1.3 GEN MÃ HÓA CHITINASE
1.3.1 Nguồn gốc và cấu trúc của chitinase tự nhiên
Họ chitinase là các enzyme tham gia quá trình thủy phân N- acetylglucosamine (GlcNAC) polymer chitin. Chitinase có một phổ phân bố rộng trong tự nhiên, được tìm thấy ở tất cả các giới loài, từ vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm, thực vật cho đến động vật. Chúng có rất nhiều chức năng khác nhau thường liên quan đến tiêu hóa, sự lột xác của động vật chân khớp và chức năng bảo vệ. Gen mã hóa chitinase là đối tượng được quan tâm nghiên cứu trong vài năm trở lại đây và ngày nay, giá trị của gen mã hóa chitinase được nâng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen thực vật để giảm thiểu bệnh hại.
Căn cứ vào trình tự amino acid bảo toàn, cách gấp cuộn protein, chitinase được chia làm 2 họ là họ chitinase 18 và 19 (Coutinho, 1999). Họ chitinase 18 có một phổ phân bố rộng ở tất các các giới loài bao gồm cả vi khuẩn, thực vật và động vật. Trong khi đó, họ chitinase 19 lại tìm thấy chủ yếu ở thực vật. Tuy nhiên, cũng có một vài báo cáo về họ chitinase 19 từ những nguồn được phân loại như từ vi khuẩn (Kawase et al., 2004), ve bét (You et al., 2003) và một số virus (Mediavilla et al., 2000).
Có nhiều cách phân loại chitinase dựa trên nhiều tiêu chí khác nhau. Các lớp chitinase thực vật khác nhau được phân biệt bởi các tiêu chuẩn sinh hóa, sinh học phân tử và các tiêu chuẩn hóa lý. Do đó, các chitinase có thể khác nhau về cơ chất, vị trí trong tế bào và các hoạt động cụ thể. Các nhà nghiên cứu đã đưa ra 3 lớp chitinase thực vật. Chitinase lớp I là enzyme có tính bảo thủ cao với 1 miền đầu N giàu cysteine được tạo bởi khoảng 40 amino acid.
Chitinase lớp II thiếu miền đầu N giàu cysteine nhưng có trình tự amino acid có tính tương đồng cao với chitinase lớp I. Chitinase lớp III không có trình tự tương đồng nào với chitinase lớp I hay II. Chitinase lớp III có một sự tương đồng nhỏ với chitinase vi khuẩn và vùng hoạt động được cho là chứa 4 amino acid aspartic hoặc glutamic suy ra từ tính kị nước của vùng này. Có ý kiến cho rằng tồn tại một lớp chitinase khác là chitinase lớp IV bao gồm chitinase ở củ cải đường, cây cải dầu và đậu. Chitinase lớp IV cũng chứa vùng giàu cystein để duy trì cấu trúc cơ bản giống như chitinase lớp I nhưng mức độ giảm đi 4 lần.
Chitinase lớp IV chỉ chứa 241 - 255 amino acid ở protein trưởng thành trong khi chitinase lớp I là 300 amino acid. So sánh trình tự amino acid đặc trưng giữa lớp IV và lớp I giống nhau 41 - 47%, trong lớp IV thông thường là 59 - 63% và trên 69% đối với lớp I. Hơn nữa, chitinase lớp IV và lớp I có thể phân biệt bằng huyết thanh học. Miền đầu N giàu cystein được cho là vùng kết hợp với chitin và được tìm thấy ở rất nhiều loại protein. Những protein chứa vùng giàu cystein có khả năng liên quan tới 1 gen dung hợp vùng gắn chitin và vùng không liên quan. Chitinase lớp V: dựa vào những dữ liệu về trình tự, nghiên cứu nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cysteine) có thể giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa thực vật bậc cao (Collinge et al., 1993; Punja, Zhang, 1993; Rifat et al., 2013).
1.3.2 Chitinase ở một số đối tƣợng sinh vật
Chitinase thực vật chủ yếu được tìm thấy ở thân cây, hạt, củ và hoa.
Chúng được sản sinh khi có sự tấn công của bệnh hại hay các chất điều hòa sinh trưởng như ethylene (Gooday, 1996). Dạng chitinase được nghiên cứu rộng rãi nhất ở thực vật là endochitinase, một loại enzyme phân cắt bên trong phân tử chitin, giải phóng N-acetylglucosamine, có khối lượng phân tử nhỏ hơn
chitinase côn trùng. Endochitinase thực vật là loại enzyme có bản chất protein, khối lượng đơn phân tử từ 25 - 35 kDa, có điểm đẳng điện cao hoặc thấp.
