3.4 CHUYỂN GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀO CÂY CA CAO
3.4.2 Kiểm tra cây ca cao chuyển gen bằng các phương pháp sinh học phân tử
Hình 3.32. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các cây ca cao chuyển gen M. Thang DNA chuẩn 1 kb; (+) Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ vector pCB301+TcChi1; (-) Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ cây ca cao TD8 không chuyển gen; 1-5. Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các cây ca cao TD8 chuyển gen (TD8/pCB/TcChi1/1-5)
Hình 3.33.Sản phẩm PCR nhân một phần đoạn CaMV35S+TcChi1+cmyc+KDEL+tNOS
M. Thang DNA chuẩn 1 kb; (+) Sản phẩm PCR nhân gen một phần đoạn gen CaMV35S+
TcChi1+cmyc từ vector pCB301+TcChi1; (-) Sản phẩm PCR nhân một phần đoạn gen CaMV35S+ TcChi1+cmyc từ cây ca cao TD8 không chuyển gen; 1-5. Sản phẩm PCR nhân một phần đoạn gen CaMV35S+TcChi1+cmyc từ cây ca cao TD8 chuyển gen (TD8/pCB/TcChi1/1-5)
Các cây ca cao TD8 chuyển gen TcChi1 dương tính khi PCR với cặp mồi nptII_F/R được tiếp tục kiểm tra bằng cặp mồi CaMV35S_F/cmyc_R để nhân một phần đoạn gen CaMV35S+TcChi1+cmyc (1439 bp). Kết quả trên Hình 3.33 cho thấy sản phẩm PCR đặc hiệu đã xuất hiện ở cả 5 cây ca cao dương tính trong lần PCR đầu tiên. Như vậy, gen mã hóa nptII và TcChi1 có mặt trong 5 cây TD8 chuyển gen pCB/TcChi1/1-5.
Sự có mặt và số bản sao của gen chuyển trong cây ca cao cũng được kiểm tra sử dụng phương pháp lai Southern. Thí nghiệm được tiến hành với 5 dòng ca cao TD8 cú kết quả PCR dương tớnh với cỏc mồi đặc hiệu. Khoảng 10 àg DNA tổng số của mỗi dòng được cắt bằng enzyme BamHI ở 37°C qua đêm. DNA tổng số sau đó được phân tách trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di xuất hiện băng có vệt sáng trải dài từ trên xuống cùng các băng DNA có các kích thước khác nhau, chứng tỏ toàn bộ DNA tổng số của cây đã được cắt bằng enzyme, đủ chất lượng để chuyển lên màng lai. Mẫu dò cho phản ứng lai Southern là sản phẩm PCR nhân một phần gen TcChi1.
Trước khi đỏnh dấu mẫu dũ bằng DIG, 5 àl sản phẩm PCR được dựng để chạy điện di kiểm tra và đo nồng độ DNA bằng máy quang phổ tại bước sóng 260 nm. Ảnh điện di cho thấy 01 băng sáng rõ nét, có kích thước tương đương với kích thước dự tính. DNA sau khi cắt với enzyme BamHI được chuyển thấm từ bản gel agarose lên màng Hybond-N+ (Amersham) và được lai với mẫu dò. Sở dĩ enzyme này được chọn vì chỉ có 1 điểm cắt của BamHI trong trình tự của đoạn T-DNA trong vector chuyển vào trong cây ca cao (Hình 3.34). Đối chứng là cây TD8 không chuyển gen. Kết quả hiện phim lai DNA (Hình 3.35) cho thấy: Trong tất cả các mẫu DNA genome của thực vật, gen TcChi1 đều được phát hiện dưới dạng một đoạn có kích thước khoảng 12 kb. Cây đối chứng chỉ xuất hiện 1 băng DNA với kích thước này, chứng tỏ là có một bản sao duy nhất của gen TcChi1. Theo tính toán lý thuyết, BamHI cắt ở khoảng giữa gen TcChi1 (vị trí +597) và tạo đoạn có kích thước thấp nhất là 900 bp tính từ điểm cắt đến đoạn biên trái (TcChi1+cmyc+KDEL+tNOS). Ở dòng cây chuyển gen TD8/pCB/TcChi1/2 và TD8/pCB/TcChi1/3 xuất hiện các băng DNA khác nhau và
lớn hơn 900 bp. Kết quả này chứng tỏ các dòng cây này tương ứng có gen chuyển được chèn vào trong hệ gen của ca cao. Hiệu quả chuyển gen ở giai đoạn này đạt 0,55 - 0,57% (số cây dương tính Southern/ số lượng mảnh mô lấy nhiễm x 100%).
