3.2.1.Định tính các nhóm chất chính trong cây
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần trên mặt đất cây An điền nón bằng các phản ứng hóa học đặc trưng được trình bày trong bảng 3.1.
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận sơ bộ
1 Alcaloid Thuốc thử Mayer + + Có
Thuốc thử Dragendorff + + Thuốc thử Bouchardat + +
2 Saponin Hiện tượng tạo bọt + Có
3 Anthranoid Borntraeger − Không
Vi thăng hoa −
4 Coumarin Mở đóng vòng lacton − Không
Diazo hóa −
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong mẫu cây nghiên cứu
2 4a 4b 3 1 5 7 6 6
34
Chú thích: (+) : Phản ứng dương tính (++) : Phản ứng dương tính rõ (+ + +) : Phản ứng dương tính rất rõ (−) : Phản ứng âm tính
Nhận xét: Dựa vào kết quả định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa
học đặc trưng ở bảng 3.1 cho thấy phần trên mặt đất của cây An điền nón có sự hiện diện các nhóm chất gồm alcaloid, saponnin, flavonoid, iridoid, tanin, đường khử, acid béo và sterol; không có sự xuất hiện của các nhóm chất: anthranoid, coumarin, glycosid tim, acid hữu cơ và acid amin.
3.2.2.Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cây An điền nón
Sau khi thu mẫu, phần trên mặt đất của cây An điền nón được rửa sạch, thái nhỏ, phơi sấy khô và xay thành bột thô có khối lượng là 2,4 kg. Bột dược liệu được ngâm chiết 3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 7 ngày với 10 lít methanol/lần, gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 50–60oC thu được cao chiết methanol (100,5 g). Cao chiết này được phân tán trong 2 lít nước rồi chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần lần lượt là n-hexane (2 lít × 3 lần), chloroform (2 lít × 3 lần), ethyl acetate (2 lít × 3 lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết phân đoạn n-hexane (HPH, 40,6 g), chloroform (HPC, 19,2 g), ethyl acetate (HPE, 3,5 g) và nước (HPW, 20,8 g) tương ứng. Quá trình chiết xuất và tạo cao chiết được mô tả ở hình 3.8.
5 Flavonoid Cyanidin + Có
Kiềm (NaOH, NH3) +
FeCl3 5% +
6 Glycosid tim Liebermann + Không
Baljet −
Legal −
Keller-Kiliani −
7 Iridoid Thuốc thử Trim-Hill ++ Có
8 Tanin Gelatin 1% + + + Có
FeCl3 5% + + +
Đồng acetat + + +
Chì acetat + + +
9 Acid hữu cơ Na2CO3 − Không
10 Đường khử Thuốc thử Fehling A, B + + Có
11 Acid amin Ninhydrin 1% − Không
12 Acid béo Tạo vết mờ trên giấy lọc + Có
35
Hình 3.8.Sơ đồ tạo cao chiết phân đoạn từ phần trên mặt đất cây An điền nón Cao chiết HPW (20,8 g) được tách bằng cột Dianion HP-20, rửa giải theo gradient nồng độ bằng hệ dung môi methanol - nước (H2O 100%, MeOH 25%, MeOH 50%, MeOH 75%, MeOH 100%) thu được 4 phân đoạn, ký hiệu HPW1÷HPW4. Kiểm tra 4 phân đoạn này trên SKLM pha thường với hệ dung môi ethyl acetate - methanol (15:1) nhận thấy phân đoạn HPW2 có các vết tách tương đối rõ nên được ưu tiên phân lập trước. Cắn phân đoạn HPW2 (7,4 g) được hòa tan với một lượng methanol tối thiểu, thêm lượng silica gel vừa