3.2. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT
3.2.1 Nhân và tạo dòng vùng gen TcChi1_W
Nguồn vật liệu để nhân gen mã hóa chitinase là lá cây ca cao tươi của dòng TD3 được thu thập tại TP. Hồ Chí Minh. Vật liệu lá sau khi thu thập được bảo quản trong tủ lạnh -20°C cho đến khi được dùng để tách chiết DNA tổng số. Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng 2% CTAB và 1% PVP. Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm DNA tổng số được tách chiết khá sạch và nguyên vẹn, không lẫn tạp chất, ít bị phân hủy, đạt yêu cầu cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 3.13).
Hình 3.13. Tách chiết DNA tổng số từ lá ca cao dòng TD3 A: Mẫu lá ca cao của dòng ca cao thương mại TD3;
B: 1 - 3. DNA tổng số của dòng ca cao TD3 ở các nồng độ khác nhau
3.2.1.2 Nhân vùng gen TcChi1-W
Toàn bộ vùng gen TcChi1-W hoàn chỉnh được phân lập từ DNA tổng số dòng TD3, sử dụng cặp mồi là TcChi1-W_F và TcChi1-W_R. Trình tự cặp mồi được thiết kế chứa toàn bộ trình tự gen TcChi1 bao gồm vùng 5’ không dịch mã (5’ UTR), vùng tín hiệu TATA, ba exon mã hóa toàn bộ protein chitinase, hai intron, vùng tín hiệu poly(A) và vùng 3’ không dịch mã (3’ UTR) (từ vị trí 1 đến 1856 của trình tự U30324.1) (1856 bp). Toàn bộ gen được nhân và tạo dòng trong vector nhằm lưu giữ gen và sử dụng cho các nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện.
Để thu được sản phẩm PCR đặc hiệu, các thành phần phản ứng và nhiệt độ bắt cặp khác nhau của mồi đã được tối ưu. Ở nhiệt độ lý thuyết là 55ºC có xuất hiện đoạn gen có kích thước mong muốn 1,8 kb, tuy nhiên, sản phẩm PCR chưa đặc hiệu với các băng phụ có kích thước khoảng 1,7 kb và 1,2 kb. Kết quả phân tích cho thấy, nhiệt độ ghép mồi tối ưu là 57ºC trong thời gian 1 phút, thấp hơn Tm của cả hai mồi (TcChi1-W_F Tm = 64,2ºC, TcChi1-W_R Tm = 58,6ºC) và sản phẩm PCR là đặc hiệu, chỉ gồm 1 băng có kích thước khoảng 1,8 kb đúng như tính toán lý thuyết. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR cho thấy đã thu được băng 1,8 kb đặc hiệu và nồng độ đảm bảo cho các quá trình gắn nối vào vector tạo dòng và xác định trình tự (Hình 3.14).
3.2.1.3 Tạo dòng vùng gen TcChi1-W
Sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme đầu bằng, do đó được gắn vào vector tạo dòng đầu bằng pJET1.2. Vùng cắt gắn đa vị trí MCS của vector có chứa điểm nhận biết của nhiều enzyme như BglII, XhoI, XbaI… phục vụ cho việc kiểm tra các dòng tái tổ hợp. Ngoài ra, trên vector mang trình tự hai mồi pJET1.2 xuôi và ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR cho phép nhân đoạn PCR được gắn vào sau tạo dòng với số lượng lớn, phục vụ cho việc xác định trình tự gen.
