Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - HÀ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU TÁI SINH IN VITRO VÀ TẠO CÂY CA CAO (Theobroma cacao L.) CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS LÊ THỊ THU HIỀN PGS.TS NÔNG VĂN HẢI HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu tôi, thực hướng dẫn khoa học TS Lê Thị Thu Hiền PGS TS Nông Văn Hải Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả khác Phần lại chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận án Hà Hồng Hạnh i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Thu Hiền - Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nông Văn Hải - Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ trình thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo cán thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, đặc biệt tập thể cán nghiên cứu Phòng Đa dạng sinh học hệ gen quan tâm giúp đỡ, góp ý cho thực hoàn thành luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Chu Hoàng Hà cán Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực số thí nghiệm Phòng Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, Th.S Bùi Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi mặt, hỗ trợ thực thủ tục cần thiết để hoàn thành chương trình học tập nghiên cứu Nghiên cứu sinh Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình người thân bên tôi, chăm sóc, động viên giúp yên tâm học tập nghiên cứu Tôi gửi lời cảm ơn tới bạn bè đồng nghiệp động viên, khích lệ thực luận án Luận án thực khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu tái sinh in vitro tạo ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen” thuộc Chương trình Trọng điểm phát triển ứng dụng Công nghệ sinh học lĩnh vực Nông nghiệp Phát triển nông thôn đến năm 2020 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn quản lý Tôi xin trân trọng cảm ơn trợ giúp quý báu chuyên viên Vụ Khoa học Công nghệ Môi trường, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Tác giả luận án ii MỤC LỤC MỤC LỤC III DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT IX MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CA CAO 1.1.1 Nguồn gốc vị trí phân loại ca cao 1.1.2 Đặc điểm hình thái ca cao 1.1.3 Ý nghĩa kinh tế ca cao 1.1.4 Bệnh nấm ca cao 1.1.5 Phát triển ca cao Việt Nam 11 1.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO 12 1.2.1 Nghiên cứu di truyền chọn tạo giống ca cao theo phương pháp truyền thống 12 1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học 15 1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE 26 1.3.1 Nguồn gốc cấu trúc chitinase tự nhiên 26 1.3.2 Chitinase số đối tượng sinh vật 27 1.3.3 Vai trò gen mã hóa chitinase 29 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 32 2.1 VẬT LIỆU 32 2.1.1 Mẫu thực vật 32 2.1.2 Các vector chủng vi khuẩn 32 2.13 Hóa chất, thiết bị 33 2.2 PHƯƠNG PHÁP 34 2.2.1 Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro ca cao 34 iii 2.2.2 Các phương pháp liên quan đến phân lập gen mã hóa chitinase thiết kế vector chuyển gen thực vật 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 48 3.1 TÁI SINH IN VITRO MỘT SỐ DÒNG CA CAO NGHIÊN CỨU 48 3.1.1 Thu thập mẫu 48 3.1.2 Xác định khả tạo mô sẹo từ nhị lép cánh hoa dòng ca cao 49 3.1.3 Xác định khả nhân sinh khối mô sẹo từ nhị lép cánh hoa dòng ca cao………………………………………………………………………………… 51 3.1.4 Cảm ứng tạo phôi soma sơ cấp 53 3.1.5 Cảm ứng tạo phôi soma thứ cấp 55 3.1.6 Tạo ca cao in vitro hoàn chỉnh 57 3.1.7 Khả thích ứng ca cao in vitro vườn ươm 60 3.1.8 Quy trình tái sinh in vitro ca cao 62 3.2 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT 63 3.2.1 Nhân tạo dòng vùng gen TcChi1_W 63 3.2.2 Thiết kế vector biểu thực vật mang gen mã hóa chitinase sử dụng hệ vector pCB301 70 3.2.3 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp chứa vector biểu thực vật thiết kế 73 3.2.4 Kiểm tra hoạt động cấu trúc gen chuyển thuốc 75 3.3 CHUYỂN GEN CHỈ THỊ GUS/GUSPLUS VÀO CÂY CA CAO 77 3.3.