Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV.
- Dung môi: Methanol, ethanol, n-butanol, ethyl acetate, chloroform, n- hexane, aceton, toluen, acid formic, amoniac, nước cất, acid acetic... Thuốc thử hiện màu: H2SO4 10%/ethanol, dung dịch NH3 đậm đặc, Dragendorff.
- Silica gel dùng cho sắc ký cột pha thường (Merck, Kielselgel 60, cỡ hạt là 0,020–0,040 và 0,040–0,063 mm), pha đảo (30–50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Dianion HP-20, Sephadex LH-20, silica gel dùng cho sắc ký lớp mỏng pha thường (Merck, Kielselgel 60 F254, 250 µm), pha đảo RP18 (Merck, RP C-18 F254).
Máy móc thiết bị: Máy cô quay Yamoto, máy chiết siêu âm Elmasonic S100H, cân phân tích Sartorius CPA224S (độ chính xác 0,0001g), tủ sấy Memmert, kính hiển vi Nikon Eclipse E100, máy ảnh Nikon D5100, bình ngấm kiệt, bình gạn, cột sắc ký, máy hứng ống nghiệm và các dụng cụ thủy tinh khác...
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1.Nghiên cứu về thực vật
- Quan sát, chụp ảnh và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây tại thực địa. Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây và lưu giữ tiêu bản.
20
- Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, đặc điểm bộ phận sinh sản, so sánh với tiêu bản lưu trữ và tài liệu phân loại thực vật [6] cùng với sự hỗ trợ của chuyên gia phân loại thực vật.
- Nghiên cứu cấu tạo vi học: tiến hành phơi sấy khô thân và lá dược liệu. Cắt và nhuộm vi phẫu thân và lá, quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi. Nghiền dược liệu thành bột mịn, soi bột tìm các đặc điểm của bột, chụp ảnh dưới kính hiển vi [9].
2.2.2.Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất hữu cơ trong dƣợc liệu bằng phản ứng hóa học
Chiết xuất, phân tích sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong dịch chiết toàn phần từ bột phần trên mặt đất của cây An điền nón bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [1]. Định tính các nhóm chất: glycosid tim, steroid, alcaloid, anthranoid, saponin, flavonoid, coumarin, acid amin, acid béo, iridoid, acid hữu cơ, tanin và đường khử.
− Dịch chiết nước ngâm 24 giờ của dược liệu, loại tạp bằng chì acetat, dịch lọc lắc với CHCl3, chyển dịch chiết CHCl3 vào các ống nghiệm, tiến hành bốc hơi dung môi và thực hiện các phản ứng sau:
- Phản ứng Liebermann: Cắn CHCl3, thêm anhydric acetic, nghiêng thành ống nghiệm, thêm đồng lượng H2SO4, ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ, lắc nhẹ lớp chất lỏng màu trên có màu xanh lá cây Sơ bộ kết luận có steroid
- Phản ứng Baljet: Cắn CHCl3, thêm ethanol 900 và thuốc thử Baljet (1 phần acid picric 1% và 9 phần NaOH 10%) thấy xuất hiện màu đỏ cam.
- Phản ứng Legal: Cắn CHCl3, thêm ethanol 900, natrinitroprussiat 0,5% và NaOH 10% quan sát thấy xuất hiện màu đỏ nhưng chóng mất.
- Phản ứng Keller-Kiliani: Cắn CHCl3, thêm ethanol 900 và FeCl3/CH3COOH, nghiêng thành ống nghiệm và thêm đồng lượng H2SO4, ở mặt tiếp xúc hai chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ, lắc nhẹ lớp chất lỏng màu trên có màu xanh lá cây.
Sơ bộ kết luận có glycosid tim
− Bột dược liệu, thêm H2SO4 1N, đun sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc, kiềm hóa với NH3 6N đến pH kiềm, chiết với CHCl3, gạn lấy lớp CHCl3, lắc với H2SO4 1N lấy lớp acid cho vào ống nghiệm, thực hiện các phản ứng sau:
21
- Thêm thuốc thử Bouchardat: xuất hiện tủa nâu.
- Thêm thuốc thử Dragendorff: xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ.