Hình 3.14. Sản phẩm nhân vùng gen TcChi1-W và xử lý pJET+TcChi1-W/1, pJET+TcChi1-W/7 và pJET+TcChi1-W/13 bằng BglII trên gel agarose 0,8%
A.Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm PCR nhân vùng gen TcChi1-W B. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Plasmid pJET+TcChi1-W/1;
2. Plasmid pJET+TcChi1-W/7; 3. Plamis pJET+TcChi1-W/13
Kết quả, chúng tôi đã thu được các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang đoạn gen hay không, một số khuẩn lạc đã được tách chiết DNA plasmid, kiểm tra kích thước sơ bộ của DNA plasmid bằng điện di trên gel agarose và kiểm tra kích thước của đoạn chèn bằng xử lý với enzyme BglII. Enzyme BglII có ở 2 đầu trên vùng MCS của vector pJET1.2 và enzyme này cũng được gắn vào 2 đầu của gen mã hóa chitinase. Khi cắt bằng enzyme này, sản phẩm theo tính toán lý thuyết là 2 băng. Một băng có kích thước ~ 2,9 kb tương ứng với kích thước của vector pJET1.2 và băng còn lại có kích thước khoảng 1,8 kb tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR. Kết quả xử lý enzyme BglII ở ba dòng pJET+TcChi1-W/1, pJET+TcChi1-W/7 và pJET+TcChi1-W/13 trên Hình 3.14 cho thấy vùng gen chitinase đã được tạo dòng thành công trong vector pJET1.2. Các vector tái tổ hợp trên được tách chiết với lượng lớn và được tinh sạch để sử dụng trong phản ứng xác định trình tự gen.
3.2.1.4 Xác định trình tự nucleotide vùng gen TcChi1-W
Để khẳng định chính xác đoạn chèn trong các vector tái tổ hợp đã được tạo dòng thành công là vùng gen chitinase, 3 dòng plasmid tái tổ hợp đã kiểm tra bằng
A B
enzyme BglII được tiến hành xác định trình tự của gen. Trình tự vùng gen chitinase được xác định dựa theo các nguyên lý của Sanger. Để tạo ra các đoạn xếp kết thúc bằng các loại ddNPTs khác nhau, chúng tôi đã tiến hành PCR sử dụng bộ hóa chất chuẩn BigDye®Terminator v3.1 Cycle sequencing. Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được đọc từ 2 chiều và xử lý bằng phần mềm ABI PRISM® 3100-Avant Data Collection V1.0 và DNA Sequencing Analysis. Với mỗi chiều đọc, chúng tôi đã thu được các đoạn dài khoảng 1000 nucleotide. Trình tự vùng gen TcChi1-W hoàn chỉnh có kích thước 1856 bp. Kết quả phân tích trình tự vùng gen TcChi1-U (chứa vùng mang mã và một phần vùng không mang mã của TcChi1-W) được trình bày trên Hình 3.15.
ccacacattgaaaaaatcacagatattatccataaaaaATGAGCTTTCGG 50 M S F R GCCTTGTCAGTTTTTTCTTTGTTCTTATCCTATTTAATCTTGGGCTCAGC 100
A L S V F S L F L S Y L I L G S A
TGAGCAGTGTGGACGGCAAGCTGGTGGTGCCCTGTGCCCTGGAGGCCTAT 150 E Q C G R Q A G G A L C P G G L C GTTGTAGCCAATTTGGTTGGTGTGGCAACACTGATGACTACTGCAAAAAG 200 C S Q F G W C G N T D D Y C K K
GAAAATGGTTGCCAGAGTCAGTGCAGCGGAAGCGGAGGTGATACTGGTGG 250 E N G C Q S Q C S G S G G D T G G
ACTTGATAGTCTGATAACAAGAGAAAGGTTTGATCAGATGCTTTTGCATA 300 L D S L I T R E R F D Q M L L H R
GAAATGATGGTGGTTGTCCTGCTCGTGGCTTCTATACCTATGATGCTTTC 350 N D G G C P A R G F Y T Y D A F
ATAGCTGCTGCGAAGTCTTTCCCTGCCTTCGCTACAACCGGTGATGATGC 400 I A A A K S F P A F A T T G D D A
CACTCGCAAGAGGGAAGTTGCTGCTTTCTTGGCCCAAACTTCTCACGAAA 450 T R K R E V A A F L A Q T S H E T CTACTGgttagtccacttcgaaagttaatcacaaagttcaccatgttttg 500 T G