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn, vector thích hợp thời gian lây nhiễm vi khuẩn cho chuyển gen vào ca cao 78 3.3.2 Chuyển gen thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8 80 3.3.3 Phân tích đánh giá mô, chuyển gen 81 3.4 CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀO CÂY CA CAO 84 3.4.1 Biến nạp gen mã hóa chitinase vào dòng ca cao TD8 84 3.4.2 Kiểm tra ca cao chuyển gen phương pháp sinh học phân tử 87 iv 3.4.3 Quy trình chuyển gen thông qua A tumefaciens vào dòng ca cao TD8 89 CHƢƠNG 4: THẢO LUẬN 91 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 102 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 105 SUMMARY PHỤ LỤC v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bệnh nấm ca cao……………………………………………… 10 Hình 2.1 Một số vector sử dụng nghiên cứu…………………………… 32 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm……………………………………………… 34 Hình 2.3 Hoa ca cao…………………………………………………………… 35 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D TDZ đến tỷ lệ tạo phôi từ nhị lép số dòng ca cao nghiên cứu…………………………………… 50 Hình 3.2 Ảnh hưởng kiểu gen đến tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép…………… 51 Hình 3.3 Mô sẹo từ nhị lép cánh hoa môi trường PCG SCG……… 52 Hình 3.4 Tỷ lệ tạo phôi sơ cấp từ nhị lép cánh hoa ca cao………………… 54 Hình 3.5 Tái sinh phôi sơ cấp từ nhị lép cánh hoa ca cao………………… 54 Hình 3.6 Tỷ lệ tạo phôi soma thứ cấp từ trục mầm mầm……………… 56 Hình 3.7 Tái sinh phôi soma thứ cấp từ trục mầm mầm phôi soma sơ cấp dòng ca cao TD8………………………………………………… 57 Hình 3.8 Tỷ lệ phôi soma sơ cấp tạo chồi rễ…………………………… 59 Hình 3.9 Tạo chồi rễ từ phôi soma sơ cấp thứ cấp…………………… 59 Hình 3.10 Tỷ lệ sống loại giá thể khác sau 20 ngày…… 60 Hình 3.11 Các ca cao in vitro môi trường cây…………………… 61 Hình 3.12 Quy trình tái sinh in vitro ca cao……………………………… 62 Hình 3.13 Tách chiết DNA tổng số từ ca cao dòng TD3…………………… 63 Hình 3.14 Sản phẩm nhân vùng gen TcChi1-W xử lý pJET+TcChi1-W/1, pJET+TcChi1-W/7 pJET+TcChi1-W/13 BglII gel agarose 0,8%………………………………………………………… 65 Hình 3.15 Trình tự nucleotide vùng gen TcChi1-U phân lập từ dòng ca cao TD3…………………………………………………………………… 67 Hình 3.16 So sánh trình tự protein TcChi1 ca cao dòng TD3 với số trình tự chitinase lớp I số loài thực vật khác…………… 69 Hình 3.17 Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 sản phẩm xử lý BglII NotI plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 gel agarose 0,8% 70 vi Hình 3.18 Sơ đồ thiết kế vector pRTRA+TcChi1……………………………… 71 Hình 3.19 Kết thiết kế pRTRA+TcChi1 gel agarose 0,8%………… 72 Hình 3.20 Sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1…………………………… 72 Hình 3.21 Sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 HindIII gel agarose 0,8%…………………………………………………………………… 73 Hình 3.22 Sản phẩm PCR gen TcChi1 từ pCB301+TcChi1………………… 74 Hình 3.23 Điện di sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 từ thuốc lá……………… 75 Hình 3.24 Sản phẩm RT-PCR từ mRNA dòng thuốc chuyển gen TcChi1…………………………………………………………… 76 Hình 3.25 Cây thuốc chuyển gen…………………………………………… 77 Hình 3.26 Các mảnh mô ca cao dòng TD8…………………………………… 78 Hình 3.27 Biến nạp gen thị gus/gusplus vào dòng ca cao TD8…………… 81 Hình 3.28 Biểu gen gus/gusplus mô ca cao chuyển gen………… 82 Hình 3.29 Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ dòng ca cao chuyển gen………………………………………………………………… 84 Hình 3.30 Tái sinh từ phôi soma dòng ca cao TD8 chuyển gen TcChi1 86 Hình 3.31 Các ca cao chuyển gen………………………………………… 86 Hình 3.32 Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ ca cao chuyển gen………………………………………………………………… 87 Hình 3.33 Sản phẩm PCR nhân phần đoạn CaMV35S+TcChi1+cmyc+ KDEL+tNOS……………………………………………………… 87 Hình 3.34 Vùng T-DNA vector pCB301+TcChi1………………………… 89 Hình 3.35 Lai Southern mẫu ca cao chuyển gen………………………… 89 Hình 3.36 Quy trình chuyển gen vào ca cao……………………………… 90 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Nhân mô sẹo sơ cấp môi trường SCG………………………… 52 