Sơ bộ kết luận có alcaloid
− Bột dược liệu, thêm H2SO4 1N, đun sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc, chiết với CHCl3, gạn lấy lớp CHCl3 thực hiện phản ứng sau:
- Phản ứng Borntraeger: dịch chiết CHCl3, thêm NH3 10%, quan sát thấy lớp nước có màu đỏ sim, nếu lớp CHCl3 có màu vàng, tiếp tục nhỏ thêm NaOH 10%, lắc nhẹ, lớp CHCl3 mất màu vàng, lớp nước đậm màu hơn. Dịch chiết CHCl3, thêm NaOH 10% thấy lớp nước có màu đỏ sim.
- Phản ứng vi thăng hoa: cho một lượng dược liệu thích hợp vào chén sứ, đốt nhẹ trên bếp điện, đặt lên miệng chén một lam kính, trên lam kính có lót một miếng bông tẩm nước lạnh, sau một thời gian lấy lam kính soi dưới kính hiển vi thấy xuất hiện tinh thể.
Sơ bộ kết luận có anthranoid
− Dịch chiết ethanol 90o
được tiến hành các phản ứng định tính trong ống nghiệm sau:
- Phản ứng tạo bọt: lắc mạnh dịch chiết trong 5 phút, quan sát thấy bọt bền vững sau 15 phút.
Sơ bộ kết luận có saponin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phản ứng cyanidin: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm ít bột magie kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, dịch chiết chuyển từ vàng sang đỏ.
- Phản ứng với kiềm:
Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng, tiếp tục thêm nước cất thấy tủa tan và màu vàng dung dịch tăng.
Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô, để lên miệng lọ NH3 đặc thấy màu dịch chiết tăng.
− Phản ứng với FeCl3: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3, xuất hiện tủa xanh đen.
Sơ bộ kết luận có flavonoid
− Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Ống 1: dịch chiết được cho vào ống nghiệm, thêm NaOH 10%, đun sôi, để nguội, xuất hiện tủa đục màu vàng, thêm nước cất thấy dịch trong suốt, thêm HCl đặc xuất hiện tủa đục như ống 2.
22
Ống 2: dịch chiết được đun sôi, để nguội, thấy dịch trong, khi thêm nước cất thấy xuất hiện tủa đục.
− Phản ứng diazo hóa: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm NaOH 10%, đun sôi, để nguội, thêm thuốc thử diazo thấy dung dịch chuyển sang màu đỏ thẩm.
Sơ bộ kết luận có coumarin
− Phản ứng với thuốc thử Nynhydrin: cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Nynhydrin 1% thấy xuất hiện màu đỏ.
Sơ bộ kết luận có acid amin
− Nhỏ dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng xuất hiện vết mờ.
Sơ bộ kết luận có acid béo
− Dịch chiết nước được tiến hành các phản ứng định tính sau:
− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Trim-Hill (10 ml CH3COOH, thêm 1ml CuSO4 0,2% và 0,5 ml HCl đặc), đun nóng, xuất hiện màu xanh hoặc tím đỏ.
Sơ bộ kết luận có iridoid
− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm ít bột Na2CO3 xuất hiện bọt khí CO2.
Sơ bộ kết luận có acid hữu cơ
− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 10%, xuất hiện tủa xanh đen.
− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch đồng acetat 10%, xuất hiện tủa.
− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch chì acetat 10%, xuất hiện tủa bông.
Sơ bộ kết luận có tanin
− Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm thuốc thử Fehling, đun cách thủy, xuất hiện tủa đỏ gạch.
Sơ bộ kết luận có đường khử
2.2.2.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất tinh khiết
Chiết xuất
- Tạo dịch chiết toàn phần: Bột dược liệu được ngâm ở nhiệt độ phòng với methanol (10 lít/1lần/7 ngày × 3 lần), thu được dịch chiết toàn phần. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, thu được cao cắn methanol toàn phần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
23
- Chiết phân bố tạo các dịch chiết phân đoạn: Phân tán cao methanol trong nước, tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần là n- hexane, chloroform, ethyl acetate. Bốc hơi thu hồi dung môi dưới áp suất giảm lần lượt thu được cao phân đoạn n- hexane, chloroform, ethyl acetate và nước tương ứng [2].