aacatgacttcatcgttttgagaatttaatttgatgatgccgtagGTGGA 550 ECR
ECR
ECR
5’UTR
G
GCAGGATGGGCTGCACCCGATGGTCCATATACGTGGGGATACTGCTACAA 600 A G W A A P D G P Y T W G Y C Y N
TAGGGAATTAAACCCCGCTGATTACTGCCAGTGGGATCCAAACTACCCTT 650 R E L N P A D Y C Q W D P N Y P C GCGCTCCTGGTAAGCAATATTTTGGCCGGGGTCCAATGCAACTTACTTGg 700
A P G K Q Y F G R G P M Q L T W taagcctttcaccgtttgctaatttctgttcttgaaatgtatttatggta 750
aggcaaaattgttttgttgacatgggaatattcacttaacttttgatata 800
tcagGAACTACAACTATGGGCAGTGTGGAAGGGCCATTGGGGTGGACCTA 850 N Y N Y G Q C G R A I G V D L
TTAAACAACCCAGACCTGCTAGCAACTGATCCTACAATTTCTTTCAAGTC 900 L N N P D L L A T D P T I S F K S
AGCGTTCTGGTTCTGGATGACTCCACAATCACCAAAGCCTTCTTGCCACG 950 A F W F W M T P Q S P K P S C H E
AAGTGATCATTGGAGCGTGGTCACCCTCCGGTAGCGACCAGGCGGCAGGC 1000 V I I G A W S P S G S D Q A A G
CGGGTTGCAGGGTTTGGTTTGATCACAAATATTATCAATGGCGGCCTTGA 1050 R V A G F G L I T N I I N G G L E
ATGTGGCCAAGGTTGGAATGCAAAGGTAGAGGACCGCATTGGGTTCTATA 1100 C G Q G W N A K V E D R I G F Y K
AGAGGTATTGTGACACACTTGGAGTTGGCTATGGTAACAATCTCGACTGC 1150 R Y C D T L G V G Y G N N L D C
TACAACCAGAGGTCTTATAACAATGGACTCTCGGTGGACTCAATGTAGct 1200 Y N Q R S Y N N G L S V D S M *
aatttagtgtcgaatgactttggtaaacaaag 1232
Hình 3.15. Trình tự nucleotide vùng gen TcChi1-U phân lập từ dòng ca cao TD3 UTR: Vùng không dịch mã; ERC: Mã hóa cho vùng giàu cystein. Trình tự vùng mang mã gen TcChi1_U từ dòng TD3 bao gồm: Trình tự vùng mã hóa (chữ in hoa) với 3 Exon: Exon 1 (từ nucleotide 39 đến 456), Exon 2 (từ nucleotide 546 đến 699), Exon 3 (từ nucleotide 805 đến 1198); Trình tự vùng không mã hóa (chữ in thường) với 2 Intron: Intron 1 (từ nucleotide 457 đến 545), Intron 2 (từ nucleotide 700 đến 804). Vùng mã hóa cho vùng giàu cystein (ký hiệu ECR) từ nucleotide 107 đến 223, hoàn toàn tương đồng với trình tự endochitinase lớp I từ thuốc lá. Trình tự vùng không mã hóa (chữ in thường) bao gồm: 38 nucleotide vùng 5’UTR (từ nucleotide 1 đến 38) và 34 nucleotide vùng 3’UTR (từ nucleotide 1199-1232)
3’UTR
Để tiếp tục đánh giá các đặc tính của protein TcChi1, trình tự amino acid của TcChi1 đã được sử dụng để BLAST trên Ngân hàng gen Quốc tế. Kết quả cho thấy, ở mức amino acid, TcChi1 có mức độ tương đồng cao (69% - 99%) so với các chitinase lớp I của nhiều loài thực vật khác. So sánh TcChi1 với các trình tự đại diện của các chitinase lớp I ở thực vật (Hình 3.16) cho thấy có ba vùng bảo thủ trên protein chitinase dòng TD3, vùng bám bảo thủ của chitin (Q23 - C58), vùng xúc tác (I87 - Y325) và vùng đầu C (N236 - M334). So với trình tự chitinase của dòng ca cao khác trên Ngân hàng gen Quốc tế, trình tự protein chitinase ca cao dòng TD3 có sự sai khác 3 amino acid 253 (E - D); 273 (A - P) và 329 (L - P). Tuy nhiên, các amino acid quan trọng cho sự bám của chitin và đảm bảo hoạt động của enzyme chitinase lớp I (Garcia-casado et al., 1998; Ohnuma et al., 2004; Xiao et al., 2007) gồm W44, E148, E173, Q201, T203 và N283 hoàn toàn bảo thủ trên protein chitinase dòng TD3. Ngoài ra, vùng đầu C thường thấy trên chitinase lớp I cũng tìm thấy trên trình tự protein này.