Bảng 3.2 Nhân mô sẹo thứ cấp môi trường SCG……………………… 56 Bảng 3.3 Tỷ lệ phôi soma thứ cấp tạo chồi rễ…………………………… 58 Bảng 3.4 Lựa chọn chủng vi khuẩn A tumefaciens vector biểu thích hợp cho chuyển gen ca cao………………………………………… 79 Bảng 3.5 Lựa chọn thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens thích hợp cho chuyển gen ca cao…………………………………………………… 80 Bảng 3.6 Khả tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi rễ mẫu 82 ca cao biến nạp gen thị………………………………………… Bảng 3.7 Khả tạo mô sẹo, tạo phôi soma, tạo chồi rễ mẫu ca cao TD8 biến nạp gen mã hóa chitinase………………………… viii 85 This project was carried out with the following activities: (1) Investigate in vitro plant regeneration ability of nine elite cacao genotypes cultivated in Vietnam; (2) Characterize the antifungal gene TcChi1 isolated from cacao leaves and construct a plant expression vector containing TcChi1 gene; (3) Establish a genetic transformation protocol for selected elite cacao genotypes of Vietnam based on the reportable gus/gusplus gene; (4) Produce transgenic cacao plants carrying TcChi1 gene and analyze transgenic plants at molecular level Based on the tissue culture method of Li et al (1998), Maximova et al (2002, 2003), an in vitro plant regeneration protocol for Vietnamese cacao clones was optimized Un-opened immature buds of nine elite cacao clones TD1, TD2, TD3, TD4, TD5, TD6, TD7, TD8, and TD9 were colected from Cacao Nursery Garden of University of Agriculture and Forestry, Ho Chi Minh City, cold-stored and transfered to our laboratiory in Hanoi within a day After surface-sterilization, staminodes and petals were removed from the flowers and used as initial explants for somatic embryogenesis Various culture conditions such as nutrition and plant growth regulator concentrations were evaluated for their ability to stimulate somatic embryogenesis and somatic embryo production of selected cacao clones The results revealed that somatic embryogenesis have occurred in staminodes and petals of all selected cacao clones with ratios ranging from 80 - 91.5% for staminodes, and 55.2 82.5% for petals The primary somatic embryos were also observed directly from staminodes/petals of TD1, TD3, TD5, TD7, TD8 and TD9 clones in 2.6% to 44.0% Among them, TD8 clone is the best by getting responses from 44% of cultured staminodes The number of somatic embryos per explant ranged from to Callus formation could be seen in only three clones (TD3, TD5, and TD8) An average number of - 15 secondary somatic embryos can be obtained from hypocotyl and cotyledon of primary somatic embryos of five clones (TD1, TD3, TD5, TD7, and TD8) Both primary and secondary somatic embryos were efficiently germinated into plantlets with survival ratio of 85% In short, an in vitro plant generation procedure of cacao clones cultivated in Vietnam was established and can be used for genetic transformation of cacao in Vietnam An Agrobacterium-mediated genetic transformation protocol has been set up for TD8 cacao clone using reportable genes (gus or gusplus) under the control of promoter CaMV35S or FMV34S, cotyledon fragments of mature primary somatic embryos, and A tumefaciens strain EHA105 Cotyledons of TD8 primary somatic embryos were cut into small pieces, shaken in thermomixer for 30s, and incubated for 48 h with A tumefaciens at optical density (OD600nm) of 1.0 Treated explants were co-cultivated for days on SCG medium (secondary callus growth) containing mg/l 2.4-D and 0.05 mg/l BAP, 0.1 mM acetosyringone at 25°C in the dark After, explants were moved to SCG medium supplemented with 50 mg/l kanamycin for nptII selection, and 200 mg/l moxalactam for eliminating A tumefaciens Secondary somatic embryos were induced by transferring of primary somatic embryo derived embryogenic callus onto embryo development medium (ED) containing 30 g/l sucrose, g/l glucose, 50 mg/l kanamycin, 200 mg/l moxalactam Secondary somatic embryos were matured on the embryo