CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.1 Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro cây ca cao
Các phương pháp liên quan đến tái sinh in vitro cây ca cao từ nụ hoa được thực hiện theo Li và đồng tác giả (1998); Maximova và đồng tác giả (2002, 2003, 2005) với các cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và các dòng ca cao nghiên cứu.
Tái sinh in vitro cây ca cao từ nhị lép và cánh hoa của các dòng ca cao
đang được canh tác ở Việt Nam
Phân lập và thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa
chitinase
Chuyển gen chỉ thị và gen mã hóa chitinase vào cây ca cao
Phân tích cây chuyển gen bằng các phương pháp sinh học phân tử
2.2.1.1 Phương pháp thu mẫu, khử trùng hoa ca cao
Hoa non (hoa chưa mở có kích thước trung bình khá) được thu thập vào sáng sớm (6 - 8 giờ). Tại vườn ươm, hoa được khử trùng bằng nước vô trùng ở 4ºC và giữ trên đá trong suốt quá trình thao tác. Hoa đã khử trùng sơ bộ được loại bỏ nước, thấm khô bằng các miếng bông vô trùng và chuyển vào ống falcon. Ống có chứa hoa được đặt nằm ngang, trong đó hoa được rải đều dọc theo ống nhằm tránh cho hoa không bị ngấm nước còn sót lại. Xung quanh hộp cách nhiệt đựng mẫu là các túi đá. Nhiệt độ trong hộp cách nhiệt ban đầu cần được duy trì ở khoảng 1°C và bảo đảm không tăng quá 16 - 17°C. Sau khi được chuyển tới phòng thí nghiệm, hoa được nhanh chóng khử trùng trong box cấy mô vô trùng. Nước còn lại trong ống falcon được loại bỏ và tất cả nụ hoa được chuyển sang bình tam giác có chứa 50 ml nước vô trùng và tiếp theo là 100 ml nước Javel 1% có bổ sung vài giọt Tween 20.
Hoa được giữ ngập trong bình chứa dung dịch khử trùng trong 20 phút ở nhiệt độ phòng và được đảo nhẹ nhàng 5 phút/lần. Sau đó, dung dịch khử trùng được loại bỏ và hoa non được rửa sạch ít nhất 3 lần trong nước vô trùng. Hoa được chuyển vào các đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, đóng nắp đĩa để tránh cho nụ hoa không bị khô và thực hiện bước cắt hoa để nuôi cấy (Li et al., 1998; Maximova et al., 2002, Maximova et al., 2003).
Hình 2.3. Hoa ca cao
http://researcharchive.calacademy.org/calwild/2005summer/stories/chocotree.html
2.2.1.2 Cắt nụ hoa và tạo mô sẹo
Các nụ hoa đã khử trùng đang giữ trên các đĩa petri (Mục 2.2.1.1) được xử lý trong buồng cấy mô vô trùng với thời gian không dài quá 5 phút/nụ hoa nhằm tránh cho bề mặt cắt của nụ hoa bị khô. Nụ hoa được cắt ngang tại vị trí 1/3 chiều dài của hoa tính từ gốc hoa bằng lưỡi dao sắc (lưỡi dao số 11). Hoa được mở bằng panh nhọn, loại bỏ nhị (stamens), bao noãn (pistil) và tách lấy các mô nhị lép (staminodes) và cánh hoa (petals) tại cuối vị trí cắt. Đây là hai loại mô được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo, phôi vô tính và tái sinh phôi (Hình 2.3). Các nhị lép và cánh hoa được tách rời nhau và chuyển vào đĩa petri chứa 25 - 30 ml môi trường cảm ứng tạo mô sẹo PCG (Primary callus growth medium) (Phụ lục 1, 2) với số lượng 30 - 50 mảnh mô/đĩa. Các mảnh mô cần được đặt để có thể tiếp xúc tốt với môi trường mà không bị ngập. Để đánh giá khả năng tái sinh của từng loại mô riêng lẻ, cánh hoa và nhị lép được nuôi riêng rẽ trên các đĩa petri khác nhau. Các đĩa petri được cuốn bằng parafilm và nuôi cấy trong điều kiện tối tại 25 - 30°C. Sau 14 ngày, các mảnh mô được chuyển sang đĩa petri chứa 25 - 30 ml môi trường nhân mô sẹo SCG (Secondary callus growth medium) (Phụ lục 1, 2) và tiếp tục nuôi cấy trong tối thêm 14 ngày nữa. Mô sẹo sẽ được hình thành trong giai đoạn nuôi cấy này (Li et al., 1998; Maximova et al., 2002, Maximova et al., 2003).