đủ, trộn đều, sau đó cất loại bỏ dung môi cho đến khi thu được bột khô tơi mịn. Bột này được đưa lên cột silica gel pha thường (cỡ hạt 0,040-0,063mm) đã được chuẩn bị bằng phương pháp nhồi cột ướt và ổn định bằng hệ dung môi rửa giải. Quá trình rửa giải sử dụng hệ dung môi ethyl acetate - methanol (15:1, v/v, 5 lít), hứng dịch rửa giải vào các bình tam giác và kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Những bình có cùng thành phần như nhau trên sắc ký lớp mỏng được gom chung, cất thu hồi dung môi đến khô thu được 8 phân đoạn, ký hiệu HPW2A÷HPW2H. Trên SKLM pha đảo với hệ dung môi
1. Ngâm chiết với MeOH (10 lít × 3 lần) 2. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
1. Phân tán trong 2 lít nước
2. Chiết lần lượt với n-hexane, chloroform, ethyl acetate 3. Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Cao chiết MeOH (100,5 g) Bột cây An điền nón (2,4 kg) Cao chiết n-hexane HPH (40,6 g) Cao chiết chloroform HPC (19,2 g) Cao chiết ethyl acetate HPE (3,5 g) Cao chiết nước HPW (20,8 g)
36
methanol - nước (1:2) nhận thấy phân đoạn HPW2D có số lượng vết chất ít, trong đó có 1 vết chất chính hàm lượng lớn. Do đó, phân đoạn HPW2D (1,5 g) được hòa tan trong lượng tối thiểu MeOH và được đưa lên cột pha đảo YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là methanol - nước (1:2, v/v, 1 lít) thu được 2 phân đoạn là HPW2D1 và HPW2D2. Tinh chế phân đoạn HPW2D2 (0,8 g) bằng cột Sephadex LH-20, khai triển với dung môi methanol (0,5 lít), thu được hợp chất HP3 (95,8 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng.
Tương tự, phân đoạn HPW2E (1,2 g) được tách thành 2 phân đoạn là HPW2E1 và HPW2E2 bằng cột YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là methanol - nước (1:2, v/v, 1,0 lít). Kiểm tra trên SKLM nhận thấy phân đoạn HPW2E2 có 1 vết chất chính màu xanh dương, được lựa chọn để phân lập tiếp. Cao của phân đoạn HPW2E2 (0,5 g) được hòa tan với lượng tối thiểu MeOH, tẩm với silicagel, cô quay thành bột khô tơi, sau đó được đưa lên sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải với hệ dung môi ethyl acetate - methanol (30:1, v/v, 1 lít), tiếp sau đó triển khai sắc ký cột pha đảo YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là aceton - methanol - nước (1:1:3, v/v/v, 0,5 lít) thu được hợp chất HP4 (6,1 mg) dưới dạng dầu màu trắng.
Cao chiết ethyl acetate (HPE, 3,5 g) được tách bởi cột Sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là methanol (1,5 lít) thu được 3 phân đoạn, ký hiệu HPE1÷HPE3. Theo dõi SKLM nhận thấy phân đoạn HPE có 2 vết chất chính với hàm lượng lớn nên định hướng tách hai vết chất này. Phân đoạn HPE2 (1,9 g) tiếp tục được tinh chế bằng cột pha đảo YMC RP-18, rửa giải bằng hệ methanol - nước (1:1, v/v, 1,5 lít), thu được 4 phân đoạn, ký hiệu HPE2A÷HPE2D. Kiểm tra trên SKLM thấy 2 vết chất chính tập trung trong phân đoạn HPE2C và tương đối sạch nên lựa chọn phân đoạn này để phân lập tiếp.