development in light medium (EDL) containing 0.3 g/l KNO3, ml/l amino acid, 10 g/l sucrose, 20 g/l glucose, 50 mg/l kanamycin, 200 mg/l moxalactam Geminated plantlets were transferred to the root development and maintenance medium (RD) containing 0.3 g/l KNO3, g/l sucrose and 10 g/l glucose, 50 mg/l kanamycin, 200 mg/l moxalactam The putative transgenic plants were screened using PCR for gus/gusplus or nptII genes The efficient of our genetic transformation protocol was confirmed by three transgenic plants expressing gusplus gene In order to production of transgenic cacao plants resistant to fungal disease, TcChi1 gene encoded chitinase was isolated from TD3 clone, constructed in the plant expression binary vector pCB301 under regulation of CaMV35S promoter, and transferred into TD8 cacao clone using an Agrobacterium-mediated genetic transformation protocol Two transgenic plants were obtained and confirmed by PCR and Southern hybridization analysis In conclussion, our study successfully established the procedure for in vitro plant regeneration of cacao clones cultivated in Vietnam, in which TD8 gives the highest number of somatic embryo formation/explant The genetic transformation protocol was also build up for one cacao clone and transgenic cacao plants harboring gene encoded chitinase class I TcChi1 were produced The stable insertion of TcChi1 in genome of transgenic plant was confirmed by Sourthern hybridization The obtained transgenic plants will be futher analysis for antifungal activity This is the first report on in vitro plant regeneration and genetic transformation of cacao in Vietnam PHỤ LỤC Phụ lục 1: Công thức môi trƣờng nuôi cấy in vitro ca cao Dưới công thức số môi trường yếu sử dụng nuôi cấy in vitro ca cao thông qua phát sinh phôi soma từ nụ hoa chưa trưởng thành từ trục mầm (Li et al., 1998; Maximova et al., 2003) Môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo (Primary callus growth medium - PCG) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) ml/l Glucose 20 g/l Glutamine 250 mg/l Myo-Inositol 100 mg/l 2,4-D (1 mg/ml) ml/l TDZ (0,2 mg/ml) 25 µl/l Chuẩn pH 5,8 dung dịch KOH 1M Phytagel g/l Khử trùng 121ºC, atm 15 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW macro A, DKW macro B, DKW micro giữ 40C pha hàng tháng  Dung dịch vitamin DKW giữ -200C dạng dung dịch, pha - tháng  Các dung dịch gốc 2,4D TDZ giữ 40C pha tháng Môi trƣờng nhân mô sẹo (Secondary callus growth medium - SCG) Thành phần Hàm lượng Muối McCown’s 2,3 g/l Vitamin B5 (1000x stock) ml/l Glucose 20 g/l Nước dừa 50 ml/l 2,4-D (1 mg/ml) ml/l Kinetin (1 mg/ml) 300 µl/l Chuẩn pH 5,7 dung dịch KOH 1M Phytagel 2,2 g/l Khử trùng 121ºC, atm 18 phút Ghi chú:  Muối McCown (Sigma M-6774) hút ẩm mạnh Vì thế, cần phải bảo quản 4°C tủ sấy  Dung dịch vitamin B5 bảo quản -20°C ống ml chuẩn bị lại sau - tháng  Kinetin chuẩn bị lại sau - tháng Lọc vô trùng dung dịch màng lọc (0,2µm) bổ sung vào môi trường khử trùng (55°C)  Dung dịch gốc 2,4-D bảo quản 4°C chuẩn bị lại sau tháng Môi trƣờng cảm ứng tạo phôi (Embryo development medium - ED) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) ml/l Glucose g/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH 5,7 dung dịch KOH 1M Phytagel g/l Khử trùng 121ºC, atm 18 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng bảo quản 4ºC làm lại sau tháng  Dung dịch vitamin DKW bảo quản -20ºC ống nhỏ làm lại sau - tháng Môi trƣờng chuyển dạng phôi tạo (Embryo development in light medium - EDL) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) ml/l KNO3 0,3 g/l Dung dịch gốc AA (1000X) ml/l Glucose 20 g/l Sucrose 10 g/l Chuẩn pH 5,8 dung dịch KOH 1M Phytagel 1,75 g/l Khử trùng 121ºC, atm 18 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng bảo quản 4ºC làm lại sau tháng  Dung dịch vitamin DKW bảo quản -20ºC ống nhỏ làm lại sau - tháng  Dung dịch gốc AA (Amino acid) 1000X bảo quản -20ºC ống nhỏ làm lại sau - tháng Môi trƣờng hình thành