2.2.1.3 Cảm ứng và duy trì phôi soma
Các mảnh mô có chứa mô sẹo được cấy chuyển sang các đĩa petri chứa 30 ml môi trường cảm ứng tạo phôi ED (Embryo development medium) (Phụ lục 1, 2) với mật độ 20 - 25 mẫu/đĩa, nuôi tối. Cấy chuyển được tiến hành liên tục với chu kỳ 14 ngày. Sự hình thành các dạng tế bào tiền phôi soma bao gồm các tế bào dạng sần sùi, có màu nâu sẫm và dễ vỡ được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Các phôi tại các giai đoạn phát triển khác nhau (dạng cầu, hình thủy lôi và trưởng thành) sẽ xuất hiện trên từng mảnh mô tại cùng một thời điểm. Quá trình nuôi cấy trong môi trường ED có thể duy trì tới 1 năm. Chú ý rằng đây không phải là một hệ thống đồng nhất, nên các phôi mới sẽ tiếp tục phát triển trong khoảng 8 - 10 tháng sau giai đoạn khởi đầu nuôi cấy. Tại mỗi lần cấy chuyển, từng phôi trưởng thành có thể
được chọn lọc và chuyển sang môi trường chuyển dạng (Li et al., 1998; Maximova et al., 2002, Maximova et al., 2003).
2.2.1.4 Tạo phôi thứ cấp từ lá mầm của phôi soma sơ cấp
Các lá mầm của phôi sơ cấp trưởng thành ở giai đoạn giữa 21 - 26 tuần tuổi, có màu vàng sáng hoặc đôi khi có màu hồng được lựa chọn. Các lá mầm non có màu trắng, màu trong suốt hoặc các lá mầm già dạng sợi dày với các túm lông rất dễ thấy không nên sử dụng. Các lá mầm được tách ra khỏi trụ dưới lá mầm của phôi, cắt thành các mảnh 4 x 4 mm bằng lưỡi dao sắc (lưỡi số 11) và chuyển vào đĩa petri chứa 25 - 30 ml môi trường SCG. Các mảnh mô phải được tiếp xúc tốt mà không bị ngập/chìm trong môi trường. Các đĩa petri được dán kín và duy trì nuôi cấy trong tối trong 14 ngày. Khi mô sẹo được hình thành, các mảnh lá mầm mang mô sẹo được chuyển sang các đĩa petri chứa 30 ml môi trường ED, nuôi cấy trong tối và được cấy chuyển sau mỗi chu kỳ 14 ngày. Phôi thứ cấp được hình thành sau 2 đến 3 tháng không kèm phát triển mô sẹo hoặc chỉ phát triển rất ít mô sẹo. Từng phôi được duy trì nuôi cấy trong tối và cấy chuyển theo chu kỳ 14 ngày/lần trên môi trường ED cho đến khi phôi trưởng thành và sẵn sàng cho quá trình chuyển dạng (Maximova et al., 2002, Maximova et al., 2003).
2.2.1.5 Phát sinh chồi và ra rễ
Các phôi soma trưởng thành (dài tới 2 cm) với các lá mầm tách biệt và một trụ dưới lá mầm kéo dài được chuyển sang môi trường chuyển dạng phôi và tạo cây EDL (Embryo development in light medium) (Phụ lục 1, 2) bằng cách đặt phôi vuông góc theo phương thẳng đứng với bề mặt môi trường, gốc rễ ở dưới, sau đó tới gốc lá mầm với mật độ 6 đến 10 phôi/bình tam giác chứa 30 ml môi trường. Mẫu được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng với chu kỳ 16/8 giờ ở nhiệt độ 25 - 30ºC.