Phân đoạn HPE2C (0,5 g) được tách tiếp trên cột pha đảo YMC RP-18, rửa giải bằng hệ dung môi methanol - nước (1:2, v/v, 1,2 lít), thu được 3 phân đoạn, ký hiệu HPE2C1÷HPE2C3. Phân đoạn HPE2C1 (300,7 mg) được hòa tan trong lượng tối thiểu MeOH và đưa lên cột YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là aceton - methanol - nước (1:0,5:3, v/v/v, 0,5 lít) thu được 2 phân đoạn HPE2C1A và HPE2C1B. Quan sát SKLM nhận thấy, trong phân đoạn HPE2C1A có 1 vết chất
37
chính còn lẫn ít tạp phía dưới. Tiến hành tinh chế phân đoạn HPE2C1A (100,3 mg) trên cột Sephadex LH-20, dung môi khai triển là methanol (0,5 lít) và cột YMC RP- 18 với hệ dung môi rửa giải là aceton - methanol - nước (1:1:3, v/v/v, 0,2 lít) thu được hợp chất HP7 (20,4 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng. Triển khai SKLM pha đảo với hệ methanol - nước (2:1) thấy trong phân đoạn HPE2C1B có 1 vết chất chính màu xanh dương tương đối tròn nên phân đoạn HPE2C1B (50,8 mg) được tinh chế bằng cột YMC RP-18, rửa giải với hệ dung môi là methanol - nước (2:1, v/v, 0,5 lít) thu được hợp chất HP6 (7,2 mg) dưới dạng dầu màu vàng nâu.
Quá trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao chiết phân đoạn nước và ethyl acetate của cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh) được tóm tắt ở hình 3.9 và hình 3.10.
Hình 3.9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn nước của cây An điền nón
YMC RP-18
Aceton - methanol - nước (1:1:3, v/v/v)
S ep h a d ex LH -20 , MeOH 1 0 0 %
Ethyl acetate - methanol (30:1, v/v)
YMC RP-18, methanol - nước(1:2, v/v)
Dianion HP-20
Gradient MeOH - H2O(0:100100:0, v/v)
YMC RP-18, methanol - nước(1:2, v/v)
HPW2E1
HPW2E2A
Ethyl acetate - methanol (15:1, v/v)
HPW
Cao chiết nước (20,8 g)
HPW1 HPW2 HPW3 HPW4 HPW2A … HPW2D HPW2E … HPW2H HPW2D1 HPW2D2 HPW2E2 HPW2E2C HPW2E2B HP3 (95,8 mg) HP4 (6,1 mg)
38
Hình 3.11. Ảnh sắc ký đồ của 4 hợp chất phân lập được (Hệ dung môi: chloroform : methanol (8:1))
Hình 3.10. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetate của cây An điền nón
YMC RP-18, methanol - nước (1:1, v/v)
YMC RP-18
Aceton - methanol - nước (1:1:3, v/v/v)
HP7 (20,4 mg) HP6 (7,2 mg)
YMC RP-18, methanol - nước (1:2, v/v)
YMC RP-18
Methanol - nước (2:1, v/v)
HPE2A HPE2B HPE2C HPE2D
HPE2C1 HPE2C2 HPE2C3
YMC RP-18, aceton - methanol - nước (1:0,5:3, v/v/v)
HPE2C1A HPE2C1B
HPE2C1A1 HPE2C1A2
Sephadex LH-20, MeOH 100%
HPE
Cao chiết ethyl acetate (3,5 g)
HPE1 HPE2 HPE3
Sephadex LH-20, MeOH 100%
HP3: Asperuloside
HP4: Daphylloside
HP6: Paederosidic acid methyl ester
39
3.2.3.Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc từ cây An điền nón 3.2.3.1. Hợp chất số 1 (HP4)
Hợp chất HP4 được phân lập ra dưới dạng dầu màu trắng, tan tốt trong methanol. Triển khai trên sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi chloroform : methanol (8:1, v/v), hiện màu bằng H2SO4 10%/ethanol, cho một vết tròn màu xanh dương đậm, giá trị Rf = 0,25.
Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng sau đây: 2 proton olefin tại δH 7,67 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-3) và 6,04 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 1 nhóm methoxy tại δH 3,77 (3H, s, H-14) và 1 nhóm acetyl methyl tại δH 2,11 (3H, s, H-13). Tín hiệu proton của 1 nhóm dioxymethine tại δH 5,08 (1H, d, J = 9,0, H-1), 1 nhóm oxymethylene tại δH 4,81 (1H, H-10a) và 4,95 (1H, H-10b) cũng được ghi nhận. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn xuất hiện vùng tín hiệu của một đơn vị đường hexose với sự hiện diện của proton anomer tại δH 4,74 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′) gợi ý sự tồn tại của một hợp phần đường β trong cấu trúc của hợp chất HP4 (Bảng 3.2).