10 20 30 40 # 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Ttchi1T3 AGW81842 MSFRALSVFSLFLSYLILGSAEQCGRQAGGALCPGGLCCSQFGWCGNTDD Ttchi1 AAA80656.1 MSFRALSVFSLFLSYLILGSAEQCGRQAGGALCPGGLCCSQFGWCGNTDD Catchi1 ACX42261. MRFCILVLFSIISLLGATTAQEQCGKQAGGKLCPGGLCCSQFGFCGSTPD Botchi1 AAF69793. ---SLLLSLASAEQCGRQAGGAPCPNGLCRSEFGWCGDTEP Motchi1 ABD66068. MKAHTLIIL-AFALFLGAASAEQCGRQANGALCPNRLCCSQHGWCGSTDE Gotchi1 AAD11255. ---EQCGRQAGGALCPGGLCCSQFGWCGSTAD Ctchi1 ADQ43720.1 MRFWIFAILSLLLSSFREGSAEQCGRQAGGALCPGGQCCSQYGWCGSTSD
60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Ttchi1T3 AGW81842 YCKKENGCQSQCSGSGG---DTG---GLDSLITRERFDQMLLHRN Ttchi1 AAA80656.1 YCKKENGCQSQCSGSGG---DTG---GLDSLITRERFDQMLLHRN Catchi1 ACX42261. YCSNN--CQSQCGGSPATPSTPTPTPSGGGGDISSLISRDLFNQMLKHRD Botchi1 AAF69793. YCKQP-GCQSQCTPGGTPPG---PTP-TGDLSGIISSSQFDDMLKHRN Motchi1 ABD66068. YCKN--GCQSQCG-GQTPTP---TNPGSGDVGRIITPAIFDQMLKYRN Gotchi1 AAD11255. YCTVP-GCQSQCSGSGP---APGPG-GLTNLISRETFNRMLLHRN Ctchi1 ADQ43720.1 YCSTG--CQSQCGGGGG---GGGGGGDIGGLISRSAFNNLLKHRN 110 120 130 140 #150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Ttchi1T3 AGW81842 DGGCPARGFYTYDAFIAAAKSFPAFATTGDDATRKREVAAFLAQTSHETT Ttchi1 AAA80656.1 DGGCPARGFYTYDAFIAAAKSFPAFATTGDDATRKREVAAFLAQTSHETT Catchi1 ACX42261. DASCPGKGFYTYDAFVAAAKSFGGFGTTGDTDTRKREIAAFLAQTSHETT Botchi1 AAF69793. DAACPARGFYTYNAFITAAKSFPGFGTTGDTATRKKEIAAFFGQTSHETT Motchi1 ABD66068. DARCPSNGFYSYNAFISATRSFPGFGTTGDDATRKRELAAFLGQTSHETT Gotchi1 AAD11255. DGACPARGFYTYDAFIAAARSFPAFATTGDQATRKREIAAFLAQTSHETT
CBD
CBD
CD
CD
Ctchi1 ADQ43720.1 DGACPAKGFYAYDAFIAAAKAFPNFATTGDSATRKREIAAFLAQTSHETT 160 170# 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Ttchi1T3 AGW81842 GGAGWA-APDGPYTWGYCYNRELN-PADYCQWDPNYPCAPGKQYFGRGPM Ttchi1 AAA80656.1 GGAGWA-APDGPYTWGYCYNRELN-PADYCQWDPNYPCAPGKQYFGRGPM Catchi1 ACX42261. G--GWPSAPDGPYAWGYCHVREQNPAGDYCSASQEWPCAPGKQYYGRGPI Botchi1 AAF69793. G--GWASAPDGPFSWGYCFKQEQNPTSNYCEPSATWPCAPGKRYYGRGPM Motchi1 ABD66068. G--GWPSAPDGPFAWGYCFIRERN-QDTYCSPNQQWPCAPGQKYYGRGPI Gotchi1 AAD11255. GGAGWA-APDGPYAWGYCYNRELNPPSSYCASGPNYPCSPGKQYFGRGPM Ctchi1 ADQ43720.1 G--GWATAPDGPYAWGYCYLREQN-PGSYCASDPTYPCAAGKQYYGRGPI