Các mẫu được cấy chuyển lên môi trường EDL mới theo chu kỳ 20 ngày/lần cho tới khi phôi nảy mầm thành các chồi mang 1 đến 2 lá. Chồi mang 2 lá và cao ít nhất 1 cm được chuyển sang các ống nghiệm lớn (hoặc các bình tam giác) chứa 100 ml môi trường hình thành và phát triển rễ RD (Root development and maintenance
medium) (Phụ lục 1, 2). Các phôi được đặt với phần gốc rễ trước, mật độ 4 đến 5 phôi/ống, nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16/8 giờ và cấy chuyển lên môi trường ED mới theo chu kỳ 60 ngày/lần. Cần chú ý tạo vết lõm trên mặt thạch trước khi chuyển phôi vào môi trường mới để có thể đặt phần phôi vào sâu trong môi trường mà không bị tổn thương phần rễ phôi. Các cây có ít nhất 4 - 5 lá (cao hơn 2 cm) với các rễ sơ cấp và thứ cấp khỏe mạnh (dài hơn 2 cm) được ra cây vào các chậu nhựa hoặc các túi chứa đất : trấu đã khử trùng. Dung dịch dinh dưỡng (1/10 MS) được sử dụng để tưới cây đảm bảo giữ ẩm, tránh tình trạng ngập úng. Cây con được duy trì trong nhà lưới, dưới bóng râm và có thể cao tới 5 - 10 cm sau hai tháng (Li et al., 1998; Maximova et al., 2002; Maximova et al., 2003).
2.2.2 Các phương pháp liên quan đến phân lập gen mã hóa chitinase và thiết kế các vector chuyển gen thực vật
2.2.2.1 Nuôi cấy và lưu giữ các chủng vi khuẩn
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng: Một khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch (có kháng sinh chọn lọc) được chuyển sang 5 ml môi trường lỏng đã bổ sung kháng sinh tương ứng, nuôi cấy lắc 160 v/p từ 8 - 16 giờ ở 37°C trên môi trường LB pH 7,0 (đối với E. coli) (Phụ lục 3) hoặc 20 - 48 giờ ở 28°C trên môi trường YEP pH 7,0 (đối với A. tumefaciens) (Phụ lục 3) (Sambrook, Russell, 2001).
2.2.2.2 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ thực vật
DNA tổng số của ca cao được tách từ lá theo phương pháp của Michiels và đồng tác giả (2003). Lá tươi (1 g) được nghiền thành bột trong nitơ lỏng và cho vào ống có chứa 15 ml dung dịch chiết (Phụ lục 3). Ống được đảo đều và ủ ở 65°C trong 60 phút. Dung dịch phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) (15 ml) được bổ sung để kết tủa bã, protein và loại cặn sau khi ly tâm hỗn hợp ở 5.000 v/p trong 10 phút, 20°C. Cặn được loại một lần nữa bằng dung dịch chloroform : isoamylalcohol (24 : 1). DNA trong phần dịch được kết tủa với 1/10 5M NaCl và 2 lần thể tích isopropanol, sau đó thu bằng ly tâm ở 10.000 v/p trong 15 phút, 20°C.
Muối được loại bỏ bằng ethanol 70% và ly tâm 10.000 v/p trong 15 phút ở 20°C.
DNA được làm khụ ở nhiệt độ phũng, hũa tan trong 200 àl nước khử ion vụ trựng và bảo quản ở -20ºC (Michels et al., 2003).