Các cây ca cao đang tiếp tục được theo dõi trong nhà lưới.
Hình 3.34. Vùng T-DNA của vector pCB301+TcChi1
Hình 3.35. Lai Southern các mẫu ca cao chuyển gen 1-5: TD8/pCB/TcChi1/1-5; ĐC: TD8 không chuyển gen
3.4.3 Quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào dòng ca cao TD8 Trên cơ sở các thí nghiệm đã thực hiện, quy trình chuyển gen và tạo cây từ lá mầm của phôi soma sơ cấp ở dòng ca cao TD8 đang được canh tác ở Việt Nam đã được thực hiện như mô tả trên Hình 3.36.
Hình 3.36. Quy trình chuyển gen vào cây ca cao Lây nhiễm mảnh mô với A. tumefaciens
Đồng nuôi cấy với A. tumefaciens
Rửa khuẩn
Tạo mô sẹo
Tạo phôi soma thứ cấp
Lắc 30 giây trong bể ổn nhiệt; sau đó lây nhiễm trong 10 phút, ở 25oC, 50 rpm
ED + moxalactam 200 mg/l + kanamycin 50 mg/l, tối, 25oC, 14 ngày/chuyển, phôi ~1 cm
EDL + moxalactam 200 mg/l + kanamycin 50 mg/l, sáng, 6 phôi/đĩa, 20 ngày/chuyển, phôi ~1 - 2 lá
RD + moxalactam 200 mg/l + kanamycin 50 mg/l, sáng, 60 ngày/chuyển, cây 4 - 5 lá
Đất : trấu (1 : 1) Chuyển dạng phôi và tạo cây
Ra cây
Ủ trong 48 giờ/SCG có bổ sung acetosyringone 100 mM, tối, 25oC
H2O vô trùng; lắc 30 phút/ MI + moxalactam 400 mg/l và thấm khô, đặt lên môi trường SCG + cefotaxim 500 mg/l hoặc moxalactam 400 mg/l + kanamycin 50 mg/l Cắt thành các mảnh mô 4 mm2
Phôi soma sơ cấp 1
2
3
4
5
6
7
8
Phân tích cây chuyển gen
CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN Về quá trình tái sinh in vitro cây ca cao
Với khí hậu nhiệt đới mưa nhiều, đất đai màu mỡ, cây ca cao rất thích hợp cho canh tác ở Việt Nam. Hiện nay, tốc độ tăng trưởng diện tích và sản lượng ca cao ở Việt Nam vẫn chậm. Nguồn giống hiện có rải rác tại nhiều địa phương chủ yếu là giống nhập nội và lai tạo đều cho năng suất thấp, hiệu quả kinh tế không cao, mức độ phân ly cao. Vì vậy, việc triển khai nghiên cứu chọn tạo giống ca cao có chất lượng thông qua công nghệ sinh học có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, đặc biệt khi những vấn đề này chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống ở nước ta.
Hiệu quả của quá trình tạo giống bằng công nghệ gen phụ thuộc rất nhiều vào quy trình tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh. Đối với cây ca cao, cho đến nay, một số giống đã được tái sinh thành công thông qua phôi soma như IMC-67, P7, SCA6, UPA409, IFC5, TSH1188, TSH565… (Maximova et al., 2003; Minyaka et al., 2008;
Silva et al., 2009). Các công thức môi trường sử dụng để thăm dò khả năng hình thành mô sẹo ở các dòng ca cao nghiên cứu được thiết kế dựa trên nền môi trường PCG (Li et al., 1998; Maximova et al., 2002). Trong PCG, môi trường DKW được sử dụng như là nguồn dinh dưỡng vô cơ chính. Tổ hợp chất kích thích sinh trưởng là 2,4-D và TDZ, glucose được sử dụng làm nguồn cung cấp carbon. Trong những nghiên cứu trước đây về phát sinh phôi soma ở cây ca cao, môi trường MS (Murashige, Skoog, 1962) thường được sử dụng như là nguồn dinh dưỡng vô cơ chính (Pence, 1989; Figueira, Janick, 1993). Tuy nhiên, những nghiên cứu của Li và đồng tác giả (1998) cho thấy việc nuôi cấy các loại mô khác nhau của ca cao, trong đó có lá xanh, chồi ngọn, thân mầm phôi hữu thụ và các lá mầm có nguồn gốc từ phôi soma hay phôi hữu thụ, trên môi trường MS thường giảm khả năng phát triển, nhanh già và chết. Môi trường DKW, được nghiên cứu và ứng dụng trong tái sinh in vitro các loài cây lấy gỗ lâu năm, cung cấp calcium, sulfur và magnesium với nồng độ cao hơn so với môi trường MS. Các chất này cần thiết cho biệt hóa tế bào và phát sinh phôi. Sử dụng môi trường DKW làm tăng tốc độ phát triển của mô sẹo, tăng
hiệu quả cảm ứng và hình thành phôi soma cũng như tăng khả năng phát triển của cây ca cao có nguồn gốc từ phôi soma.