Chitinase có một khoảng pH tối ưu rất rộng xung quanh pH 6 và có khoảng nhiệt cố định không quá 50ºC (Boller, 1987). Chitinase có thể biểu hiện ở mức độ thấp nhưng cũng được tăng cường đáng kể bởi các yếu tố như ethylene, salicylic acid, dung dịch muối, ozone, tia UV, nấm, vi khuẩn, virus. Chitinase ức chế sự phát triển của nấm thường kết hợp với các enzyme khác như β-1,3- glucanases, được tìm thấy ở khoai tây, thuốc lá, cam quýt, đậu, cà chua, ngô, khoai lang và đậu Hà Lan (Koga et al., 1996). Chitinase có thể được phát hiện ở giai đoạn đầu của sự phát triển thực vật (Kasprzewska, 2003; Rifat et al., 2013).
Chitinase còn được tìm thấy trong tất cả các loài côn trùng thuộc các bộ Hai cánh, Cảnh vảy, Cánh nửa, Cánh cứng và Cánh màng. Chúng dễ dàng được tinh sạch với nồng độ cao từ dịch lột xác của côn trùng (lớp dịch nằm giữa lớp vỏ cutin cũ và mới) (Arakane, Muthukrishnan, 2010). Chức năng chính của chitinase côn trùng là quay vòng chitin trong quá trình lột xác. Đầu tiên endochitinase sẽ bẻ gẫy ngẫu nhiên cutin tạo thành chitooligosaccharides, sau đó, chúng sẽ được hydrolised hóa bởi các enzyme exo thành GlcNAC. Những phân tử đơn phân này lại được tiếp tục tái sử dụng để tổng hợp một lớp cutin mới. Ngoài ra, chitinase côn trùng còn có vai trò phòng thủ chống lại các ký sinh trùng hoặc thực hiện chức năng tiêu hóa nếu chế độ ăn của chúng có chứa chitin. Việc sản xuất enzyme này được quy định bởi hormone trong quá trình chuyển đổi của ấu trùng. Chitinase côn trùng có thể bị ức chế bởi allosaminidin. Mặc dù chitinase côn trùng đã được nhận diện ở mức độ protein vào những năm 1970, nhưng việc tách dòng một cDNA mã hóa cho chitinase côn trùng chỉ đạt được vào 2 thập kỷ sau đó. Kramer là người đầu tiên báo cáo đã phân lập được một dòng cDNA có độ dài đầy đủ từ sâu sừng thuốc lá (tobacco hornworm), Manduca sexta (Kramer et al., 1993). Kể từ đó, hơn 100 cDNA chitinase từ nhiều loài côn trùng khác nhau đã được tách dòng (Arakane, Muthukrishnan, 2010).
Chitinase từ nấm cũng là một nguồn chitinase được quan tâm nghiên cứu. Thành tế bào nấm là một cấu trúc phức tạp gồm chitin, glucan và một số
polymer khác. Cấu trúc thành tế bào rất linh động thay đổi liên tục trong quá trình tăng trưởng tế bào, phân chia và tạo hình và có những bằng chứng về sự mở rộng liên kết ngang giữa các thành phần này. Chitinase cùng một số enzyme khác có vai trò thủy phân những polymer này liên kết rất chặt chẽ với thành tế bào, có chức năng duy trì độ dẻo cũng như có vai trò trong quá trình phân nhánh và liên kết chéo của các polymer (Matsumoto, 2006; Langner, Gửhre, 2015).
1.3.3 Vai trò của gen mã hóa chitinase
Nấm bệnh là những tác nhân gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới có độ ẩm cao. Kỹ thuật di truyền thực vật tạo tính kháng tốt hơn với việc chuyển gen mã hóa chitinase đang là hướng đi rất triển vọng. Có rất nhiều nghiên cứu được tiến hành để xác định xem chitinase cây trồng có vai trò như thế nào trong việc bảo vệ cây chống lại nấm bệnh. Ở thực vật, việc sản sinh chitinase được xác định là một cơ chế bảo vệ cây trồng trước những nhân tố gây bệnh. Đối với các tác nhân gây bệnh như nấm chứa chitin, phản ứng tự vệ chính của thực vật là tạo ra chitinase. Hầu hết chitinase được sản sinh tại cơ quan bị nhiễm nấm. Theo nghiên cứu của Heddrick và đồng tác giả (1988), trong tế bào hạt đậu nuôi cấy huyền phù và trong đoạn trụ dưới lá mầm, chitinase được tổng hợp sau khi được gây nhiễm với nấm bệnh (Hedrick et al., 1988). Khi bị kích thích 10 lần trong 5 phút, gen mã hóa chitinase phiên mã rất nhanh chóng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào sợi nấm, ngăn cản sự nảy mầm và phát triển của sợi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm. Nấm Trichoderma tiết ra enzyme chitinase ngoại bào tấn công trực tiếp nhiều loại nấm gây bệnh như Rhizotonia solani, Fusarium sonali. Hai enzyme CHIT42 và CHIT33 từ nấm T.