2.2.2.3 Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid từ vi khuẩn
Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli: Chủng vi khuẩn E. coli chứa plasmid được nuôi trong 3 ml môi trường LB với kháng sinh thích hợp ở 37ºC, 200 v/p qua đêm. Cặn tế bào vi khuẩn sau khi ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy trên ở 6.000 v/p, 8 phút được hòa trong 100 l dung dịch I . Dung dịch trên tiếp tục được trộn với 200 l dung dịch II, ủ trên đá 10 phút; 150 l dung dịch III, ủ trong đá 3 - 5 phút (Phụ lục 3). Bã tế bào được kết tủa trong 550 l phenol : chloroform (1 : 1) và trong chloroform : isoamylalcohol (24 : 1). DNA ở phần dịch được kết tủa trong 1 ml ethanol 100% và 10 l 3M sodium acetate, ở -20°C trong 3 giờ. DNA thu được sau khi ly tâm 14.000 v/p, 8 phút được loại muối bằng 0,2 ml ethanol 70%, ly tâm 14.000 v/p, 3 phút, làm khô và hòa cặn trong 40 l 0,01 M TE, giữ ở - 20ºC. RNase được bổ sung vào mẫu DNA đến nồng độ cuối cựng là 100 àg/ml.
Mẫu được ủ ở 37ºC trong 1 giờ, chiết bằng phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1). Cặn DNA được rửa sạch muối bằng 0,2 ml ethanol 70%, ly tâm 14.000 v/p, 3 phút, làm khô và hòa cặn trong 40 l 0,01 M TE, giữ ở -20°C. Nồng độ và độ sạch của DNA được xác định trên máy quang phổ hấp thụ tử ngoại và điện di trên gel agarose 0,8% (Sambrook, Russell, 2001).
Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid từ vi khuẩn A. tumefaciens: Tế bào A. tumefaciens được nuôi lỏng, ở 28oC, 36 giờ trên 5 ml môi trường YEP có bổ sung kháng sinh. Cặn tế bào của 5 ml dịch nuôi cấy được thu nhờ ly tâm ở 12.000 v/p trong 10 phút và hòa nhẹ nhàng trong 1 ml dung dịch rửa pH 8,0 (Phụ lục 3), sau đó ly tâm ở 12.000 v/p, 4oC, trong 1 phút. Tế bào được phá vỡ trong 100 l dung dịch GTE (Phụ lục 3), 25 l lysozyme 40 mg/ml GTE, trộn đều và ủ ở 37°C trong 15 phút. Cặn được kết tủa trong 150 l dung dịch sodium acetate 3 M, pH 5,2 và loại bỏ bằng ly tâm ở 12.000 v/p trong 5 phút, ở nhiệt độ phòng. Protein trong dịch được chiết bằng 550 l phenol : chloroform, ly tâm 15 phút. Plasmid được kết
tủa bằng cách bổ sung 1 ml ethanol 100%, giữ ở -20°C trong 1 - 2 giờ, sau đó ly tâm ở 14.000 v/p trong 8 phút để thu cặn. Cặn DNA được rửa sạch muối bằng 0,2 ml ethanol 70%, ly tâm 14.000 v/p, 3 phút, làm khô và hòa cặn trong 40 l 0,01 M TE, giữ ở -20°C. Nồng độ và độ sạch của DNA được xác định bằng phổ hấp thụ trên máy quang phổ tử ngoại và điện di trên gel agarose 0,8% (Draper et al., 1988).
2.2.2.4 Thiết kế và tổng hợp các đoạn mồi
Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để nhân gen được thiết kế nhờ chương trình DNAStar, theo một số nguyên tắc cơ bản: Trình tự mồi liên quan đến hiệu quả của quá trình nhân gen; Trình tự Guanine/Cytosine nhiều, tỷ lệ Guanine : Cytosine cân đối, không nên có nhiều hơn 4 nucleotide cùng loại liên tiếp; Nhiệt độ của mồi cần cao hơn 50oC để đảm bảo tính đặc hiệu của PCR (Sambrook, Russell, 2001).