Phổ 13C-NMR và DEPT (90, 135) xuất hiện 19 tín hiệu carbon gồm 2 nhóm methyl, 2 nhóm methylene, 11 nhóm methine và 4 carbon bậc bốn. Trong đó, 13 carbon được gán cho phần aglycon và 6 carbon còn lại thuộc về phần đường. Phân tích phổ 13C-NMR của phần aglycon cho thấy các tín hiệu đặc trưng của 4 carbon olefin tại δC 155,3 (C-3), 108,1 (C-4), 131,8 (C-7) và 145,9 (C-8), 2 nhóm acyloxy tại δC 169,3 (C-11), 172,5 (C-12), 1 carbon oxymethylene tại δC 63,8 (C-10), 1 carbon dioxymethine tại δC 101,3 (C-1), 1 carbon oxymethine tại δC 75,4 (C-6),1 nhóm methoxy tại δC 51,8 (C-14) và 1 nhóm acetyl methyl tại δC 20,7 (C-13). Tín hiệu 6 carbon tại δC 100,6 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,6 (C-3′), 71,6 (C-4′), 77,9 (C-5′) và 62,9 (C-6′) cùng với tương tác COSY H-1 (δH 4,74)/H-2 (δH 3,25)/H-3 (δH 3,40)/H-4 (δH 3,28)/ H-5 (δH 3,30)/H-6 (δH 3,64, 3,87) đề nghị sự có mặt của hợp phần β-D-glucopyranosyl [64]. Các dữ kiện phổ 1D-NMR cho phép dự đoán hợp chất HP4 là một iridoid glucosid.
Các tương tác H-1 (δH 5,08)/H-9 (δH 2,66)/H-5 (δH 3,05)/H-6 (δH 4,84) trên phổ COSY chứng tỏ trật tự liên kết giữa C-1/C-9/C-5/C-6. Phân tích phổ HMBC cho thấy tương tác giữa H-3 (δH 7,67) và C-1 (δC 101,3)/C-4 (δC 108,1)/C-11 (δC
40
169,3), giữa H-7 (δH 6,04) và C-5 (δC 42,4)/C-6 (δC 75,4)/C-8 (δC 145,9)/C-9 (δC 46,2)/C-10 (δC 63,8). Các dữ kiện trên cho phép xây dựng khung iridoid với liên kết đôi lần lượt tại C-3/C-4 và C-7/C-8. Ngoài ra, các tương tác giữa H-3 (δH 7,67)/H- 14 (δH 3,77) và C-11 (δC 169,3) cho phép định vị nhóm carbomethoxy tại C-4 (δC 108,1). Bên cạnh đó, tương tác HMBC giữa H-10 (δH 4,81, 4,95) với C-7 (δC 131,8)/C-8 (δC 145,9)/C-9 (δC 46,3)/C-12 (δC 172,5) chỉ ra C-8 (δC 145,9) của khung iridoid và nhóm acetoxymethyl cùng liên kết với C-10 (δC 63,8). Vị trí liên kết của hợp phần β-D-glucopyranosyl tại C-1 của khung iridoid được xác nhận dựa vào tương tác HMBC giữa H-1′ (δH 4,74) và C-1 (δC 101,3) cũng như tương tác mạnh giữa H-1 (δH 5,08)/H-1′ (δH 4,74) trên phổ NOESY.