harzianum góp phần tạo tính kháng các loại nấm khác. Các gen mã hóa chitinase từ các loài Trichoderma đã được giải mã, tạo dòng và chuyển vào cây trồng (Seidl et al., 2005).
Theo Jolles và Muzzarelli (1999), các loài nấm mốc như Trichoderma, Gliocladium… cho hàm lượng chitinase cao (Jollès, Muzzarelli, 1999). Nấm Trichodema khi ký sinh trên nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin
của thành tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme β-1,4-N- acetylglucosaminidase và 4 enzyme endochitinase. Rober và Selitrennikoff (1988) cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật, các tác giả cho rằng, chitinase phân lập từ cây lúa mì, lúa mạch và ngô có hoạt tính phân cắt nội mạch phân tử cơ chất và ức chế sự kéo dài sợi nấm (Rober, Selitremennikoff, 1988).
Trong in vivo, chitinase nhanh chóng tích tụ ở mức cao (với rất nhiều các yếu tố phát sinh bệnh học liên quan đến protein) xảy ra trong các mô kháng thể hiện tính quá mẫn cao. Ngoài ra, những biểu hiện của gen chitinase ở thực vật chuyển gen đã cung cấp thêm cho các nhà khoa học những bằng chứng về vai trò của chitinase trong bảo vệ cây trồng. Mức độ bảo vệ của chitinase được quan sát ở cây trồng là biến đổi và có thể bị ảnh hưởng bởi các hoạt động cụ thể của các enzyme, vị trí và nơi tập trung trong tế bào, các đặc tính của mầm bệnh nấm.
Gen mã hóa chitinase được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới sử dụng để chuyển vào các đối tượng cây trồng và thu được những kết quả khả quan. Thông qua các phương pháp chuyển gen khác nhau, gen mã hóa chitinase từ thực vật và vi sinh vật đã được chuyển vào các loài thực vật giúp tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh (Kramer, Muthukrishnan, 1997; Eilenberg et al., 2006; Renner, Specht, 2012).
Việc chuyển gen mã hóa chitinase từ thực vật và vi khuẩn vào cây thuốc lá đã làm tăng hoạt tính kháng nấm gây hại của cây (Jach et al., 1995; Carstens et al., 2003).
Cây thuốc lá được chuyển gen mã hóa chitinase từ đậu tương đã có sức đề kháng cao hơn với nấm Rhizoctonia solani. Sự biểu hiện đồng thời của cả hai gen mã hóa chitinase và glucanase trong thuốc lá làm cho cây có tính kháng nấm gây hại cao hơn cây có một gen đơn (Broglie et al., 1991). Cây thuốc lá cũng cho tính kháng nấm rất cao khi được chuyển đồng thời gen mã hóa protein bất hoạt ribosom và chitinase. Ngoài thuốc lá, những cây trồng chuyển gen mã hóa chitinase có khả năng chống lại một số loại nấm bệnh đã được công bố bao gồm ca cao, dưa chuột, cà chua, hoa hồng, nho, lúa, lạc, đậu tương, lạc, chè, loa kèn… (Liu et al., 2004;
Maximova et al., 2006; Nirala et al., 2010; Iqbal et al., 2012; Leila et al., 2012;
Chen et al., 2015; Jabeen et al., 2015; Karmakar et al., 2015; Nỳủez de Cỏceres González et al., 2015; Singh et al., 2015).
Chitinase thực vật và vai trò của enzyme này trong bảo vệ cây trồng đang tiếp tục được quan tâm nghiên cứu. Đặc biệt, việc chuyển gen mã hóa chitinase vào cây trồng để tăng khả năng kháng nấm đang được quan tâm và là hướng đi triển vọng. Gen mã hóa chitinase được một số phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng trong công nghệ gen thực vật và thu được những kết quả khả quan.