính của iridoid 53

Hình 4.3 Chu trình sinh tổng hợp iridoid glycosid ở họ Rubiaceae 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

An điền (Hedyotis L.) là một chi lớn trong họ Cà phê (Rubiaceae) Trên thế

giới chi này đã ghi nhận được có khoảng 500 loài, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt

đới và cận nhiệt đới [17] Ở Việt Nam, theo tác giả Phạm Hoàng Hộ, chi Hedyotis

L có khoảng 70 loài, phân bố nhiều nơi, rải rác khắp cả nước [6]

Thành phần hoá học của chi Hedyotis L khá đa dạng với các nhóm hợp chất

có hoạt tính sinh học như alcaloid, anthraquinon, flavonoid, saponin, sterol, iridoid

và lignan Nhiều loài trong chi Hedyotis L đã được sử dụng trong y học cổ truyền

nhiều nước (đặc biệt là ở các nước châu Á) để chữa bệnh như điều trị thấp khớp, đau dạ dày, suy nhược thần kinh, hạ sốt, làm vết thương nhanh lên da non… [67] Các nghiên cứu của Y học hiện đại đã cho thấy các dịch chiết hoặc những hợp chất

phân lập từ các loài thuộc chi Hedyotis L chứa đựng nhiều hoạt tính sinh học tốt

như kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư, bảo vệ tế bào thần kinh [54] Như vậy có thể thấy với số loài phong phú, chi An điền chứa đựng tiềm năng cho các nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất mới có tác dụng, cũng như định hướng cho những nghiên cứu phát triển thành sản phẩm thuốc phục vụ sức khỏe con người

Theo kinh nghiệm dân gian, cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.)

T.N.Ninh) được người dân ở vùng bảo tồn Khe Trăn dùng để chữa các bệnh về đường tiêu hóa và đau nhức xương khớp [16] Tuy nhiên cho đến nay chưa thấy có công bố khoa học nào về đặc điểm thực vật cũng như thành phần hóa học hay tác dụng sinh học của loài này Việc làm sáng tỏ các đặc điểm thực vật như quan sát,

mô tả hình thái, nghiên cứu đặc điểm vi học và phân tích, nghiên cứu thành phần

hóa học của loài H pilulifera (Pit.) T.N.Ninh sẽ góp phần cung cấp những kiến thức

khoa học và góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Với lý do đó, đề tài nghiên cứu

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh − Rubiaceae” với 2 mục tiêu chính:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây An điền nón

2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 4–5 hợp chất phân lập được từ cây An điền nón

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi An điền (Hedyotis L.)

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Trên thế giới chi Hedyotis L gồm khoảng 500 loài, phân bố rộng ở khu vực

cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở châu Phi và châu Á, thường mọc ở trong rừng, ven rừng nơi đất ẩm, từ vùng núi cao đến vùng đất cát ven biển Các loài thuộc chi

Hedyotis L thường là cây thảo, cây bụi, hàng năm hoặc lâu năm, cây phát triển

dạng bò hoặc leo Thân thường 4 cạnh, cạnh gần tròn đến tròn, có lông hay không lông Lá mọc đối (hiếm khi mọc vòng), lá kèm không rụng, gắn với cuống lá ở gốc, hay kết hợp xung quanh thân cây thường gọi là lá bẹ Lá bẹ thường dạng hình tam giác có chia thùy và có lông cứng Hoa dạng chùm tán ở ngọn, nách lá, hoặc ở cả ngọn và nách lá, có cọng ngắn hoặc dài Hoa thường lưỡng tính Tràng hoa màu trắng, hồng, tím hoặc màu xanh, hình ống khác nhau, nhẵn hoặc có lông bên trong,

thùy 4 (hoặc 5 như H hainanensis (Chun) W C Ko), nhị 4 (hoặc 5 như H

hainanensis (Chun) W C Ko) số lượng bằng tràng hoa, nằm xen kẻ với tràng, đính

vào ống hoặc họng tràng Bộ nhụy gồm 2 lá noãn dính nhau thành bầu dưới Núm

nhụy chẻ đôi Đài kém phát triển, thường có 4 răng (hoặc 5 răng như H hainanensis

(Chun) W C Ko) dính với bầu Trái tròn hay hình xoan, nang nhỏ, không tự khai, hay tự khai với quản bì mỏng, lá đài không hình muỗng, hạt từ vài đến nhiều, nhỏ, góc có cạnh hoặc phẳng lồi [17]

Theo Phạm Hoàng Hộ, chi An điền ở nước ta có khoảng 70 loài, chia làm 7 thứ, phân bố rải rác khắp cả nước (Bảng 1.1) [5], [6] Gần đây, các nhà khoa học tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phát hiện và bổ sung loài

Hedyotis cathayana W C Ko (An điền Trung Quốc) vào hệ thực vật nước ta

Trước đây, loài này chỉ được ghi nhận ở Hải Nam (Trung Quốc) [5] Ở Malaysia có khoảng 35 loài, ở Trung Quốc có 67 loài (trong đó có 38 loài đặc hữu) [18]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Hedyotis L ở Việt Nam [6]

STT Tên khoa học Tên Việt Nam STT Tên khoa học Tên Việt Nam

1 H ovatifolia An điền lá xoan 36 H pterita An điền cánh

4 H corymbosa Cóc mẵn 39 H lecomtei An điền Lecomte

5 H diffusa An điền lan 40 H petelotii An điền Pếtlot

7 H heynii An điền lữ đồng 42 H brachiata An điền nhánh

8 H arguta An điền tinh 43 H vestita An điền áo

9 H labialis An điền môi 44 H auricularia An điền tai

10 H biflora An điền hai hoa 45 H fraterna

11 H precox An điền sớm 46 H grandis

12 H contracta An điền ngắn 47 H hispida An điền phún

13 H

valerianelloides

48 H acutangula An điền cạnh

nhọn

14 H crassiflolia An điền lá dày 49 H hirsutula An điền phún

15 H dichotoma An điền lưỡng

phân

50 H leptoneura An điền gân

mảnh

16 H justiciformis An điền xuân tiết 51 H lindleyana An điền lindley

17 H glabra An điền không

lông

52 H capitellata var

mollis

Dạ cẩm

18 H lineata An điền lằn 53 H nigrescens An điền đen

19 H pierrei An điền pierre 54 H philippinensis An điền Philippin

20 H chereevensis An điền cheo-reo 55 H tonkinensis An điền Bắc bộ

21 H racemose An điền chúm 56 H pinifolia An điền lá thông

22 H scandens An điền leo 57 H merguensis Răm núi

23 H elegans An điền thanh 58 H microcephala An điền đầu nhỏ

24 H scoparia An điền chổi 59 H mouretii An điền mouret

30 H effusa An điền tràn 65 H equisetiformus

31 H ampliflora An điền hoa rộng 66 H trinervia An điền ba gân

32 H umbellata An điền tán 67 H pruinosa

33 H capitellata An điền đầu 68 H bracteata

34 H macrosepala 69 H tenelliflora An điền hoa nhỏ

Như vậy, so với 500 loài thuộc chi Hedyotis L trên thế giới, số loài Hedyotis

được ghi nhận ở nước ta chiếm khoảng 14%, chưa thấy công bố về loài đặc hữu

Alcaloid xuất hiện ở một số loài thuộc chi Hedyotis L như H auricularia L.,

H chrysotricha (Pal.) Merr., H capitellata Wall và H capitellata var mollis Pierre

ex Pit., tồn tại ở một số khung cơ bản như bis-indole, β-carboline Auricularin (1)