Nguồn carbon là sucrose và maltose đã và đang được sử dụng trong những nghiên cứu tạo phôi soma ở ca cao (Pence, 1989). Li và đồng tác giả (1998) đã chọn glucose làm nguồn carbon dựa trên những kết quả nghiên cứu trước đó cho rằng mô ca cao có thể phát triển bình thường trên môi trường có chứa glucose và không phản ứng một cách quá mẫn, nghĩa là môi trường có chứa glucose không giảm sự phát triển hay gây độc đối với mô ca cao. Sự phát triển của mô ca cao trên môi trường chứa glucose tương tự như sự phát triển của các mô này trên các môi trường chứa những loại đường khác. Nghiên cứu của Li và đồng tác giả (1998) đã đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu sau đó (Maximova et al., 2002; Maximova et al., 2003;
Maximova et al., 2006; Maximova et al., 2008; Traore et al., 2003; Silva et al., 2009).
Dựa trên những nghiên cứu của các tác giả đã công bố, chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu và tạo vật liệu nghiên cứu tái sinh in vitro cây ca cao phục vụ công tác chuyển gen và chọn tạo giống. Ở Việt Nam, nguồn giống ca cao hiện có rải rác tại nhiều địa phương, qua điều tra cho thấy không thể đáp ứng được yêu cầu sản xuất do năng suất thấp, không rõ xuất xứ và nguồn gốc, mức độ phân ly cao (khoảng 50%
không cho năng suất hoặc năng suất rất thấp). Hiện nay, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã chính thức công nhận 8 dòng vô tính do Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh khảo nghiệm để trồng trên toàn quốc, trong đó có các dòng TD1, TD2, TD3, TD4, TD5, TD6, TD8. Tất cả các dòng vô tính này đều cho năng suất cao, hàm lượng chất béo trong hạt đạt trên 50%. Một số dòng có khả năng kháng bệnh và sống trong điều kiện khô hạn. Dòng TD3, TD5, TD6 hiện đang được nông dân sử dụng nhiều nhất (tương ứng 76,6%, 75,7%, 63,1%) (http://www.agrifoodconsulting.com/). Cây giống chủ yếu là cây ghép nên tỷ lệ nhân giống cao, chất lượng hạt tốt, nhanh cho thu hoạch (Phạm Hồng Đức Phước, 2009) (Phụ lục 5, 6). Ngoài các dòng trên, dòng TD7, TD9 là 2 dòng mới được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận là giống quốc gia năm 2013 và cho phép
trồng đại trà ở Tây Nguyên, vùng duyên hải Nam Trung bộ, Đông Nam bộ và đồng bằng sông Cửu Long cũng được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu thăm dò khả năng tái sinh in vitro.