Tiếp đó, hóa lập thể của hợp chất này được xác định dựa vào phân tích dữ kiện phổ NOESY. Tương tác NOESY giữa H-5 (δH 3,05) và H-6 (δH 4,84), giữa H- 5 (δH 3,05) và H-9 (δH 2,66), giữa H-6 (δH 4,84) và H-9 (δH 2,66) chứng tỏ các proton này ở cùng một phía đối với mặt phẳng vòng. Kết hợp đối chiếu với tài liệu tham khảo [27] cho phép đề nghị định hướng β của các proton H-5, H-6, H-9. Hơn nữa, cấu hình α của nhóm 6-OH được khẳng định qua việc so sánh độ dịch chuyển hóa học của C-6 (δC 75,4) với giá trị tương ứng của tài liệu tham khảo [6α-OH: δC ~ 75 ppm, 6β-OH: δC ~ 82 ppm] [55]. Ngoài ra, hằng số tương tác giữa H-9 (δH 2,66) và H-1′ (δH 4,74) (J9,1 = 9,0 Hz) chứng minh quan hệ trans-diaxial giữa chúng hay định hướng α của H-1′. Điều này được củng cố bằng sự thiếu tương tác giữa H-5 (δH 3,05) và H-1′ (δH 4,74) trên phổ NOESY. Dựa vào các dữ kiện phổ và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc của hợp chất HP4 được thiết lập là 10-acetoxy-6α- 4-carbomethoxy-5βH,9βH-iridoid-1β-O-β-D-glucopyranoside. Hợp chất này còn có tên là Daphylloside.
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP4 và hợp chất tham khảo Vị trí δC# δCa,b DEPT δHa,c (J, Hz) HMBC (HC)
1 101,2 101,3 CH 5,08 d (9,0) 1′
3 155,4 155,3 CH 7,67 d (1,5) 1, 4, 11
4 108,1 108,1 C − −
5 42,4 42,4 CH 3,05 ddd (8,0, 6,0, 1,5) 1, 3, 4, 6, 9, 11
41 7 131,8 131,8 CH 6,04 d (1,5) 5, 6, 8, 9, 10 8 146,0 145,9 C − − 9 46,2 46,3 CH 2,66 dd (9,0, 8,0) 1, 5, 6, 7, 8 10 63,8 63,8 CH2 4, 81* 4,95 br d (15,0) 7, 8, 9, 12 11 169,3 169,3 C − − 12 172,5 172,5 C − − 13 20,8 20,7 CH3 2,11 s 12 14 52,8 51,8 CH3 3,77 s 11 1′ 100,6 100,6 CH 4,74 d (7,5) 1 2′ 74,9 74,9 CH 3,25* 3′ 78,6 78,6 CH 3,40* 4′ 4′ 71,6 71,6 CH 3,28dd (8,0, 8,0) 1′ 5′ 77,9 77,9 CH 3,30 m 1′, 2′, 3′, 4′ 6′ 63,0 62,9 CH2 3,64 dd (12,0, 6,0) 3,87 dd (12,0, 1,5)
#δC của Daphylloside [27], ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 Hz, *tín hiệu chập.
Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất HP4
42
3.2.3.2. Hợp chất số 2 (HP6)
Hợp chất HP6 được tách ra dưới dạng dầu màu vàng nâu, tan tốt trong methanol. Trên bản mỏng sắc ký với hệ dung môi chloroform : methanol (8:1, v/v), hiện màu bằng H2SO4 10%/ethanol, nung nóng bản thu được một vết hình cầu, màu xanh dương, giá trị Rf = 0,28.
Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng: 2 proton olefin tại δH 7,68 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-3) và 6,05 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 1 nhóm methoxy tại δH 3,76 (3H, s, H-14) và 1 nhóm thiomethyl tại δH 2,67 (3H, s, H-13). Ngoài ra, phổ 1H- NMR còn chỉ ra sự có mặt của 1 proton anomer tại δH 4,74 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′) đặc trưng cho 1 đơn vị đường có cấu hình β (Bảng 3.3).
Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy có 19 tín hiệu carbon gồm 2 nhóm methyl, 2 nhóm methylene, 11 nhóm methine và 4 carbon bậc bốn. Các tín hiệu đặc trưng của 2 liên kết đôi ba lần thế tại δC 155,4/108,1 (C-3/C-4), 132,4/145,4 (C-7/C-8), 2 nhóm acyloxy tại δC 169,3 (C-11), 172,9 (C-12), 1 carbon oxymethylene tại δC 66,3 (C-10), 1 carbon dioxymethine tại δC 101,3 (C-1), 1 carbon oxymethine tại δC 75,3 (C-6), 1 nhóm methoxy tại δC 51,8 (C-14) và 1 nhóm thiomethyl tại δC 13,5 (C-13) của phần aglycon cũng được ghi nhận. Ngoài ra, sự hiện diện của 1 đơn vị β-D- glucose được xác định dựa vào tín hiệu của một carbon anomer tại δC 100,7 (C-1′), 4 carbon oxymethine tại δC 74,9 (C-2′), 77,9 (C-3′), 71,6 (C-4′), 78,6 (C-5′) và 1 carbon oxymethylene tại δC 63,0 (C-6′). Các dữ kiện phổ 1D-NMR gợi ý hợp chất
HP6 cũng là một iridoid glucosid tương tự hợp chất HP4.
Các tương tác giữa H-1 (δH 5,08)/H-9 (δH 2,64)/H-5 (δH 3,06)/H-6 (δH 4,82)/H-7 (δH 6,05) trên phổ 1H-1H COSY, giữa H-3 (δH 7,68) và C-5 (δC 42,4)/C- 11(δC 169,3), giữa H-7 (δH 6,05) và C-5 (δC 42,4)/C-6 (δC 75,3)/C-9 (δC 46,3), giữa H-10 (δH 4,93, 5,12)/H-13 (δH 2,67) và C-12 (δC 172,9) trên phổ HMBC cho phép xác nhận khung iridoid với liên kết đôi lần lượt tại C-3/C-4, C-7/C-8, 1 nhóm carbomethoxy tại C-4 (δC 108,1) và 1 nhóm methylthiocarbonat tại C-10 (δC 66,3). Đặc biệt, liên kết glycoside của hợp phần glucopyranosyl tại C-1 (δC 101,3) của khung iridoid được chỉ ra trên phổ HMBC thông qua tương tác giữa H-1 [δH 5,08 (d,
43
Cấu hình tương đối của hợp chất HP6 được thiết lập dựa vào việc phân tích dữ kiện phổ NOESY và hằng số tương tác vicinal của các proton. Theo đó, các proton H-5 (δH 3,06), H-6 (δH 4,82) và H-9 (δH 2,64) được xác định ở cùng mặt phẳng β dựa vào các tương tác từng đôi một xuất hiện trên phổ NOESY (Hình 3.15) kết hợp so sánh độ dịch chuyển hóa học của C-5, C-6, C-9 với các giá trị tham khảo [20]. Trong khi đó, định hướng α của H-1 (δH 5,08) được khẳng định qua hằng số tương tác J9,1 (9,0 Hz).
Nhìn chung, hợp chất HP6 có cấu trúc giống với hợp chất HP4. So với HP4, hợp chất HP6 thiếu 1 nhóm acetoxymethyl tại C-10 (δC 66,3) mà thay vào đó là 1 nhóm methylthiocarbonat. Điều này được thể hiện rất rõ qua sự thay đổi mạnh giá trị độ dịch chuyển hóa học của nhóm methyl C-13 [δC 20,7 (HP4), 13,5 (HP6)]. Dựa vào các dữ kiện phổ và so sánh với tài liệu tham khảo [20], cấu trúc của hợp chất HP6 được khẳng định là Paederosidic acid methyl ester. Giá trị độ dịch chuyển hóa học của C-11, C-12 được gán lại so với giá trị tham khảo dựa trên việc phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HMBC. Cụ thể, hai proton H-10 (δH 4,93, 5,12) tương tác với C-12 (δC 172,9) nhưng không tương tác với C-11 (δC 169,3), ngược lại proton của nhóm methoxy H-14 (δH 3,76) chỉ có tương tác với C-11 (δC 169,3).
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP6 và hợp chất tham khảo