được phân lập từ rễ và thân loài H auricularia L vào năm 1971, cấu trúc của hợp

chất này được điều chỉnh lại vào năm 1942 dựa vào phân tích X-ray Chrysotricin

(2a) và (2b) là hai dạng đồng phân của nhau, lần đầu tiên được phân lập từ H

chrysotricha (Pal.) Merr và sau đó còn được tìm thấy trong loài H capitellata

Wall Ngoài ra, ba alcaloid khác gồm capitellin (3), cyclocapitellin (4a) và

isocyclocapitellin (4b) được tách ra từ loài H capitellata Wall cũng đã được báo

cáo, cấu trúc các alcaloid này đã được khẳng định bằng phổ X-ray Hedyocapitellin

(5) và hedyocapitin (6a, 6b) là 2 alcaloid mới được nhóm nghiên cứu của Trần Văn

Sung phân lập từ H capitellata var mollis Pierre ex Pit thu hái ở Cúc Phương và

Phần trên mặt đất

[53]

Điểm đáng lưu ý của các khung này là hiện tượng đồng phân hóa (tautomerization) làm cho cấu trúc của chúng thêm đa dạng và phức tạp Theo tài liệu thu thập nhận thấy cho đến nay ngoài các hợp chất đã nêu ở trên, không có

thêm công bố nào về alcaloid khác được phân lập từ chi Hedyotis L

1.1.2.2 Lớp chất anthraquinon

Anthraquinon là nhóm hợp chất được tìm thấy nhiều ở các loài thuộc chi

Hedyotis L Các hợp chất methoxyanthraquinon (7),

2-methyl-3-hydroxyanthraquinon (8), 2-methyl-3-hydroxy-4-methoxyanthraquinon (9) và

2,3-dimethoxy-6-methylanthraquinon (10) được phân lập từ H diffusa Willd là những

báo cáo đầu tiên về anthraquinon từ chi này [54] Năm 2008, Kang X D và cộng sự

đã bổ sung 2 hợp chất anthraquinon mới trong loài H diffusa Willd là

2,6-dihydroxy-3-methyl-4-methoxyanthraquinon (11) và 3-methoxyanthraquinon (12) [35].

2-hydroxy-7-hydroxymethyl-Bốn hợp chất anthraquinon mới được một nhóm nghiên cứu phân lập từ rễ

loài H dichotoma Koen ex Roth Và H herbacea L là

1,4-dihydroxy-2,3-dimethoxyanthraquinon (13), l,4-dihydroxy-2-hydroxymethylanthraquinon (14), 2,3-dimethoxy-9-hydroxy-l,4-anthraquinon (15) và 2-hydroxymethyl-10-hydroxy- l,4-anthraquinon (16) [61] Trong số anthraquinon kể trên, ngoại trừ hợp chất (10), (11) và (12), các hợp chất khác chỉ bị thế ở vòng C Lúc đó, hợp chất 2,3- dimethoxy-6-methylanthraquinon (10) được xem là phân lập lần đầu tiên từ thiên nhiên trong khi hợp chất 2,3-dimethoxy-9-hydroxy-l,4-anthraquinon (15) và 2- hydroxymethyl-10-hydroxy-l,4-anthraquinon (16) rất hiếm gặp trong tự nhiên Năm

2005, Ahmad R và cộng sự đã tách được 4 furanoanthraquinon mới là

capitellataquinon A-D (17-20) từ thân và rễ loài H capitellata Wall [15]

1.1.2.3 Lớp chất flavonoid

Flavonoid là lớp chất được tìm thấy nhiều trong họ Cà phê và có trong một số

loài thuộc chi Hedyotis L như H diffusa Willd., H herbacea L., H verticillata (L.) Lamk., H pressa Pierre ex và H dichotoma Koen ex Roth Năm 2000, Lu C.M và cộng sự đã thu mẫu H diffusa Willd ở Đài Loan và phân lập được một flavonol glycosid mới là kaempferol 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-

galactopyranosid (21) cùng với quercetin (26), quercetin 3-O-sambubiosid (28) và

quercetin 3-O-sophorosid (29) [47] Cũng từ loài H diffusa Willd., năm 2001, một

nhóm nghiên cứu ở Hàn Quốc đã tách được bốn flavonol glycosid mới bao gồm quercetin 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-galactopyranosid

(22), quercetin

3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-glucopyranosyl (23), kaempferol

3-O-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (24), quercetin

3-O-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (25) [38] Các nhà khoa học ở Malaysia đã công bố có quercetin

3-O-glucopyranosid (27), quercetin 3-O-rutinosid (30) ở H diffusa Willd., kaempferol 3-O-rutinosid (31), kaempferol 3-O-glucosid (32), kaempferol 3-O- arabinopyranosid (33), quercetin 3-O-galactosid (34) trong H herbacea L [54] Từ

lá của loài H verticillata (L.) Lamk., Hamzad A S và nhóm nghiên cứu đã phân lập

được kaempferitrin (35) [28] Isovitexin (36) được tách ra từ phần trên mặt đất của

loài H dichotoma Koen ex Roth đã được Ahmad R công bố [14] Năm 2009, Lại

Thị Kim Dung đã phân lập được tetrahydroxyflavon,

3,5,7,4′-tetrahydroxyflavon-3-O-β-D-glucopyranosid và amentoflavon từ H pressa Pierre

ex [4]

Nhìn chung, các flavonoid phân lập từ chi Hedyotis L đều thuộc nhóm

flavonol Bên cạnh các flavonol thường gặp còn xuất hiện nhiều hợp chất flavonoid glycosid có chứa hợp phần feruloyl khá đặc trưng

1.1.2.4 Lớp chất iridoid

Tính đến nay, người ta đã phân lập được hơn 30 iridoid từ 5 loài thuộc chi

Hedyotis L bao gồm H diffusa Willd., H corymbosa (L.) Lamk., H tenelliflora

Bl., H chrysotricha (Pal.) Merr và H hedyotidea (Cand.) Merr., trong đó có

khoảng 25 hợp chất mới tại thời điểm được phân lập

Bảng 1.3 Một số iridoid tiểu biểu được phân lập từ chi Hedyotis L

Iridoid mới

H diffusa

6-O- acylscandoside methyl ester (37-42)

Diffusosid A (43) , diffusosid B (44) (phân lập từ phần

trên mặt đất)

[38], [47], [74]

[56]

H chrysotricha

Asperulosidic acid ethyl ester (48) 6'-Acetyldeacetylasperulosid (49) 6'-Acetylasperulosid (50)