phát triển rễ (Root development and maintenance medium - RD) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 50 ml/l DKW đa lượng B (10X) 50 ml/l DKW vi lượng (100X) ml/l DKW vitamin (1000X) 0,5 ml/l Glucose 10 g/l KN03 0,3 g/l Sucrose g/l Chuẩn pH 5.7 dung dịch KOH 1M Phytagel 1,75 g/l Khử trùng 121ºC, atm 15 phút Ghi chú:  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng bảo quản 4ºC làm lại sau tháng  Dung dịch vitamin DKW bảo quản -20ºC ống nhỏ làm lại sau tháng Môi trƣờng cảm ứng (Induction medium - IM) Thành phần Hàm lượng DKW đa lượng A (10X) 100 ml/l DKW đa lượng B (10X) 100 ml/l DKW vi lượng (100X) 10 ml/l DKW vitamin (1000X) ml/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH 5,8 dung dịch KOH 1M Khử trùng 117ºC, atm 15 phút Acetosyringone 0,1 mM Proline 0,13 mM Môi trƣờng MS (Murashige and Skoog medium) Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) 10 ml/l MS V (10X) 10 ml/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH 5,8 dung dịch NaOH 1M Agar g/l Khử trùng 117ºC, atm 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau bổ sung agar, đun sôi bình, chia vào bình tam giác khử trùng Môi trƣờng CT1 Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) 10 ml/l MS V (10X) 10 ml/l BAP (1 mg/l) mg/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH 5,8 dung dịch NaOH 1M Agar g/l Khử trùng 117ºC, atm 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau bổ sung agar, đun sôi bình, chia vào bình tam giác khử trùng Môi trƣờng CT2 Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) 10 ml/l MS V (10X) 10 ml/l BAP (1 mg/l) mg/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH 5,8 dung dịch NaOH 1M Agar g/l Khử trùng 117ºC, atm 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau bổ sung agar, đun sôi bình, chia vào bình tam giác khử trùng Bổ sung 500 mg/l cefotaxime, 50 mg/l kanamycin 10 Môi trƣờng CT3 Thành phần Hàm lượng MS I (10X) 20 ml/l MS II (10X) 10 ml/l MS III (10X) 10 ml/l MS IV (10X) 10 ml/l MS V (10X) 10 ml/l NAA (1 mg/l) 0,1 mg/l Sucrose 30 g/l Chuẩn pH 5,8 dung dịch NaOH 1M Agar g/l Khử trùng 117ºC, atm 15 phút Ghi chú: Bổ sung tất thành phần (trừ agar), chỉnh pH, sau bổ sung agar, đun sôi bình, chia vào bình tam giác khử trùng Bổ sung 250 mg/l cefotaxime, 50 mg/l kanamycin Phụ lục 2: Công thức chuẩn bị dung dịch gốc Các thành phần dung dịch DKW đa lƣợng A & B (10X) Dung dịch A Thành phần Hàm lượng NH4NO3 14.16 g/l Ca(NO3)2.4H2O 19.69 g/l Dung dịch B Thành phần Hàm lượng CaCl2.2H2O 1.49 g/l (Luôn bổ sung đầu tiên) K2SO4 15.59 g/l MgSO4.7H2O 7.4 g/l KH2PO4 2.65 g/l Ghi chú:  Dung dịch A cần khuấy lâu dung dịch B Dung dịch A trở nên bảo quản tủ lạnh  Các dung dịch gốc DKW đa lượng A, DKW đa lượng B, DKW vi lượng bảo quản 4ºC làm lại sau tháng Sử dụng 100 ml loại cho lit môi trường Các thành phần dung dịch DKW vi lƣợng (100X) Thành phần Hàm lượng Zn(NO3)2.6H2O 1.7 g/l MnSO4.H2O 3.34 g/l CuSO4.5H2O 0.025 g/l H3BO3 0.48 g/l Na2MoO4.2H2O 0.039 g/l FeSO4.7H2O 3.38 g/l Na-EDTA 4.54 g/l Ghi chú: Dung dịch bảo quản 4ºC làm lại sau tháng Sử dụng 10 ml cho lit môi trường Dung dịch DKW vitamin (1000X) Thành phần Hàm lượng (100 ml) Myo-Inositol 10 g Thiamine-HCl 0.2 g Nicotinic acid 0.1 g Glycine 0.2 g Ghi chú: Dung dịch bảo quản -20ºC ống nhỏ làm lại sau - tháng Sử dụng ml cho lit môi trường Dung dịch B5 vitamin (1000X) Thành phần Hàm lượng (50 ml) Myo-Inositol 5g Nicotinic acid 50 mg Pyridoxine 50 mg Thiamine 500 mg Ghi chú: Dung dịch bảo quản -20ºC ống nhỏ làm lại sau - tháng Sử dụng ml cho lit môi trường Dung dịch amino acid gốc (1000X) Thành phần Hàm lượng (100 ml) Arginine 43.55 mg Glycine 18.76 mg Leucine 32.8 mg Lysine 45.65 mg Tryptophane 51.05 mg Ghi chú: Dung dịch bảo quản -20ºC ống nhỏ làm lại sau - tháng Sử dụng ml cho lit môi trường Các dung dịch điều hòa sinh trƣởng thực vật gốc Theo dẫn pha hóa chất mua Hãng Sigma 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (dung dịch gốc mg/ml): Mỗi tháng chuẩn bị lần 25 