# # 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Ttchi1T3 AGW81842 QLTWNYNYGQCGRAIGVDLLNNPDLLATDPTISFKSAFWFWMTPQSPKPS Ttchi1 AAA80656.1 QLTWNYNYGQCGRAIGVDLLNNPDLLATDPTISFKSAFWFWMTPQSPKPS Catchi1 ACX42261. QISHNYNYGPAGKAIGSDLLGNPDLVATDTTISIKTAFWFWMTPQSPKPS Botchi1 AAF69793. QLSWNYNYGLCGRAIGVDLLNNPDLVANDAVIAFKAAIWFWMTAQPPKPS Motchi1 ABD66068. QLTHNYNYGPAGRALGLNLLNNPDSVATDPTVSFKTAIWFWMTPQGNKPS Gotchi1 AAD11255. QLSWNYNYGPCGRAIGVDLLNNPDLLSSDPTVSFKSAFWFWMTPQSPKPS Ctchi1 ADQ43720.1 QLSWNYNYGRCGKAIGVDLLNNPDLVATDPVISFKSALWFWMTPQSPKPS
260 270 #280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
Ttchi1T3 AGW81842 CHEVIIGAWSPSGSDQAAGRVAGFGLITNIINGGLECGQGWNAKVEDRIG Ttchi1 AAA80656.1 CHDVIIGAWSPSGSDQAAGRVPGFGLITNIINGGLECGQGWNAKVEDRIG Catchi1 ACX42261. CHDVNTGGWTPSSADTSAGRVPGYGVITNIINGGLECGKGSNAQAEDRIG Botchi1 AAF69793. CHAVIAGQWQPSDADSAAGRLPGYGVITNIINGGLECGRGQDERVANRIG Motchi1 ABD66068. SHDVIIGKWQPSGADSAAGRVPGYGVITNIINGGLECGRGPDSRVADRIG Gotchi1 AAD11255. CHNVIIGAWSPSSSDRAAGRATGYGVITNIINGGLECGKGWNAQVEDRIG Ctchi1 ADQ43720.1 CHDVITGRWNSSAADKAAGRNSGYGVVTNIINGGLECGKGWNAKVEDRIG
310 320 330 ....|....|....|....|....|....|....
Ttchi1T3 AGW81842 FYKRYCDTLGVGYGNNLDCYNQRSYNNGLSVDSM Ttchi1 AAA80656.1 FYKRYCDTLGVGYGNNLDCYNQRSYNNGPSVDSM Catchi1 ACX42261. FYKRYCDLFGVAYGNNLDCNNQQPFA--- Botchi1 AAF69793. FYQRYCNIFGVNPGDNLDCYNQRSFGNGLLGAA- Motchi1 ABD66068. FFKRYCDILRIGYGNNLDCNNQRPFA--- Gotchi1 AAD11255. FYKRYCDILGVSYGNNLDCYNQRPFGNGVSVDSM Ctchi1 ADQ43720.1 FFKRYCDILGVGYGSNLDCYNQRSFGNGLLVDTM
Hình 3.16. So sánh trình tự protein TcChi1 ở ca cao dòng TD3 với một số trình tự chitinase lớp I của một số loài thực vật khác
CBD: Vùng bám bảo thủ của chitin; CD: Vùng xúc tác; CTE: Vùng đầu C. Ttchi1T3 AGW81842.1, Ttchi1 AAA80656.1, Catchi1 ACX42261.1, Botchi1 AAF69793.1, Motchi1 ABD66068.1, Gotchi1 AAD11255.1, Ctchi1 ADQ43720.1 là trình tự chitinase lớp I từ cây ca cao dòng TD3 (Theobroma cacao L.), Ca cao (Theobroma cacao L.); Chè (Camellia sinensis); Cây họ cải (Boechera parishii); Mướp đắng (Momordica charantia); Bông (Gossypium hirsutum); Phi lao (Casuarina equisetifolia). Dấu # thể hiện amino acid quan trọng cho sự bám của chitin và hoạt động của enzyme chitinase lớp I
CD
CD CD
CD
CTE