Scandoside methyl ester (60) Deacetylasperulosidic acid (61)

[54]

1.1.2.5 Lớp chất saponin và sterol

Hơn 20 triterpenoid 5 vòng được ghi nhận từ chi Hedyotis L Isoarborinol

(62), arborinon (63), olean-12-ene-3p,28,29-triol (64), germanicol, taraxerol và

erythrodiol là các triterpenoid được tìm thấy ở H acutangula Champ ex Benth Đặc biệt ở loài H lawsoniae Wight & Arn, các nhà khoa học đã phân lập được 19

acid triterpenoid gồm 3 acid triterpen mới là 3β,23-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid, 3β,24-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid và 2α,3β,24-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid

(67-69) cùng với oleanolic acid (65), ursolic acid (66), 3-epiursolic acid, asiatic

acid, euschaphic acid, oleanonic acid, sumaresinolic acid, hederagenin, arjunolic acid, 2α-hydroxy-3-epiursolic acid betulinic acid, betulin, 2α,3α,23-trihydroxyurs-

12-en-28-oic, 2α-hydroxyursolic acid Hai triterpen là acid oleanolic (65) vàacid

ursolic (66) đã được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Hedyotis L như H lawsoniae

Wight & Arn, H acutangula Champ ex Benth., H corymbosa (L.) Lamk., H

auricularia L., H lineata Roxb và H herbacea L [54] Từ H nudicaulis (Roth.)

Wight & Arn., vào năm 1998, Konishi và cộng sự đã phát hiện ra ba saponin

triterpenoid mới là nudicaucin A (70), nudicaucin B (71) và nudicaucin C (72) cùng với hợp chất đã biết guaiacin D (73) [41]

Bên cạnh đó, phytosterol, stigmasterol (74) và sitosterol (75) là những sterol

thường xuất hiện trong thành phần hóa học của chi Hedyotis L như H diffusa Willd., H corymbosa (L.) Lamk., H biflora (L.) Lamk., H acutangula Champ ex Benth., H auricularia L., H lineata Roxb., H microcephala Pierre ex Pit., H

heynii R Br ex Wight & Arn, H symplociformis Pit., H retrorsa Boiss, H pinifolia Wall ex G Don [10], [54].

1.1.2.6 Lớp chất lignan

Cho đến nay, chi Hedyotis L chỉ có duy nhất loài H lawsoniae Wight & Arn

có chứa nhóm chất tự nhiên lignan Các lignan được phân lập từ loài này bao gồm 4

sesquilignan là hedyotol A-D (76-79), 4 dẫn xuất acetyl pinoresinol, medioresinol, (+)-syringaresinol, (-)-dehydrodiconiferyl alcohol (80-83) tương ứng

(+)-và 4 dilignan hedyotisol A-C (84-86) [49]

Ngoài ra, một số sản phẩm thứ cấp khác cũng được tìm thấy ở chi này như

các coumarin là scopoletin (87) và fraxin (88) phân lập từ loài H dichotoma Koen

ex Roth [14] và hydroquinon monoglucosid là arbutin (89) được tách ra từ loài H

herbacea L [61]

 Nhận xét:

Các nhà khoa học đã nghiên cứu khoảng 15 loài trong tổng số 500 loài của

chi Hedyotis L., chiếm khoảng 3% số loài, qua đó cho thấy còn rất nhiều loài chưa

được nghiên cứu Các nghiên cứu tập trung chủ yếu của các tác giả ngoài nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, Malaysia Bộ phận nghiên cứu rất đa dạng: toàn cây

(H chrysotricha (Pal.) Merr.), phần trên mặt đất (H diffusa Willd., H capitellata Wall., H capitellata var mollis (Pit.) T.N.Ninh), lá (H tenelliflora Bl.), rễ (H

dichotoma Koen ex Roth và H herbacea L.) hoặc kết hợp cả thân và rễ (H diffusa

Willd., H auricularia L.)

Hóa học của chi Hedyotis L rất đa dạng với hơn 80 hợp chất đã được phân

lập từ 15 loài thuộc chi này Bên cạnh các lớp chất quen thuộc như alcaloid, flavonoid, terpenoid còn xuất hiện lớp chất có tính đặc thù như iridoid Hơn nữa, mỗi lớp chất chứa nhiều đặc điểm lý thú về mặt cấu trúc do xuất hiện nhiều trung tâm lập thể, nhiều dạng đồng phân và sự đa dạng các loại nhóm thế Đáng lưu ý là hơn một nửa trong tổng số các hợp chất đã phân lập tại thời điểm công bố là chất

mới, chưa từng được phát hiện trước đó Điều này chứng tỏ chi Hedyotis L là

nguồn tài nguyên triển vọng cho công cuộc tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc mới phục vụ cho quá trình tìm kiếm thuốc mới Đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất

là H diffusa Willd với khoảng 69 hợp chất được phân lập

Chưa có công bố nào về thành phần hóa học của loài Hedyotis pilulifera

(Pit.) T.N.Ninh trên thế giới cũng như ở Việt Nam

1.1.3 Tác dụng dƣợc lý và công dụng

1.1.3.1 Tác dụng dƣợc lý

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các

loài trong chi Hedyotis L Kết quả của các nghiên cứu này đã chứng tỏ phổ hoạt

tính rộng và mạnh của chúng Nhiều loài đã được nghiên cứu phát triển thành thuốc

và thực phẩm chức năng có giá trị

a Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan

Các loài thuộc chi Hedyotis L thu mẫu ở Malaysia gồm H verticillata (L.) Lamk., H capitellata Wall., H dichotoma Koen ex Roth., H nudicaulis (Roth.) Wight & Arn., H corymbosa (L.) Lamk., H herbacea (L.) và H pinifolia Wall ex

G Don đã được nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa trên mô hình ferricthiocyanate (FTC), thiobarbituric acid (TBA) và khả năng loại bỏ gốc tự do trên mô hình 1,1-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) Kết quả cho thấy, tất cả mẫu thử đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh với khả năng ức chế 89-98% (mô hình

FTC) và 60-95% (mô hình TBA), tuy nhiên chỉ có H herbacea L thể hiện hoạt tính

bẫy gốc tự do với giá trị IC50 là 32 µg/ml [13]

Cao chiết methanol của phần trên mặt đất loài H corymbosa (L.) Lamk được sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa trên nhiều mô hình in vitro khác nhau như: mô

hình DPPH, 2,2′-azinobis-3-ethylbenzothiozoline-6-sulfonic acid (ABTS), ferric

reducing power (FRP), ngăn ngừa gốc tự do OH và NO Kết quả chỉ ra H

corymbosa (L.) Lamk có hoạt tính chống oxy hóa mạnh trên mô hình DPHH,

ABTS, loại bỏ gốc tự do OH và NO với các giá trị tương ứng là 82, 130, 150 và

170 µg/ml [65] Ngoài ra, khi cho chuột uống cao chiết ethanol của H corymbosa

tại liều 400mg/kg thể trọng chuột trong 10 ngày nhận thấy nồng độ các enzym AST, ALT, LDH giảm [63] Trên mô hình gây tổn thương gan bởi CCl4, cao chiết ether,

n-butanol, ethanol của H corymbosa (L.) Lamk có tác dụng làm giảm tổn thương

gan trên chuột thí nghiệm [37] Nghiên cứu về khả năng bảo vệ gan trên chuột khi

sử dụng tác nhân D-galactosamin, nhóm nghiên cứu của Gupta R K đã chỉ ra cao

chiết methanol của H corymbosa (L.) Lamk có khả năng bảo vệ gan tương đương

với silymarin tại liều 200mg/kg thể trọng chuột [25]

Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tinh khiết phân lập từ chi Hedyotis

L cũng đã được nghiên cứu Trong thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa thông qua

sự ức chế enzym xanthine-oxidase, xanthinexanthine oxidase cytochrome C và hệ

thống TBA-MDA, các hợp chất flavonoid phân lập từ H diffusa Willd có tác dụng

ức chế tốt đối với quá trình peroxide hóa linoleic trên mô hình FTC và có khả năng bắt gốc tự do tương đương vitamine C trên mô hình DPPH Tuy nhiên, chỉ có hợp

chất (28) và (29) có khả năng bắt anion gốc superoxide (O2.-) [47], [62]

Hoạt tính bảo vệ gan của ba loài H diffusa Willd., H corymbosa (L.) Lamk

và Mollugo penthaphylla Linn., ở Trung Quốc đều có tên gọi là

“Peh-hue-juwa-chi-cao” đã được nghiên cứu trên chuột Kết quả cho thấy cao chiết từ H diffusa Willd

có tác dụng kháng viêm và làm giảm nồng độ của men gan SGOT, SGPT cũng như giảm bớt mức độ tổn thương gan sau khi tiêm hepatotoxin vào màng bụng chuột thí nghiệm cao nhất [43]

b Hoạt tính gây độc tế bào

Một nghiên cứu của Pandey K và cộng sự đã chỉ ra cao chiết ethanol từ lá H

corymbosa (L.) Lamk có hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư máu ở

người (k562) [57] Ngoài ra, cao chiết toàn cây H corymbosa (L.) Lamk còn có

hoạt tính cao trên tế bào MCF-7 với giá trị IC50 22,67 μg/ml [67]

Các hợp chất asperulosid (56), deacetylasperulosid (57) phân lập từ H diffusa Willd., oldenlandosid I (41) phân lập từ H corymbosa (L.) Lamk có tác dụng chống ung thư bạch cầu [54] Chrysotricin (2a, 2b), (24S)-ergostane-3β,5α,6β-triol

được phân lập từ H chrysotricha (Pal.) Merr có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư máu HL-60 và ung thư gan SK-HEP-1 trên in vitro [58], [75]

Hoạt tính gây độc tế bào của các anthraquinon phân lập từ H diffusa Willd

cũng đã được nghiên cứu Theo đó, 2-hydroxy-3-methylanthraquinon và 2-hydroxyanthraquinon ức chế protein tyrosine kinase v-scr và pp60scr, từ đó ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư SPC-1A, Bcap37 và HepG2 [66]; 2-hydroxy-3-methylanthraquinon còn thúc đẩy quá trình apoptosis ở tế bào THP-1 thông qua hoạt hóa caspase-8 [72] và ở tế bào U937 thông qua hoạt hóa caspase-3, p-p38MAPK và giảm biểu hiện của p-ERK1/2 [73], methylanthraquinon gây ra quá trình apoptosis ở tế bào MCF-7 bằng cách hoạt hóa Ca2+/calpain/caspase-4 [46]

methoxy-Một nghiên cứu gần đây của Dong Q và cộng sự đã chỉ ra cao chiết nước từ H

diffusa Willd làm giảm tác dụng của các thuốc điều trị ung thư như doxorubicin,

cyclophosphamide và docetaxel trên tế bào MCF-7, vì vậy khuyến cáo không nên

phối hợp cao chiết nước H diffusa Willd trong hóa trị liệu đối với ung thư vú [21]

Oleanolic acid (57) và ursolic acid (58) là hai triterpenoid phân lập từ cao

chiết của H diffusa Willd có khả năng làm giảm tỉ lệ sống sót của tế bào HL-60 sau

12 giờ ở liều > 50 µg/mL Tuy nhiên, khi kết hợp điều trị oleanolic acid hoặc ursolic acid với chiếu xạ ion hóa thì lại làm tăng khả năng sống sót của chúng [54] Một nghiên cứu khác cho thấy khả năng gây độc ấu trùng tôm nước mặn của

kaempferitrin và acid ursolic phân lập từ lá của loài H verticillata (L.) Lamk với

giá trị LD50 tương ứng là 21,9 và 29,8 ppm [28]

c Hoạt tính bảo vệ thần kinh

Năm 2001, Kim Y và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính bảo vệ thần kinh của

flavonol glycosid và iridoid glycosid có trong cao chiết methanol toàn cây H

diffusa Willd Kết quả cho thấy các flavonol glycosid và iridoid glycosid thể hiện

hoạt tính bảo vệ tế bào vỏ não chuột đã được gây tổn thương bằng L-glutamat tại liều 0,1-10 µM Nghiên cứu mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng sinh học, các nhà khoa học nhận thấy hợp phần catechol trong vòng B của dẫn xuất quercetin, sự

hiện diện của nhóm p-methoxy và hợp phần E-cinnamoyl trong các iridoid glycosid

đóng vai trò chính trong việc tăng hoạt tính chống oxy hóa cũng như khả năng bảo

vệ thần kinh của các flavonoid và iridoid [38]

d Hoạt tính kháng vi sinh vật

Hoạt tính kháng khuẩn được tiến hành bằng phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa thạch Trong thử nghiệm hoạt tính này, kết quả cho thấy

dịch chiết thân và rễ cây H capitellata Wall thể hiện tác dụng từ yếu đến trung bình trên các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B28, Bacillus subtilis B29,

Pseudomonas aeruginosa UI 60690 và Staphylococcus aureus kháng methicillin

(MRSA), trong khi dịch chiết lá thể hiện hoạt tính yếu, hướng đích với Bacillus

subtilis B28, Pseudomonas aeruginosa và MRSA Rễ của loài H dichotoma Koen

ex Roth cũng có khả năng ức chế trung bình với cả 4 chủng trên [13] Cao chiết

methanol toàn cây H corymbosa (L.) Lamk có hiệu quả trên cả vi khuẩn gram âm

và gram dương (Bacillus, Klebisella, Escherichia coli, Proteus, Staphylococcus

aureus và Pseudomonas) [31] Các saponin, nudicausin A-C [41] phân lập từ H nudicaulis có tác dụng kháng khuẩn yếu trên 2 chủng Bacillus subtilis M45 và H17