ml hay 50 ml Hòa bột ml (tổng 25 ml) 10 ml (tổng 50 ml) ethanol 95%, sau dẫn nước Milli Q đến thể tích cuối Dung dịch bảo quản 4oC Kinetin (dung dịch gốc mg/ml): Kinetin hòa tan khoảng ml NaOH 1N dẫn nước Milli Q đến thể tích cuối Thidiazuron [1-Phenyl-3(1,2,3-Thiadiazol-5-YL)Urea]: Thidiazuron gốc pha với nồng độ 0.2 mg/ml tháng lần bảo quản 4oC mg Thidiazuron hòa ml DMSO sau hòa ml nước Milli Q để đạt thể tích cuối ml Sau đó, dung dịch chia sang ống nhỏ (1 ml/ống) Phụ lục 3: Thành phần hóa chất pha đệm chiết DNA tổng số từ ca cao Hóa chất Tris-HCl pH 8.0 NaCl EDTA pH 8.0 βmercaptoethanol PVP CTAB Nước 1M 6M 0,5 M Nồng độ đệm chiết 100 mM 1,4 M 20 mM ml 6,97 ml 1,2 ml ml 11,63 ml ml 100% 0,2% (v/v) 60 µl 100 µl 0,6 g 0,6 g đến 30 ml 1g 1g đến 50 ml Nồng độ gốc Dạng bột 1% Dạng bột 2% Thể tích đệm Thế tích đệm chiết (30 ml) chiết (50 ml) * Chú ý: Cần hòa tan hoàn toàn PVP CTAB nước nhiệt độ 60°C khoảng 15 phút trước thêm thành phần khác đệm chiết Phụ lục Thành phần hóa chất tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn Môi tường LB Thành phần g/l cao nấm men; 10 g/l trypton; 10 g/l NaCl; 15 g/l agar YEP 10 g/l cao nấm men; 10 g/l pepton; g/l NaCl; 15 g/l agar; 5g/l sacarose; mM MgSO4.7H2O Dung dịch I 25 mM Tris-Cl (pH 8,0); 10 mM EDTA; 50 mM glucose Dung dịch II 0,2 N NaOH; 1% (w/v) SDS Dung dịch III M potassium; M acetate;4°C Dung dịch rửa Agrobacterium 0,5 M NaCl; 50 mM Tris-Cl; 20 mM EDTA; 0,1% sarkosyl Dung dịch GTE 50 mM glucose; 25 mM Tris-Cl; 10 mM EDTA, pH 8,0 Môi trường lỏng SOC g cao nấm men; 20 g trypton; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgSO4; 10 mM MgCl2; 20 mM glucose Phụ lục 5: Một số dòng ca cao vô tính đƣợc cấp phép Việt Nam TD1 Tên thông dụng: TD - Cha mẹ: PA 35 x NA 32 - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Xanh nhạt Vỏ - Rãnh: vừa - Mặt vỏ: Ghồ ghề - Dạng: Tròn chóp - Màu sắc: Trái non: Xanh; Trái chín: Vàng - Kích cỡ trái: rộng 1777,8 mm; đường kính 75,4 mm - Chỉ số trái: 24,6 Hạt: - 1,11 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 37 - 42 - Hạt/trái: 37,75 - Hàm lượng chất béo (%): 57,7 Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Mẫn cảm với nấm Phytophthora palmivora - Mẫn cảm với nấm Corticium salmonicolor Năng suất (hạt khô/ha): 2,4 TD2 Tên thông dụng: TD - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Xanh nhạt Vỏ - Rãnh: Trung bình - Mặt vỏ: Ghồ ghề - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Xanh; Trái chín: Vàng - Kích cỡ trái: dài 187,8 mm; đường kính 72,1 mm - Chỉ số trái: 23,2 Hạt: - 1,10 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 38 - 40 - Hạt/trái: 38,5 - Hàm lượng chất béo (%): 56,6 Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Mẫn cảm với nấm Phytophthora palmivora - Mẫn cảm với nấm Corticium salmonicolor Năng suất (hạt khô/ha): 2,2 TD3 Tên thông dụng: TD - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Đỏ Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - có sáp - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Đỏ đậm; Trái chín: Đỏ cam - Kích cỡ trái: dài 150 mm; đường kính 100 mm - Chỉ số trái: 23,2 Hạt: - 1,27 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 42 - Hạt/trái: 40 - Hàm lượng chất béo (%): 57 Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Kháng nấm Phytophthora palmivora Năng suất (hạt khô/ha): 2,6 TD5 Tên thông dụng: TD - Cha mẹ: UAWA 18*T>>S>15/43.352 - Dạng thân: Bán thẳng đứng - Màu lá: đỏ nhạt Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Đỏ; Trái chín: Vàng - Chỉ số trái: 24 Hạt: - 1,09 g/Hạt - Hạt/trái: 38,2 - Hàm lượng chất béo (%): 56,9 Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Mẫn cảm với nấm Phytophthora palmivora - Mẫn cảm với nấm Corticium salmonicolor Năng suất (hạt khô/ha): 2,8 TD6 Tên thông dụng: TD - Dạng thân: Thẳng đứng - Màu lá: Đỏ sáng Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Đỏ xanh; Trái chín: Đỏ cam - Kích cỡ trái: dài 187,8 mm; đường kính 72,1 mm - Chỉ số trái: 