3.2. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA CHITINASE VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỰC VẬT
3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen mã hóa chitinase sử dụng hệ
Sau khi tạo dòng và xác định trình tự vùng gen TcChi1-W, chúng tôi đã sử dụng khuôn mẫu là vector tái tổ hợp dòng số 1 (pJET+TcChi1-W/1) và cặp mồi TcChi1_F và R để nhân đoạn gen TcChi1 có kích thước 1159 bp (chỉ chứa vùng mang mã). Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 được trình bày trên Hình 3.17 cho thấy, sản phẩm PCR rất đặc hiệu, có kích thước đúng như tính toán lý thuyết. Sản phẩm PCR chứa đoạn gen TcChi1 sau đó cũng được tạo dòng trong vector pJET1.2 để lưu giữ phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. Các plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng enzyme BglII và NotI. Các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR mong muốn khi xử lý bằng hai enzyme này sẽ xuất hiện 2 băng: Một băng có kích thước ~ 2,9 kb (tương ứng với kích thước của vector pJET1.2) và một băng có kích thước 1,15 kb (tương ứng với kích thước của gen TcChi1 là 1159 bp).
Hình 3.17. Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1 và sản phẩm xử lý BglII và NotI các plasmid tái tổ hợp pJET+TcChi1 trên gel agarose 0,8%
A: M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm PCR nhân gen TcChi1;
B: M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2-3. pJET+TcChi1/1, 2, 4/BglII + NotI
Để có thể biểu hiện trong thực vật, gen TcChi1 cần được đặt dưới sự điều khiển của promoter và terminator thích hợp. Trong nghiên cứu này, gen TcChi1 được đưa vào vector trung gian để tạo cấu trúc hoàn chỉnh (bao gồm promoter, gen đích và
terminator). Sau đó, cấu trúc hoàn chỉnh của gen được chuyển vào vector biểu hiện thực vật gốc pCB301. Vector trung gian được lựa chọn là pRTRA (Fiedler et al., 1997).
Theo sơ đồ thiết kế trên Hình 3.18: Vector pRTRA (chứa CaMV35S+M1+cmyc+KDEL+NOST) kích thước 4247 bp được xử lý bằng enzyme BamHI và NotI để loại bỏ gen đích (M1 có kích thước 600 bp). Đồng thời, vector pJET+TcChi1/1 cũng được xử lý bằng BglII + NotI để thu được đoạn gen TcChi1 dạng đoạn BglII - NotI. Do enzyme BamHI (GGATCC) và BglII (AGATCT) có sự tương đồng về điểm cắt nên đoạn gen TcChi1 có thể được gắn vào vector pRTRA (thay thế gen M1). Sản phẩm gen TcChi1 và vector pRTRA sau khi xử lý enzyme đã được lai với nhau và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH10b và tiến hành chọn lọc bằng enzyme BamHI. Vì trong gen TcChi1 chỉ có một điểm cắt của BamHI và điểm cắt của BamHI trên vector pRTRA không còn tồn tại do lai với BglII trên gen TcChi1 nên sản phẩm xử lý enzyme các plasmid tái tổ hợp pRTRA+TcChi1 theo tính toán lý thuyết là một băng có kích thước 4,6 kb. Kết quả điện di sản phẩm xử lý enzyme này cho thấy đoạn DNA 4,6 kb (Hình 3.19) đã xuất hiện, chứng tỏ đoạn gen TcChi1 đã
được ghép nối vào vector pRTRA tạo cấu trúc
CaMV35S+TcChi1+cmyc+KDEL+tNOS.
Hình 3.18. Sơ đồ thiết kế vector pRTRA+TcChi1
Hình 3.19. Kết quả thiết kế pRTRA+TcChi1 trên gel agarose 0,8%
M. Thang DNA chuẩn; 1. Plasmid pRTRA+TcChi1/2/BamHI;
2. Plasmid pRTRA+TcChi1/4/BamHI
Trên cơ sở cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cmyc+KDEL+tNOS đã thiết kế và vector biểu hiện thực vật gốc pCB301, chúng tôi đã tiến hành thiết kế plasmid tái tổ hợp pCB301 mang gen TcChi1 dưới sự điều kiển của CaMV35S promoter. Vùng MCS của pRTRA có vị trí cắt của enzyme HindIII, do vậy, toàn bộ cấu trúc gen CaMV35S+TcChi1+cmyc+KDEL+tNOS kích thước ~ 2 kb từ vector pRTRA+TcChi1 được đưa vào vector pCB301 dưới dạng đoạn HindIII tạo vector tái tổ hợp pCB301+TcChi1, kích thước ~ 8 kb. Sơ đồ thiết kế được trình bày trên Hình 3.20.
Hình 3.20. Sơ đồ thiết kế vector pCB301+TcChi1
Sau khi sơ bộ sàng lọc các dòng mang plasmid kích thước lớn hơn pCB301, plasmid pCB301+TcChi1/1 được xử lý bằng enzyme HindIII. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm xử lý enzyme này sẽ là hai băng. Một băng có kích thước ~ 2 kb tương ứng với kích thước của cấu trúc CaMV35S +TcChi1+cmyc+KDEL+tNOS và một băng có kích thước ~ 6 kb tương ứng với kích thước của vector pCB301. Kết quả trên Hình 3.21 (giếng 1) hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết, chứng tỏ cấu trúc CaMV35S+TcChi1+cmyc+KDEL+tNOS đã được chuyển thành công vào vector pCB301 để tạo plasmid tái tổ hợp pCB301+TcChi1.
Vùng gen TcChi1 trong vector biểu hiện pCB301+TcChi1/1 sau đó được xác định trình tự để đảm bảo không có sự thay đổi trình tự nucleotide trong quá trình nhân và tạo dòng gen. Kết quả xác định và so sánh trình tự gen TcChi1 với gen TcChi1-W đã xác định trình tự trước đó cho thấy hoàn toàn không có sự sai khác nucleotide.
Hình 3.21. Sản phẩm xử lý pCB301+TcChi1 bằng HindIII trên gel agarose 0,8%