Dịch chiết toàn cây H corymbosa (L.) Lamk có tác dụng kháng nấm

Candida albicans và Aspergillus nigar [31] Bên cạnh đó, H corymbosa (L.) Lamk

còn có khả năng ức chế sự phát triển của ký sinh trùng sốt rét pf20 và

MRC-pf303 trong thử nghiệm in vitro và in vivo [50]

e Hoạt tính giảm đau, kháng viêm

Trên mô hình gây viêm ở chuột bằng carrageenan và histamin, cao chiết

methanol từ phần trên mặt đất cây H umbellata L có khả năng ức chế quá trình

viêm 40% so với chất chuẩn là ibuprofen (45%) tại mức liều 100mg/kg thể trọng

chuột [48] Cao chiết methanol toàn cây H puberula (G Don.) R Br ex Arn có tác

dụng giảm đau, kháng viêm trên mô hình gây viêm bằng phương pháp mâm nóng tại liều 400mg/kg thể trọng chuột [34] Một nghiên cứu đã chỉ ra cao chiết ethanol

từ H corymbosa (L.) Lamk có hoạt tính giảm đau trên 3 mô hình gây viêm khác

nhau, bao gồm phương pháp mâm nóng, gây viêm bằng acetic acid, gây viêm bằng formalin, sử dụng thuốc đối chiếu là ketorolac tại liều 250 và 500mg/kg thể trọng chuột, trong đó liều 500mg/kg thể trọng có hiệu quả cao hơn [22] Một báo cáo khác

cho thấy H nudicaulis (Roth.) Wight & Arn và H capitellata Wall thể hiện hoạt

tính kháng viêm vừa phải (khoảng 40%) thông qua khả năng ức chế NO tại nồng độ

100 µg/mL [13]

Trong thập niên 90, thử nghiệm lâm sàng của chế phẩm “Feibao syrup” – một loại siro từ dịch chiết của H diffusa Willd., Radix astragali và một số cây

thuốc khác được tiến hành trên trẻ em bị nhiễm trùng đường hô hấp Kết quả cho thấy, sau khi dùng thuốc, các triệu chứng đã được cải thiện rõ rệt và nếu có nhiễm bệnh trở lại thì triệu chứng ít nghiêm trọng và thời gian bị bệnh ngắn hơn [24]

f Hoạt tính chống loét

Trên mô hình gây loét ở chuột bằng aspirin, cho chuột uống cao chiết cồn và

cao chiết nước của H corymbosa (L.) Lamk tại liều 400mg/kg thể trọng trước khi

dùng aspirin 45 phút Kết quả cho thấy khả năng ức chế sự phát triển loét của mẫu thử lần lượt là 65,7% và 33% so với hiệu quả của thuốc đối chứng lansoprazol là 88,89% [12]

Một loại thuốc cổ truyền khác của Trung Quốc là “Xiao Wei Yan Powder –

XWYP”, trong thành phần có các loài H diffusa Willd., Smilax glabrae Roxb và Glycyrrhiza uralensis Fisch ex DC cũng đã được sử dụng để điều trị 138 ca bệnh

dị sản ruột (IM), 104 ca tăng sản không điển hình (AH) của bệnh viêm niêm mạc dạ dày mạn tính Thực nghiệm chỉ ra hiệu quả điều trị đối với IM, AH tương ứng là 91,3, 92,2 % so với nhóm chứng là 21,3 và 14,5 %, từ kết quả này cho thấy XWYP

là liệu pháp có tác dụng với IM và AH [45]

1.1.3.2 Công dụng

a Theo Y học cổ truyền trên thế giới

Các loài trong chi Hedyotis L được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới, đặc

biệt là các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới với nhiều công dụng khác nhau được

công bố Theo y học cổ truyền Malaysia, nhiều loài thuộc chi Hedyotis được sử

dụng để bồi bổ, hạ sốt, điều trị tiêu chảy và kiết lỵ Lá và rễ được sử dụng làm thuốc

đắp để điều trị vết bầm tím, gãy xương, thấp khớp, đau lưng Đặc biệt, thân và lá H

capitellata Wall được dùng để điều trị bệnh thận và phục hồi sau khi sinh [54]

Ở Ấn Độ, lá cây H diffusa Willd được dùng để chữa bệnh lậu, sốt, máu xấu

Lá và rễ cây H umbellata L có tác dụng trị hen, viêm khớp, lao phổi, lá còn được dùng để đắp vào vết thương do côn trùng cắn Toàn cây H herbacea L phơi khô,

tán thành bột mịn, phối hợp với mật ong trị sốt do viêm khớp, lá có tác dụng long

đờm Lá cây H biflora (L.) Lamk được dùng để hạ sốt, điều trị viêm nhiễm dạ dày

và trầm cảm Cây H corymbosa (L.) Lamk dùng để chữa sốt, sốt cách nhật, viêm

nhiễm dạ dày, trầm cảm, lo âu [67]

Ở Trung Quốc, hơn 20 loài thuộc chi này đã được sử dụng làm thuốc Phổ

biến nhất là H diffusa Willd và H corymbosa (L.) Lamk., được xem là thành phần chính có hoạt tính của một số loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc như "Xiao Wei Yan

Powder" và "Feibao syrup", có tác dụng chữa ung thư và nhiều bệnh khác Sản

phẩm từ H diffusa Willd được đưa ra thị trường có tên là "Bai Hua She She Cao", được bào chế dưới dạng viên nang gọi là "Hedyotis capsules", giúp ăn ngon, hỗ trợ

hệ thống miễn dịch và duy trì sự cân đối tự nhiên của cơ thể [54]

b Theo Y học cổ truyền nước ta

Nhiều loài thuộc chi Hedyotis L đã được sử dụng làm thuốc ở nước ta An điền tai (H auricularia L.) có tác dụng thanh nhiệt giải độc, chữa cảm sốt, đau họng, viêm ruột, trị kiết và nhuận tràng An điền hai hoa (H biflora (L.) Lamk.) trị suy nhược thần kinh, ngứa ngáy, đau dạ dày, hạ sốt An điền cỏ (H herbacea L.) chữa rắn cắn, hạ sốt, hen suyễn An điền leo (H scandens Roxb.) trị đau mắt, rễ trị kiết và vàng da H grandis (Pit.) Phamh trị nhức đầu, đau dạ dày Cỏ lưỡi rắn (H

corymbosa (L.) Lamk.) có tác dụng hạ sốt, chữa đau nhức xương khớp, đau lưng

Cỏ lữ đồng (H heynii R Br ex Wight & Arn) chữa viêm gan, thanh nhiệt, giải độc

Dạ cẩm (H capitellata var mollis Pierre ex Pit.) được dùng làm thuốc chữa viêm

loét dạ dày, chữa lở loét miệng, viêm họng, làm cho vết thương nhanh lên da non

Bách hoa xà thiệt thảo (H diffusa Willd.) có tác dụng thanh nhiệt giải độc, giảm

đau, tiêu ung tán kết, chữa viêm gan, viêm đường tiết niệu, viêm họng, lợi tiểu và trị ung nhọt, u bướu…[6]

 Nhận xét:

Chi Hedyotis L là một chi lớn trong họ Cà phê (Rubiaceae), tuy nhiên số loài

được nghiên cứu và khai thác làm thuốc còn rất hạn chế Hai loài được nghiên cứu

nhiều nhất về hoạt tính sinh học trong chi Hedyotis L là H diffusa Willd và H

corymbosa (L.) Lamk Các công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của dịch

chiết toàn phần và các hợp chất tinh khiết phân lập được từ các loài thuộc chi này chủ yếu của các tác giả ngoài nước

Ở Trung Quốc, một số loài Hedyotis L đã được phát triển thành các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thảo dược Trong khi đó, các loài thuộc chi Hedyotis L ở

Việt Nam phần lớn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa có nhiều nghiên

cứu về hoạt tính sinh học Vì vậy, trong tương lai, hoá thực vật và hoạt tính sinh học của chi này cần được tiếp tục nghiên cứu sâu rộng nhằm khám phá các cấu trúc và hoạt tính mới, làm sáng tỏ cơ chế tác dụng cũng như mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính của các hoạt chất

Chưa có công bố nào về tác dụng sinh học và độc tính của loài H pilulifera

(Pit.) T.N.Ninh trên thế giới và ở Việt Nam

1.2 Cây An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh

1.2.1 Vị trí phân loại

An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh (tên đồng nghĩa: Oldenlandia

pilulifera (Pit.)) thuộc chi An điền (Hedyotis L.), họ Cà phê (Rubiaceae), bộ Long

đởm (Gentianales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) và ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [6]

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Cây thân cỏ, mọc leo, cành to 4 mm, lúc non có lông mịn Lá có phiến thon,

to 2-4×1-1,5cm, nhọn, đáy tù, có lông mịn, gân phụ 3-4 cặp, cuống ngắn, lá bẹ có

5-6 lông gai Hoa đầu trên cọng, ở chót nhánh, đài có tai tròn dài, có lông mịn, vành

có ống dài, có lông dày dài ở cổ, nhị có chỉ dài 1,5 mm Quả nang 2×1,5 mm, hạt nhiều mỗi buồng, có màu đen [6]

Loài này được tìm thấy phân bố ở Việt Nam như Bắc Kạn, Thái Nguyên, Nghệ An, Hà Tĩnh, Lâm Đồng, Quảng Trị [6] Ngoài ra, cây An điền nón còn được ghi nhận có ở Lào [51]

1.2.3 Thành phần hóa học

Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu, chưa thấy các công bố nào về đặc điểm

vi học, thành phần hóa học, cũng như tác dụng sinh học của loài An điền nón ở Việt Nam và trên thế giới Như vậy việc tìm hiểu và nghiên cứu về cây An điền nón sẽ góp phần tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực tế cũng như làm phong phú hơn những hiểu biết về thực vật, hóa học, tác dụng sinh học của các cây thuộc chi

Hedyotis L., đồng thời bổ sung thêm thông tin vào cơ sở dữ liệu khoa học của loài

này cũng như chi này ở Việt Nam

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

tại huyện Vĩnh Linh, tỉnh Quảng Trị vào tháng 8 năm 2014 Tên khoa học được

giám định là Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh – Họ Cà phê (Rubiaceae) Tiêu bản

mẫu cây (kí hiệu VL-01) hiện được lưu giữ tại phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và tại Khoa Dược - Trường Đại học Y Dược Huế

-ảo quản ở nơi khô thoáng

2.1.2 Hóa chất, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu

 Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV

- Dung môi: Methanol, ethanol, butanol, ethyl acetate, chloroform,

n-hexane, aceton, toluen, acid formic, amoniac, nước cất, acid acetic Thuốc thử hiện màu: H2SO4 10%/ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc, Dragendorff

- Silica gel dùng cho sắc ký cột pha thường (Merck, Kielselgel 60, cỡ hạt là 0,020–0,040 và 0,040–0,063 mm), pha đảo (30–50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Dianion HP-20, Sephadex LH-20, silica gel dùng cho sắc ký lớp mỏng pha thường (Merck, Kielselgel 60 F254, 250 µm), pha đảo RP18 (Merck, RP C-18 F254)

 Máy móc thiết bị: Máy cô quay Yamoto, máy chiết siêu âm Elmasonic S100H, cân phân tích Sartorius CPA224S (độ chính xác 0,0001g), tủ sấy Memmert, kính hiển vi Nikon Eclipse E100, máy ảnh Nikon D5100, bình ngấm kiệt, bình gạn, cột sắc ký, máy hứng ống nghiệm và các dụng cụ thủy tinh khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

- Quan sát, chụp ảnh và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây tại thực địa Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản

- Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, đặc điểm bộ phận sinh sản, so sánh với tiêu bản lưu trữ và tài liệu phân loại thực vật [6] cùng với sự hỗ trợ của chuyên gia phân loại thực vật

- Nghiên cứu cấu tạo vi học: tiến hành phơi sấy khô thân và lá dược liệu Cắt

và nhuộm vi phẫu thân và lá, quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi Nghiền dược liệu thành bột mịn, soi bột tìm các đặc điểm của bột, chụp ảnh dưới kính hiển vi [9]

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính một số nhóm hợp chất hữu cơ trong dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học

Chiết xuất, phân tích sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dịch chiết toàn phần

từ bột phần trên mặt đất của cây An điền nón bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [1] Định tính các nhóm chất: glycosid tim, steroid, alcaloid, anthranoid, saponin, flavonoid, coumarin, acid amin, acid béo, iridoid, acid hữu cơ, tanin và đường khử

− Dịch chiết nước ngâm 24 giờ của dược liệu, loại tạp bằng chì acetat, dịch lọc lắc với CHCl3, chyển dịch chiết CHCl3 vào các ống nghiệm, tiến hành bốc hơi dung môi và thực hiện các phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann: Cắn CHCl3, thêm anhydric acetic, nghiêng thành ống nghiệm, thêm đồng lượng H2SO4, ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng xuất hiện vòng tím

đỏ, lắc nhẹ lớp chất lỏng màu trên có màu xanh lá cây  Sơ bộ kết luận có steroid

- Phản ứng Baljet: Cắn CHCl3, thêm ethanol 900 và thuốc thử Baljet (1 phần acid picric 1% và 9 phần NaOH 10%) thấy xuất hiện màu đỏ cam

- Phản ứng Legal: Cắn CHCl3, thêm ethanol 900, natrinitroprussiat 0,5% và NaOH 10% quan sát thấy xuất hiện màu đỏ nhưng chóng mất

- Phản ứng Keller-Kiliani: Cắn CHCl3, thêm ethanol 900 và FeCl3/CH3COOH, nghiêng thành ống nghiệm và thêm đồng lượng H2SO4, ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ, lắc nhẹ lớp chất lỏng màu trên có màu xanh lá cây

 Sơ bộ kết luận có glycosid tim

− Bột dược liệu, thêm H2SO4 1N, đun sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc, kiềm hóa với NH3 6N đến pH kiềm, chiết với CHCl3, gạn lấy lớp CHCl3, lắc với H2SO4 1N lấy lớp acid cho vào ống nghiệm, thực hiện các phản ứng sau:

- Thêm thuốc thử Mayer: xuất hiện tủa trắng hay vàng nhạt

- Thêm thuốc thử Bouchardat: xuất hiện tủa nâu

- Thêm thuốc thử Dragendorff: xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ

 Sơ bộ kết luận có alcaloid

− Bột dược liệu, thêm H2SO4 1N, đun sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc, chiết với CHCl3, gạn lấy lớp CHCl3 thực hiện phản ứng sau:

- Phản ứng Borntraeger: dịch chiết CHCl3, thêm NH3 10%, quan sát thấy lớp nước có màu đỏ sim, nếu lớp CHCl3 có màu vàng, tiếp tục nhỏ thêm NaOH 10%, lắc nhẹ, lớp CHCl3 mất màu vàng, lớp nước đậm màu hơn Dịch chiết CHCl3, thêm NaOH 10% thấy lớp nước có màu đỏ sim

- Phản ứng vi thăng hoa: cho một lượng dược liệu thích hợp vào chén sứ, đốt nhẹ trên bếp điện, đặt lên miệng chén một lam kính, trên lam kính có lót một miếng bông tẩm nước lạnh, sau một thời gian lấy lam kính soi dưới kính hiển vi thấy xuất hiện tinh thể

 Sơ bộ kết luận có anthranoid

 Sơ bộ kết luận có saponin

- Phản ứng cyanidin: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm ít bột magie kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, dịch chiết chuyển từ vàng sang đỏ

Ống 2: dịch chiết được đun sôi, để nguội, thấy dịch trong, khi thêm nước cất thấy xuất hiện tủa đục

− Phản ứng diazo hóa: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm NaOH 10%, đun sôi, để nguội, thêm thuốc thử diazo thấy dung dịch chuyển sang màu đỏ thẩm

 Sơ bộ kết luận có coumarin

− Phản ứng với thuốc thử Nynhydrin: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Nynhydrin 1% thấy xuất hiện màu đỏ

 Sơ bộ kết luận có acid amin

− Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng xuất hiện vết mờ

 Sơ bộ kết luận có acid béo

− Dịch chiết nước được tiến hành các phản ứng định tính sau:

− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Trim-Hill (10 ml

CH3COOH, thêm 1ml CuSO4 0,2% và 0,5 ml HCl đặc), đun nóng, xuất hiện màu xanh hoặc tím đỏ

 Sơ bộ kết luận có iridoid

− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm ít bột Na2CO3 xuất hiện bọt khí CO2.

 Sơ bộ kết luận có acid hữu cơ

− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 10%, xuất hiện tủa xanh đen

− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch đồng acetat 10%, xuất hiện tủa

− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch chì acetat 10%, xuất hiện tủa bông

 Sơ bộ kết luận có tanin

− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm thuốc thử Fehling, đun cách thủy, xuất hiện tủa đỏ gạch

 Sơ bộ kết luận có đường khử

2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất tinh khiết

- Chiết phân bố tạo các dịch chiết phân đoạn: Phân tán cao methanol trong nước, tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng

dần là n- hexane, chloroform, ethyl acetate Bốc hơi thu hồi dung môi dưới áp suất giảm lần lượt thu được cao phân đoạn n- hexane, chloroform, ethyl acetate và nước

tương ứng [2]

 Phân lập

− Định hướng các hợp chất cần phân lập và theo dõi quá trình phân lập bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) SKLM là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn vô cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần di chuyển với một tốc

độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau SKLM thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC - Alufolien 60G F254 (Merck,

ký hiệu 105715), RP18 (Merck) Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, dùng thuốc thử hiện màu là dung dịch

H2SO4 10%/ethanol

− Phân lập các hợp chất trong cây An điền nón bằng sắc ký cột Trong đó chất hấp phụ (pha cố định) được nhồi trong cột hình trụ và dung môi (pha động) được triển khai liên tục với nhiều loại hệ dung môi khác nhau Tùy theo chất được sử dụng trong cột mà ta có các cơ chế và tên gọi khác nhau: cột hấp phụ, cột phân bố, cột trao đổi ion Sắc ký cột được tiến hành trên cột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm và 0,020-0,040 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC RP-18 (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), nhựa trao đổi Dianion HP-20 và sắc ký cột rây phân tử Sephadex LH-20 [2], [8]

+ Sắc ký cột: là một dạng của sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, trong đó pha tĩnh được nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai một cách liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh Tùy theo tính chất của chất dùng làm cột mà sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố) Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150μm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt

phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ hoặc ống nghiệm ở phía dưới cột, rồi đem cô quay thu hồi dung môi, dùng sắc lý lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha thường thì hợp chất không hoặc kém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha đảo thì những hợp chất phân cực sẽ giải ly ra trước và những chất phân cực kém sẽ giải

ly ra sau

+ Sắc ký trao đổi ion: dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của phân tử pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích khi cho dung dịch này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh Các pha tĩnh này được gọi là chất trao đổi ion, bản chất của quá trình phân tách là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) của ionit Cơ chế xảy ra do mạng lưới của ionit là mạng không gian cao phân tử không đồng đều của các mạch liên kết hydrocarbon, khả năng trao đổi ion của ionit phụ thuộc lớn vào mạng lưới cấu trúc của ionit Có hai loại nhựa chính là cation (nhựa trao đổi cation)

và anion (nhựa trao đổi anion), ngoài ra còn có ionit lưỡng tính (trao đổi cả cation

và anion), ionit có nhóm tạo phức

+ Sắc ký rây phân tử: là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu cơ, kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel Mẫu được đưa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp và được pha động dẫn chạy qua cột Sự chia tách theo kích thước được thực hiện nhờ sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động

và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ ở trong các lỗ xốp của gel Khoảng kích thước lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kích thước phân tử được chia tách qua quá trình sắc ký Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm

Vt Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyển được dọc theo cột qua các khoảng trống giữa các hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ

lại, được rửa giải trong thể tích loại trừ Vo (thể tích trống) Sự chia tách theo kích thước phân tử xảy ra giữa thể tích trống và tổng thể tích thấm, chia tách hiệu quả thường được thực hiện ở hai phần ba đầu tiên của khoảng này

2.2.2.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc

 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-NMR và 2D-NMR), so sánh dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được với dữ liệu phổ có trong thư viện phổ và các tài liệu tham khảo [2], [3], [8]

− Cơ sở lý thuyết: Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ (1H, 13C )

được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái Nếu dùng một bức xạ điện

từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường) Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân

tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất

đó Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng (cộng hưởng từ hạt nhân quét) hoặc ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhận (cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR)) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân

tử Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0 Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0 - 14 ppm,

còn của carbon-13 là từ 0 - 240 ppm Tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton

− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều: Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hoá học của proton trong phân tử Các proton có môi trường hoá học khác nhau sẽ có chuyển dịch hoá học khác nhau Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung các cấp thông tin về môi trường hoá học của carbon Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon Nói cách khác, nó cho biết carbon đó là C, CH, CH2 hay

CH3, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử Kỹ thuật thường được sử dụng hiện nay là DEPT Trong phổ DEPT-135, carbon bậc IV không xuất hiện, carbon bậc II

là các đỉnh âm, C bậc III và bậc I là các đỉnh dương, ở phổ DEPT-90, chỉ còn các C bậc III là các đỉnh dương trong phổ

− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: các kỹ thuật phổ hai chiều còn cho thêm các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó (thường dùng hiện nay là HSQC), giữa proton của các carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương giữa proton và các carbon kế cận (thường dùng phổ HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY)

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1

H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học loài nghiên cứu

Mẫu cây nghiên cứu (ký hiệu VL-01) được thu hái ở huyện Vĩnh Linh, tỉnh Quảng Trị vào tháng 8 năm 2014

Đặc điểm là cây thân cỏ, mọc leo, dài 1-5m, đường kính thân 2-4mm, phân đốt dài 2,5-5cm, lúc non có lông mịn, lúc trưởng thành mặt ngoài có màu xám nhạt

Lá mọc đối từng cặp, cuống lá ngắn, kích thước 2-3mm Phiến lá thon, hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 4-5,5cm, rộng 1-1,5cm Mép lá nguyên, chóp lá nhọn, gốc lá

tù, có 3-4 cặp gân phụ Mặt trên lá màu xanh sẫm, mặt dưới màu lục nhạt, hai mặt trên và dưới lá đều có lông mịn Lá kèm có 5-6 lông gai, dài 1-3,5mm

Cụm hoa hình đầu, mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành xim phân đôi hay rẽ ba, mỗi xim có từ 10-20 hoa, cuống cụm hoa dài 1,2-1,5cm Tràng hợp hình ống, gồm 4 cánh hoa, màu trắng hoặc vàng nhạt Đài có tai tròn dài, có lông mịn, vành có ống dài, có lông dày dài ở cổ, nhị có chỉ dài 1,5mm Bộ nhụy gồm 2 lá noãn dính nhau thành bầu dưới Núm nhụy chẻ đôi

Cụm quả dài 4-5mm, rộng 7-9mm Quả nang tự mở, dài 2-3mm, rộng 2mm, hạt nhiều mỗi buồng, có màu đen, bề mặt sần sùi, dài khoảng 1-1,5mm

1,5-Mùa hoa: tháng 2-5, mùa quả: tháng 6-7

Dựa vào quan sát các đặc điểm hình thái, tham khảo tài liệu và sự hỗ trợ về chuyên môn của TS Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) tên khoa học của mẫu tiêu bản VL -

01 được giám định là: Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh thuộc họ Cà phê -

Rubiaceae, có tên Việt Nam phổ thông là An điền nón và tên khoa học đồng nghĩa

là Oldenlandia pilulifera (Pit.) Hình ảnh của cành mang lá và hoa, hình ảnh quả và

hạt của cây An điền nón được thể hiện ở hình 3.1 và hình 3.2

Hình 3.2 Ảnh hoa, quả, hạt của cây An điền nón

(Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh)

(a): cụm hoa (b): hoa (c): quả (d): hạt

Hình 3.1 Ảnh cành mang lá và hoa của cây An điền nón

(Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh)

(c)

(d)

(c)

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu cây An điền nón

a Đặc điểm vi phẫu thân (Hình 3.3)

Cắt vi phẫu thân, tẩy nhuộm kép, soi kính hiển vi quan sát thấy các đặc điểm: Mặt cắt ngang thân hình tròn, quan sát dưới kính hiển vi từ ngoài vào trong có: Biểu

bì (2) gồm một hàng tế bào có kích thước tương đối đồng đều, xếp đều đặn mang lông che chở đa bào (1) Mô dày (3) có 2-3 lớp tế bào hình đa giác thành dày xếp sát biểu bì Mô mềm vỏ (4) cấu tạo gồm 4-5 lớp tế bào thành mỏng, hình trứng xếp lộn xộn Libe (5) gồm 6-8 lớp tế bào nhỏ xếp sát nhau thành vòng libe sát phía ngoài vòng gỗ, trong libe có tinh thể canxi oxalat hình cầu gai rải rác hay tập trung thành từng đám Tầng phát sinh libe-gỗ (6) gồm 1-3 hàng tế bào nhỏ tạo thành vòng liên tục Mô gỗ (7) xếp sát nhau tạo thành vòng liên tục, các mạch gỗ xếp thành dãy Mô mềm ruột (8) cấu tạo từ những tế bào hình tròn hoặc đa giác, thành mỏng, phần trung tâm có các tế bào với kích thước lớn hơn Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai (9) tập trung nhiều ở mô mềm vỏ, rải rác ở libe và mô mềm ruột Trong mô mềm ruột còn xuất hiện tinh thể canxi oxalat hình kim (10)

b Đặc điểm vi phẫu lá (Hình 3.4 và Hình 3.5)

Cắt vi phẫu lá, tẩy nhuộm kép, soi kính hiển vi thấy các đặc điểm:

- Phần gân lá: gân trên hơi lồi, gân dưới lồi nhiều Biểu bì (2) trên và dưới là một

hàng tế bào hình trứng xếp liên tục đều đặn mang lông che chở đa bào (1) Lông che

chở đa bào cấu tạo bởi 2 – 7 tế bào, các tế bào càng gần đầu lông càng dài và nhỏ

dần Xếp sát dưới biểu bì là mô dày (3) có 3-4 hàng tế bào, là những tế bào hình

tròn hoặc đa giác, có thành dày ở góc, kích thước không đều Mô mềm (4) là những

tế bào hình đa giác hoặc hơi tròn, thành mỏng, kích thước không đều nhau Phần

gân chính có một cung libe gỗ, libe ở dưới, gỗ ở trên Libe (5) gồm các tế bào nhỏ,

xếp sát nhau tạo thành cung libe bao quanh cung gỗ, rải rác có tinh thể canxi oxalat

hình cầu gai (9) Mô gỗ (6) xếp sát nhau tạo thành cung gỗ, bó gỗ cấu tạo bởi các

mạch gỗ tương đối nhỏ, xếp thành hàng

- Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới đều gồm một hàng tế bào hình trứng

hoặc đa giác xếp đều đặn mang lông che chở đa bào tương tự phần gân lá Tế bào

biểu bì trên có kích thước lớn hơn tế bào biểu bì dưới Biểu bì dưới mang lông tiết

(10), lỗ khí (11) Mô giậu (7) nằm dưới lớp biểu bì trên, cấu tạo bởi một hàng tế bào

hình chữ nhật, xếp sít nhau và thẳng góc với biểu bì trên, chiếm khoảng 1/4 bề dày

phiến lá Mô khuyết (8) được cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng, có kích thước

không đều nhau, kéo dài theo chiều ngang để hở những khuyết nhỏ Tinh thể canxi

oxalat (9) hình cầu gai tập trung nhiều ở phiến lá, mật độ nhiều ở mô giậu, rải rác

trong mô khuyết

Hình 3.4 Ảnh vi phẫu lá cây An điền nón (vật kính 10)

Phần phiến lá

Phần gân lá

Hình 3.5 Ảnh vi phẫu lá cây An điền nón (vật kính 40)

3.1.3 Đặc điểm bột cây An điền nón