Phân lập
− Định hướng các hợp chất cần phân lập và theo dõi quá trình phân lập bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM). SKLM là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn vô cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần di chuyển với một tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau. SKLM thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC - Alufolien 60G F254 (Merck, ký hiệu 105715), RP18 (Merck). Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, dùng thuốc thử hiện màu là dung dịch H2SO4 10%/ethanol.
− Phân lập các hợp chất trong cây An điền nón bằng sắc ký cột. Trong đó chất hấp phụ (pha cố định) được nhồi trong cột hình trụ và dung môi (pha động) được triển khai liên tục với nhiều loại hệ dung môi khác nhau. Tùy theo chất được sử dụng trong cột mà ta có các cơ chế và tên gọi khác nhau: cột hấp phụ, cột phân bố, cột trao đổi ion... Sắc ký cột được tiến hành trên cột silica gel pha thường (0,040- 0,063 mm và 0,020-0,040 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC RP-18 (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), nhựa trao đổi Dianion HP-20 và sắc ký cột rây phân tử Sephadex LH-20 [2], [8].
+ Sắc ký cột: là một dạng của sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, trong đó pha tĩnh được nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai một cách liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Tùy theo tính chất của chất dùng làm cột mà sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố). Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50- 150μm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt
24
phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt. Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ hoặc ống nghiệm ở phía dưới cột, rồi đem cô quay thu hồi dung môi, dùng sắc lý lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly. Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha thường thì hợp chất không hoặc kém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau. Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha đảo thì những hợp chất phân cực sẽ giải ly ra trước và những chất phân cực kém sẽ giải ly ra sau.
+ Sắc ký trao đổi ion: dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của phân tử pha tĩnh rắn với các ion trong dung dịch phân tích khi cho dung dịch này đi qua cột được nạp đầy pha tĩnh. Các pha tĩnh này được gọi là chất trao đổi ion, bản chất của quá trình phân tách là do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) của ionit. Cơ chế xảy ra do mạng lưới của ionit là mạng không gian cao phân tử không đồng đều của các mạch liên kết hydrocarbon, khả năng trao đổi ion của ionit phụ thuộc lớn vào mạng lưới cấu trúc của ionit. Có hai loại nhựa chính là cation (nhựa trao đổi cation) và anion (nhựa trao đổi anion), ngoài ra còn có ionit lưỡng tính (trao đổi cả cation và anion), ionit có nhóm tạo phức.
+ Sắc ký rây phân tử: là phương pháp chia tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng. Trong trường hợp pha động là một dung môi hữu cơ, kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel, còn trường hợp pha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel. Mẫu được đưa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp và được pha động dẫn chạy qua cột. Sự chia tách theo kích thước được thực hiện nhờ sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ ở trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thước lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kích thước phân tử được chia tách qua quá trình sắc ký. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm Vt. Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyển được dọc theo cột qua các khoảng trống giữa các hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ
25
lại, được rửa giải trong thể tích loại trừ Vo (thể tích trống). Sự chia tách theo kích thước phân tử xảy ra giữa thể tích trống và tổng thể tích thấm, chia tách hiệu quả thường được thực hiện ở hai phần ba đầu tiên của khoảng này.
2.2.2.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-NMR và 2D-NMR), so sánh dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được với dữ liệu phổ có trong thư viện phổ và các tài liệu tham khảo [2], [3], [8].
− Cơ sở lý thuyết: Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I) lẻ (1H, 13C...) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường). Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng (cộng hưởng từ hạt nhân quét) hoặc ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhận (cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR)) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân. Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0 - 14 ppm,
26
còn của carbon-13 là từ 0 - 240 ppm. Tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz... là theo tần số dùng để kích thích các proton.
− Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều: Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hoá học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hoá học khác nhau sẽ có chuyển dịch hoá học khác nhau. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung các cấp thông tin về môi trường hoá học của carbon. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon. Nói cách khác, nó cho biết carbon đó là C, CH, CH2 hay CH3, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Kỹ thuật thường được sử dụng hiện nay là DEPT. Trong phổ DEPT-135, carbon bậc IV không xuất hiện, carbon bậc II