Hoa của 9 dòng ca cao được thu hái, bảo quản và vận chuyển ra phòng thí nghiệm tại Hà Nội. Kết quả chúng tôi đã tối ưu hóa được phương pháp khử trùng, vào mẫu và nhân nhanh mô sẹo ở 9 dòng ca cao này. Ở các dòng ca cao nghiên cứu, mô sẹo đã được tạo thành công từ cả hai loại nguyên liệu là nhị lép và cánh hoa. Tỷ lệ tạo mô sẹo từ nhị lép đạt từ 80,0% - 91,5% và ở cánh hoa đạt từ 55,2 - 82,5% (Phụ lục 7). Số lượng mô sẹo tạo được từ nhị lép nhiều hơn so với từ cánh hoa. Ở các mẫu cánh hoa của tất cả các dòng ca cao nghiên cứu, mô sẹo hình thành muộn và ít hơn so với các mẫu nhị lép. Khả năng tạo mô sẹo giữa hai nguồn vật liệu này có sự chênh lệch khá lớn. Ngoài ra, chất lượng mô sẹo thu được từ cánh hoa kém hơn so với các mô sẹo thu được từ nhị lép. Bên cạnh các mẫu sống sót và hình thành mô sẹo vẫn còn một lượng nhỏ mẫu không có khả năng hình thành mô sẹo trên môi trường PCG.
Những mẫu không tạo mô sẹo thường do bị chết hoặc bị nhiễm khuẩn. Điều này có thể do chất lượng các mẫu chưa đảm bảo (hoa tương đối nhỏ, quá trình vận chuyển dài làm giảm chất lượng, độ tươi của mẫu) hoặc do bị thương tổn bởi các thao tác trong quá trình khử trùng, tách mẫu và nuôi cấy. Mô sẹo tạo được từ các dòng ca cao có chất lượng tốt và có khả năng tăng sinh nhanh. Việc sử dụng TDZ làm nguồn cytokinin đã được chứng minh là rất cần thiết cho quá trình phát sinh mô sẹo ban đầu và quá trình tạo phôi soma sau đó ở ca cao. TDZ, dẫn xuất của phenylurea, có hoạt tính mạnh tương tự cytokinin. Hoạt tính này ở TDZ vượt trội hơn hầu hết các cytokine loại adenine thông thường như zeatin, benzylaminopurine và kinetin, có thể do khả năng kích thích tổng hợp cytokinin nội bào hoặc thay đổi cơ chế chuyển hóa cytokinin nội bào. TDZ đã và đang được sử dụng để cảm ứng tạo phôi soma, hình thành chồi, sự phát triển chồi bên ở nhiều chi thực vật, trong đó có các loài thân gỗ (Lu, 1993; Li et al., 1998). Nghiên cứu thăm dò khả năng tạo mô sẹo của Li và đồng tác giả (1998) trên một số dòng ca cao cho thấy trong quá trình tạo mô sẹo từ các mảnh nhị lép được nuôi trong môi trường PCG chứa TDZ, mô sẹo sẽ phát triển
nhanh hơn với trọng lượng lớn hơn và tạo ra các mô sẹo chắc hơn so với các mảnh mô chỉ nuôi trên môi trường PCG. Trong đó, ở nồng độ TDZ là 22,7 nM, các mô sẹo được tạo ra với tốc độ nhanh nhất, gấp 10 lần so với đối chứng. Trong quá trình cảm ứng và phát triển phôi soma, nồng độ TDZ trong môi trường PCG có ảnh hưởng quan trọng tới tỷ lệ phát sinh phôi soma của các mảnh mô cũng như số lượng các phôi hình thành trên một mảnh mô. Trong đó, nồng độ TDZ ở mức 22,7 nM vẫn cho kết quả cao nhất (Li et al., 1998). Nồng độ này giảm từ 15 đến 400 lần so với nồng độ TDZ thường sử dụng trong các nghiên cứu khác (Lu, 1993). Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng nồng độ TDZ nhiều hơn 45,5 nM làm giảm sự phát triển của mô sẹo và sự hình thành phôi, trở thành độc tố đối với một số dòng ca cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của Li và đồng tác giả (1998), Maximova và đồng tác giả (2003).