Dựa trên dữ liệu về trình tự toàn bộ gen mã hóa chitinase lớp I (gen TcChi1) từ trình tự hệ gen ca cao trên Ngân hàng gen Quốc tế (GenBank), mã số U30324.1, chúng tôi đã thiết kế các cặp mồi để nhân các vùng gen TcChi1 như sau:
Vùng TcChi1-W: chứa toàn bộ trình tự gen TcChi1 bao gồm vùng 5’ không dịch mã (5’ UTR), vùng tín hiệu TATA, ba exon mã hóa toàn bộ protein chitinase, hai intron, vùng tín hiệu poly(A) và vùng 3’ không dịch mã (3’ UTR) (từ vị trí 1 đến 1856 của trình tự U30324.1) (1856 bp).
TcChi1-W_F: 5'-acgtagatctagtcaatggctcgatgtgctcca-3' BglII
TcChi1-W_R: 5'-actgagatctgaaaatgaaaatcaaaggaacca-3' BglII
Vùng TcChi1: chứa toàn bộ trình tự mã hóa protein của gen (từ vị trí 477 đến 1636 của trình tự U30324.1) (1159 bp).
TcChi1_F: 5'- tatccaagatctatgagctttcgggccttg-3' BglII
TcChi1_R: 5'-acactaaagcggccgcgctacattgagtcca-3' NotI
2.2.2.5 Nhân gen mã hóa chitinase bằng kỹ thuật PCR
PCR được tiến hành với thành phần gồm 2,5 àl đệm 10X 2 àl dNTP 10 mM, 2 àl MgCl2 25 mM, 1 àl mồi xuụi 10 pM, 1 àl mồi ngược 10 pM, 1 àl DNA khuụn (20 - 100 ng), 0,2 àl Pfu DNA polymerase 5 U/àl và H2O đến 25 àl.
Phản ứng được thực hiện sử dụng máy PCR GeneAmp®PCR Systems 9700 với chu trình nhiệt như sau: 94°C - 5 phút; (94°C - 1 phút; 57°C - 1 phút; 72°C - 1 phút; sau đó 72°C - 10 phút) x 25 chu kỳ và kết thúc ở 4°C (Sambrook, Russell, 2001). DNA được tinh sạch bằng Kit GeneJETTM Gel Extration.
2.2.2.6 Phản ứng ghép nối các đoạn DNAvào vector
Ghép nối đoạn DNA vào vector tách dòng: Sản phẩm PCR sau khi được nhân lên bằng enzyme tạo đầu bằng Pfu DNA polymerase được tinh sạch bằng cách thôi gel để hạn chế sản phẩm phụ và được tinh sạch qua cột sử dụng Kit GeneJETTM Gel Extraction, sau đú được ghộp vào vector tỏch dũng pJET1.2 với 10 àl thành phần: 1 àl 10x Reaction buffer; 3 àl sản phẩm PCR; 0,5 àl pJET1.2; 4,5 àl H2O.
Hỗn hợp phản ứng sau đó được để ở nhiệt độ phòng (16°C) khoảng 3 giờ và sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli.
Ghép nối các đoạn DNA vào các vector thích hợp: Đây là phản ứng gắn đoạn DNA vào vector thích hợp nhờ enzyme T4 DNA ligase xúc tác cho quá trình hình thành liên kết nối 2 đoạn DNA. Thành phần phản ứng gồm: 1 l đệm phản ứng;
1 l T4 DNA ligase; 1 l ATP; 1 l (50 ng) vector đã mở vòng; 4 l (50 - 100 ng) DNA tinh sạch; 2 l nước khử ion vô trùng. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ 14 - 24 giờ, ở 16°C. Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào E. coli và chọn lọc trên môi trường thích hợp (Sambrook, Russell, 2001).
2.2.2.7 Chuẩn bị tế bào khả biến
Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli: Nuôi cấy tế bào E. coli trong môi trường lỏng SOC (Phụ lục 3) cho đến khi OD600nm = 0,6 - 0,8. Cặn tế bào sau khi ly tâm được xử lý 2 lần trong 0,1 M CaCl2, giữ trong đá lạnh 20 phút, ly tâm ở 4.200 v/p,
4°C trong 10 phỳt, bổ sung glycerol 60%, chia mỗi 50 àl vào ống eppendorf, làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -70°C (Sambrook, Russell, 2001).
Chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens: Chủng thuần cần được làm mới trên môi trường thạch. Một khuẩn lạc đơn được chọn lựa để nuôi lỏng trong 2 ml mụi trường YEP ở 28°C, 6 giờ. Sau đú, 100 àl dịch vi khuẩn trờn được nuụi cấy tiếp tục ở 28ºC qua đêm trên 100 ml môi trường YEP lỏng có bổ sung 0,1% glucose đến khi OD600nm = 1 - 1,5. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được rửa 3 lần trong 1 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0 và 1 lần trong 10% glycerol, cuối cựng hũa tan trong 500 - 700 àl 10% glycerol và chia mỗi 45 àl dịch tế bào vào từng ống eppendorf, làm lạnh trong N2 lỏng và giữ ở -70°C (Holster et al., 1987).
2.2.2.8 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến
Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli bằng sốc nhiệt: DNA plasmid được trộn vào mỗi ống tế bào khả biến đã được hạ nhiệt độ trong đá 30 phút. Mẫu được sốc nhiệt ở 42°C trong 1 phút sau đó chuyển ngay xuống 0°C, giữ trong vòng 5 phút và bổ sung 0,3 ml môi trường LB hoặc SOC, nuôi lắc ở 37°C trong 1 giờ. Vi khuẩn được cấy trải trên đĩa môi trường LB chọn lọc có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi qua đêm ở 37°C (Sambrook, Russell, 2001).
Biến nạp vector biểu hiện thực vật vào tế bào khả biến A. tumefaciens bằng xung điện: Vector tái tổ hợp (1 - 10 l) được bổ sung vào ống eppendorf chứa tế bào khả biến đã được làm tan trong đá. Hỗn hợp được chuyển sang cuvette dùng cho xung điện đã được làm lạnh từ trước và thực hiện xung điện trong 5 ms, 12,5 kV/cm. Môi trường SOC (1 ml) được bổ sung ngay vào cuvette và chuyển vào ống eppendorf, lắc ở 28°C trong 1 - 1,5 giờ, sau đó cấy trải trên môi trường chọn lọc (Holster et al., 1987).
2.2.2.9 Xác định trình tự gen
Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger, trong đó các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide
được tạo ra, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, PCR được tiến hành sử dụng BigDye Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân DNA như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase… do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng nhân DNA để đọc trình tự bao gồm: Mồi (thích hợp) 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tớch 15 àl.
Chu trình nhiệt cho PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau:
96°C - 1 phút; (96°C - 10 giây; 50°C - 5 giây; 60°C - 4 phút) x 25 chu kỳ và kết thúc ở 4°C. Trình tự sau khi xác định được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Bioedit; Seqscape 2.5. Từ các chương trình này, trình tự của đoạn DNA được so sánh với trình tự chuẩn nhằm phân tích những sai khác để đưa ra những dự đoán cần thiết.
2.2.3 Các phương pháp liên quan đến chuyển gen thực vật 2.2.3.1 Phương pháp tạo và kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens: Một khuẩn lạc đơn của chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen được chọn để cấy vào 10 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l, nuôi qua đêm ở 28°C. Khoảng 2 ml dịch huyền phù vi khuẩn được chuyển sang 50 ml môi trường LB lỏng (không bổ sung kháng sinh) nuôi phục hồi trong 4 giờ. Tế bào vi khuẩn được ly tâm 5.000 v/p trong 10 phút ở 4°C để thu cặn. Cặn khuẩn được hòa tan trong môi trường 1/2 MS lỏng (Murashige and Skoog medium) (Murashige, Skoog, 1962) , pH = 5,8, đến mật độ khuẩn đạt giá trị OD600nm = 0,7.
Quy trình chuyển gen: Các lá bánh tẻ có kích thước vừa phải ở cây con khỏe mạnh 2 tuần tuổi được chọn để cắt thành các mảnh có kích thước khoảng 1 x 1 cm. Sau đó, các mảnh lá này được đặt trong môi trường 1/2 MS lỏng trước khi biến