23 Hạt: - 1,04 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 32,8 - Hạt/trái: 42 - Hàm lượng chất béo (%): 53 Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Kháng nấm Phytophthora palmivora Năng suất (hạt khô/ha): 2,4 TD8 Tên thông dụng: TD - Dạng hình: Thẳng đứng - Màu lá: Xanh nhạt Vỏ - Rãnh: Nông - Mặt vỏ: Láng - Đầu nhọn - Màu sắc: Trái non: Xanh; Trái chín: Vàng - Kích cỡ tái: dài 187,8 mm; đường kính 72,1 mm - Chỉ số trái: 23 Hạt: - 1,04 g/Hạt - Hạt khô/hạt ướt (% trọng lượng): 32,8 - Hạt/trái: 42 - Hàm lượng chất béo (%): 53 Kháng nấm - Kháng nấm Oncobasidium theobromae - Kháng nấm Phytophthora palmivora Năng suất (hạt khô/ha): 2,4 (Nguồn: Agrifood Consulting International, Inc., 2008) Phụ lục 6: Tỷ lệ dòng ca cao vô tính đƣợc sản xuất Việt Nam năm 2008 (%) Dòng VT TD1 TD2 TD3 TD5 TD6 TD8 TD10 Bến Tre 6.2 4.9 19.9 19.5 15.9 7.2 14.9 Tiền Giang - Bình Phƣớc 11.9 7.4 14.0 14.0 8.6 7.7 - 12.9 - TD14 2.6 TD7 TD9 0.4 TD11 8.6 Các dòng TD khác Tổng 100.0 cộng Tỉnh Bà Rịa – Đăk Vũng Tàu Lăk 8.4 6.1 30.0 17.8 30.0 16.5 20.0 16.7 20.0 7.7 Đăk Nông 7.8 7.8 29.0 21.7 7.8 7.8 Đồng Nai 0.1 5.0 15.8 25.0 7.5 15.8 Tổng cộng 4.6 5.2 18.3 21.1 12.3 10.6 9.9 7.8 15.8 14.2 6.8 4.5 2.7 2.7 9.3 3.5 4.1 - 10.5 - 15.1 - 7.7 0.6 0.6 4.3 6.7 - - - 0.6 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 - 100.0 (Nguồn: Agrifood Consulting International, Inc., 2008) Phụ lục Ảnh hƣởng kiểu gen đến tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép cánh hoa số dòng ca cao nghiên cứu Tên mẫu TD1 TD2 TD3 TD4 TD5 TD6 TD7 TD8 TD9 Số mảnh mô Nhị Cánh 1220 1012 553 458 3021 1507 406 311 3623 1410 470 408 958 735 11150 7024 555 509 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Nhị Cánh 91,5 ± 1,32 80,3 ± 1,04 89,7 ± 1,75 82,5 ± 0,50 80,0 ± 0,50 72,2 ± 1,25 90,3 ± 0,76 69,5 ± 1,32 91,2 ± 1,04 63,5 ± 1,32 91,7 ± 1,04 55,2 ± 1,60 85,2 ± 0,76 70,0 ± 2,00 88,0 ± 0,43 82,2 ± 0,76 89,2 ± 0,91 58,3 ± 1,08 Phụ lục Kết tái sinh phôi soma sau năm nuôi cấy môi trƣờng ED Tên mẫu Tỷ lệ mô sẹo tạo phôi (%) Nhị Cánh TD1 10,5 ± 0,76 TD2 TD3 TD4 TD5 TD6 22,0 ± 2,29 38,0 ± 1,50 0 2,6 ± 1,32 8,5 ± 1,80 TD7 11,5 ± 1,50 TD8 44,0 ± 1,50 12,1 ± 1,44 TD9 4,7 ± 0,41 Phụ lục Tái sinh phôi soma thứ cấp sau tháng nuôi cấy môi trƣờng ED Tên mẫu Tỷ lệ tạo phôi thứ cấp (%) TD1 TD3 Trục mầm 7,0 ± 1,32 13,0 ± 2,64 Lá mầm 10,0 ± 1,32 25,5 ± 0,86 TD5 12,0 ± 0,86 35,3 ± 2,36 TD7 5,0 ± 1,80 13,0 ± 1,32 TD8 18,6 ± 0,85 48,5 ± 2,50 Phụ lục 10 Khả tạo chồi rễ từ phôi soma sơ cấp Tên mẫu Tỷ lệ phôi tạo chồi (%) (trên môi trƣờng EDL) 60,5 ± 2,29 64,0 ± 1,52 63,3 ± 1,63 57,5 ± 1,86 80,0 ± 1,12 53,8 ± 2,08 TD1 TD3 TD5 TD7 TD8 TD9 Tỷ lệ phôi rễ (%) (trên môi trƣờng RD) 40,9 ± 2,15 50,3 ± 1,09 54,5 ± 1,13 37,5 ± 1,32 75,0 ± 2,10 34,6 ± 0,76 Phụ lục 11 Tỷ lệ sống loại giá thể khác sau 30 ngày Loại giá thể Đất + trấu Đất + xơ dừa TD1 80 ± 1,52 60 ± 1,75 TD3 85 ± 1,15 70 ± 1,25 Tỷ lệ sống (%) TD5 TD7 82± 70 ± 1,90 1,75 70 ± 60 ± 2,10 1,45 TD8 85± 1,34 71± 1,22 TD9 75± 2,05 55± 1,80 [...]... trình tái sinh in vitro và tạo cây ca cao chuyển gen Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng được quy trình tái sinh in vitro ở 1 - 2 dòng ca cao đang được canh tác ở Việt Nam; - Xây dựng được quy trình chuyển gen và tạo được cây ca cao chuyển gen chỉ thị gus/gusplus và gen kháng nấm 3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh in vitro của 9 dòng ca cao đang được canh tác ở Việt Nam; - Nghiên cứu. .. lợi và thành công đã đạt được trong lĩnh vực công nghệ sinh học, những khó khăn có thể gặp phải trong quá trình nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, trong đó có cây ca cao bằng công nghệ sinh học ở nước ta là không nhỏ Trên cơ cở lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu tái sinh in vitro và tạo cây ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen 2 Mục tiêu nghiên cứu. .. đặc điểm của gen mã hóa chitinase (TcChi1) từ cây ca cao ở Việt Nam và thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen mã hóa chitinase; - Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị gus/gusplus vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam; - Nghiên cứu chuyển gen TcChi1 vào 1 - 2 dòng ca cao ở Việt Nam và phân tích các dòng ca cao được chuyển gen 4 - Đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên ở Việt Nam, các dòng ca cao thương mại... chọn tạo giống 1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học 1.2.2.1 Tái sinh in vitro cây ca cao Giống như nhiều loài cây trồng khác, ca cao được nghiên cứu tái sinh nhằm mục đích nhân nhanh và nhiều các giống mới, bảo tồn nguồn gen, ứng dụng trong công tác chọn tạo giống biến đổi gen, tạo vật liệu nguồn để lai ghép giống Tuy nhiên, đối với cây ca cao, việc xây dựng quy trình nuôi cấy mô in vitro. .. Florez et al., 2015) 1.2.2.2 Nghiên cứu tạo cây ca cao chuyển gen Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị vào cây ca cao: Trên đối tượng cây ca cao, những công bố đầu tiên cho thấy sự mẫn cảm của tế bào ca cao với A tumefaciens và sự biến đổi của các tế bào ca cao (Purdy, Dickstein, 1989; Sain et al., 1994) Việc sử dụng phương pháp bắn gen (bắn các hạt vàng vận tốc cao để gắn DNA vào tế bào thực vật nuôi cấy)... tượng ca cao (Perry et al., 2000; Santos et al., 2002) Hai nghiên cứu đã cho thấy gen ngoại lai có thể được đưa vào các tế bào ca cao, tuy nhiên, không có nghiên cứu nào thành công trong việc tái sinh cây ca cao chuyển gen Hiện nay, với mục đích thiết lập và tối ưu hóa quy trình chuyển gen kết hợp hệ thống tái sinh in vitro từ phôi soma của ca cao, đã có một số nghiên cứu sử dụng các gen chỉ thị như gen. .. hiệu quả phát sinh phôi soma và tạo cây ca cao được công bố vẫn còn rất thấp Nhiều nhóm nghiên cứu đã gặp khó khăn trong tạo rễ và vi nhân giống in vitro (Flynn et al., 1990; Figueira, Janick, 1993) Ngoài ra, khả năng ứng dụng của các công nghệ này trong nhân giống vô tính ca cao chưa cao khi phần lớn các dòng ca cao không thể phát sinh phôi soma (Pence, 1989) Việc tái sinh in vitro cây ca cao thông qua... dòng ca cao được cấp phép sử dụng rộng rãi được nhập nội và tuyển chọn từ Malaysia trong Chương trình do Hiệp hội Ca cao 2 Thế giới (The World Cocoa Foundation) hỗ trợ Chính phủ và nhiều tổ chức quốc tế rất quan tâm phát triển cây ca cao nhằm đưa Việt Nam vào bản đồ ca cao thế giới, trở thành quốc gia giàu tiềm năng về cung cấp ca cao Hiện nay chưa có nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen vào cây ca cao. .. Năm 2009, nhóm nghiên cứu tại Brazil thông qua gen chỉ thị gus đã nhận thấy ảnh hưởng tích cực của các polyamine và kháng sinh diệt khuẩn ß-lactam đến quá trình phát sinh phôi soma trong quá trình chọn lọc và tái sinh cây ca cao chuyển gen Các kháng sinh ß-lactam timentin và meropenem sử dụng chọn lọc A.tumefaciens có thể sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen vào ca cao Kháng sinh hygromycin sử dụng cho... đích vào cây ca cao: Từ những nghiên cứu ban đầu trên các gen chỉ thị, một số nhóm nghiên cứu đã tiến hành các nghiên cứu liên quan nhằm chuyển một số gen đích như các gen kháng nấm vào cây ca cao, nhằm nâng cao chất lượng và hạn chế những tác hại do sâu bệnh gây ra Đối với gen đích, Maximova và đồng tác giả (2006) đã biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase lớp I (TcChi1) trong cây ca cao dòng PSU-Scavina ... Nghiên cứu tái sinh in vitro tạo ca cao (Theobroma cacao L.) chuyển gen Mục tiêu nghiên cứu Đề tài đặt mục tiêu chung xây dựng quy trình tái sinh in vitro tạo ca cao chuyển gen Mục tiêu cụ thể:... trình tái sinh in vitro - dòng ca cao canh tác Việt Nam; - Xây dựng quy trình chuyển gen tạo ca cao chuyển gen thị gus/gusplus gen kháng nấm Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thăm dò khả tái sinh in. .. thị sinh học để đánh giá khả phát sinh phôi mô ca cao (Zhang et al., 2014; Florez et al., 2015) 1.2.2.2 Nghiên cứu tạo ca cao chuyển gen Nghiên cứu chuyển gen thị vào ca cao: Trên đối tượng ca cao,