Tỷ lệ tạo phôi soma là chỉ tiêu quan trọng đánh giá hiệu quả của quy trình tái sinh. Hiệu quả tạo phôi soma chịu tác động của nhiều yếu tố như chất lượng mô sẹo, đặc điểm di truyền của mẫu vật… Để đánh giá hiệu quả tái sinh của các dòng ca cao nghiên cứu, sau 14 ngày trên môi trường nhân, các mô sẹo được chuyển sang môi trường cảm ứng tạo phôi ED và cấy chuyển mẫu sang môi trường ED mới sau mỗi 14 ngày. Phôi soma sơ cấp của 6 dòng ca cao TD1, TD3, TD5, TD7, TD8, TD9 đã được tái sinh thành công từ nhị lép/ cánh hoa với tỷ lệ tạo phôi soma sơ cấp dao động từ 2,6 - 44,0%. Trong đó, dòng TD8 có tỷ lệ tạo phôi soma từ nhị lép cao nhất (44,0%). Tuy nhiên, số phôi soma/mẫu thu được rất lớn, dao động từ 4 - 8 phôi/mẫu cấy. Khả năng tạo phôi từ mô sẹo của cánh hoa thấp, chỉ thu được từ 3 dòng TD3, TD5, TD8. Theo nghiên cứu của Li và đồng tác giả (1998), từ 1 - 100% các mô nhị lép từ 19 dòng ca cao nghiên cứu có sự hình thành phôi, trung bình trên 40 phôi/một mảnh mô. Tỷ lệ các mảnh mô cảm ứng và số lượng các phôi soma được hình thành trên mỗi mảnh mô phụ thuộc vào từng kiểu gen. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các công bố của Li và đồng tác giả (1998), Maximova và đồng tác giả (2002).
Chúng tôi cũng đã nhân nhanh phôi soma sơ cấp từ 5 dòng ca cao TD1, TD3, TD5, TD7, TD8 và tái sinh thành công phôi soma thứ cấp với tỷ lệ tạo phôi soma thứ cấp từ trục mầm và lá mầm dao động từ 5,0 - 48,5%, trong đó, lá mầm cho tỷ lệ tạo phôi soma thứ cấp tốt hơn trục mầm. Số phôi soma thu được dao động từ 7 - 15 phôi trên một mảnh phôi soma sơ cấp ban đầu. Các phôi soma sơ cấp và thứ cấp đã được tạo chồi, ra rễ, ra cây ca cao in vitro với tỷ lệ cây sống đạt mức cao nhất là 85,0%.
Theo quan sát của chúng tôi, các dòng ca cao khác nhau có khả năng và thời gian tạo chồi và rễ cũng khác nhau. Dòng TD8 có khả năng chuyển dạng phôi và tạo cây cao hơn các dòng TD1, TD3, TD5, TD7. Trong quá trình chuyển dạng phôi trên môi trường EDL, nhiều phôi của các dòng TD1, TD3, TD5, TD7 có dấu hiệu thâm đen, vì vậy số cây có khả năng ra rễ thấp (Phụ lục 10). Trong các dòng ca cao nghiên cứu về khả năng tạo chồi và ra rễ từ phôi soma thứ cấp, dòng TD8 có số lượng phôi thứ cấp cao nhất và cũng là dòng có nhiều cây tạo chồi và rễ hơn so với các dòng khác.
Khả năng phát sinh phôi soma thứ cấp từ phôi soma sơ cấp đã được nghiên cứu đánh giá nhằm tăng tỷ lệ tái sinh, hoàn thiện quy trình cho công tác chuyển gen cũng như so sánh khả năng phát sinh phôi giữa hai loại phôi soma này. Kết quả nghiên cứu của Maximova và đồng tác giả (2002) đã cho thấy số phôi và chất lượng phôi soma thứ cấp thu được cao hơn rất nhiều lần so với phôi soma sơ cấp. Phân tích mô ở các giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi cho thấy sự phát sinh phôi soma sơ cấp xuất hiện nhiều tế bào, đối lập với sự phát sinh phôi soma thứ cấp xuất hiện chủ yếu là các tế bào đơn. Các phôi soma được tạo ra từ sự phát triển của các tế bào soma nên các cây tạo ra từ phôi soma tương đồng về di truyền với các tế bào gốc và có các đặc tính sinh trưởng của thực vật phát triển từ hạt. Tuy nhiên, nghiên cứu cũng cho thấy khả năng phát sinh phôi từ phôi soma sơ cấp và thứ cấp đều rất phụ thuộc vào kiểu gen.
Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên về tái sinh in vitro thông qua phôi soma sơ cấp và thứ cấp của các dòng ca cao hiện đang được canh tác ở Việt Nam và là kết quả công bố đầu tiên về tái sinh phôi soma thứ cấp từ trục mầm phôi soma sơ cấp.
Hiệu quả trong phát sinh phôi soma và tái sinh cây theo quy trình này tạo tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng trong nhân giống và chuyển gen vào cây ca cao. Các cây ca