1.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG Ở CÂY CA CAO
1.2.2 Chọn tạo giống ca cao sử dụng công nghệ sinh học
Giống như nhiều loài cây trồng khác, ca cao được nghiên cứu tái sinh nhằm mục đích nhân nhanh và nhiều các giống mới, bảo tồn nguồn gen, ứng dụng trong công tác chọn tạo giống biến đổi gen, tạo vật liệu nguồn để lai ghép giống. Tuy nhiên, đối với cây ca cao, việc xây dựng quy trình nuôi cấy mô in vitro và tái sinh phục vụ công tác chuyển gen là hết sức khó khăn, một phần do ca cao là cây gỗ có chu kỳ sống dài. Việc nghiên cứu và hoàn thiện các phương pháp nhân giống vô tính ca cao có những bước tiến triển chậm. Hiện nay, cây ca cao chủ yếu được tái sinh từ hạt và ghép cành. Các hạt ca cao thường được tạo ra thông qua giao phấn nên không được thử nghiệm đánh giá trước, sự phân ly của những hạt không rõ nguồn gốc sẽ cho những cá thể không tốt như dự kiến. Các cây ca cao có nguồn gốc từ hạt thường không ổn định về các tính trạng nông học. Ngoài ra, cũng có một số điểm không thuận lợi khi nhân giống ca cao vô tính từ ghép, chiết hoặc giâm cành như tốn nhân công và chi phí cao, tỷ lệ tái sinh thấp (Figueira, Janick, 1993; Li et al., 1998).
Những nghiên cứu ban đầu về nuôi cấy tái sinh in vitro cây ca cao thông qua phôi soma tập trung vào việc phát sinh phôi trực tiếp từ các phôi hợp tử chưa trưởng thành (Pence et al., 1980; Esan, 1992). Mặc dù các phôi soma được phát triển từ các mô có nguồn gốc từ phôi hợp tử nhưng việc chuyển dạng hoặc làm nảy mầm các phôi soma này gặp không ít khó khăn. Một số nhóm đã nghiên cứu tạo phôi soma từ các mô hoa và mô phôi tâm nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến di truyền phát sinh khi sử dụng các mô hợp tử (Figueira, Janick, 1993; Sondahl et al., 1993; Alemanno et al., 1996; Li et al., 1998). Mặc
dù đã có những thành công nhất định trong hướng nghiên cứu này, nhưng hiệu quả phát sinh phôi soma và tạo cây ca cao được công bố vẫn còn rất thấp.
Nhiều nhóm nghiên cứu đã gặp khó khăn trong tạo rễ và vi nhân giống in vitro (Flynn et al., 1990; Figueira, Janick, 1993). Ngoài ra, khả năng ứng dụng của các công nghệ này trong nhân giống vô tính ca cao chưa cao khi phần lớn các dòng ca cao không thể phát sinh phôi soma (Pence, 1989). Việc tái sinh in vitro cây ca cao thông qua phôi soma là một hướng thay thế có triển vọng. Để tăng hiệu quả của phương pháp tái sinh in vitro ca cao qua phôi soma, Li và đồng tác giả (1998), Maximova và đồng tác giả (2002) đã xây dựng quy trình phát sinh phôi soma từ lá mầm của phôi soma sơ cấp và thứ cấp. Ở cây ca cao, nguồn mẫu cấy chính được sử dụng là nụ hoa (bao gồm nhị lép (staminode) và cánh hoa (petal)) (Li et al., 1998;
Maximova et al., 2002). Quainoo và đồng tác giả (2008) đã khai thác quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma này như là công cụ để loại bỏ virus gây bệnh trên cây ca cao (Quainoo et al., 2008). Tuy nhiên, ở ca cao, sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây được công bố là phụ thuộc nhiều vào từng dòng (Maximova et al., 2002;
Maximova et al., 2003). Trong khi, nhiều dòng còn gặp khó khăn khi thực hiện tái sinh trong phòng thí nghiệm. Dưới đây là một số nghiên cứu về phát sinh phôi soma ở ca cao.
Giai đoạn cảm ứng: Phương pháp tạo phôi ca cao từ phôi hợp tử chưa trưởng thành đã được sử dụng với một vài cải biến ở nhiều phòng thí nghiệm (Pence et al., 1980). Phôi hợp tử chưa trưởng thành của ca cao được tách khỏi noãn của các quả ca cao đã khử trùng bề mặt và đặt trên môi trường cảm ứng MS (Murashige, Skoog, 1962) thường chứa casein hydrolysate. Sự phát sinh được thúc đẩy nhờ sự có mặt của auxin, nước dừa hoặc các peptone. Nghiên cứu phôi hợp tử dựa trên môi trường lỏng thay vì môi trường bán lỏng cũng có thể tăng cường phát sinh phôi trực tiếp (Pence et al., 1980). Cơ sở di truyền của mô đóng vai trò quan trọng bởi vì các phôi hợp tử từ các loài khác nhau có phản ứng phát sinh phôi rất khác nhau. Giai đoạn phát triển của phôi chưa trưởng thành được sử dụng cũng là yếu tố ảnh hưởng. Các phôi có kích thước từ 4 - 10 mm cho hiệu quả tạo phôi soma cao nhất trên môi trường có auxin và nước dừa so với các giai đoạn sớm và muộn hơn (Pence et al., 1980).
Phôi soma có thể được phát sinh từ lá mầm của các phôi hợp tử trưởng thành sử dụng phương pháp hai bước (Aguilar et al., 1992). Các mảnh lá mầm trưởng thành được đặt trên môi trường có chứa cytokinin và auxin trong tối trong 3 tháng. Trong giai đoạn này các phôi ở giai đoạn hình cầu và hình thủy lôi được hình thành. Các phôi này sau đó được chuyển sang môi trường không có các chất tăng trưởng, nuôi ngoài sáng một tháng nữa để tiếp tục phát triển.
Ngoài phát sinh phôi trực tiếp, các phôi hợp tử chưa trưởng thành cũng được sử dụng để phát sinh mô sẹo có khả năng tạo phôi. Ngoài 2,4-D kích thích sự hình thành phôi, nước dừa hoặc thay thế sucrose bằng glucose hoặc fructose cũng cho kết quả khả quan. Ở một dòng phát sinh qua mô sẹo, gibberellic acid (GA3) cũng thúc đẩy sự hình thành phôi. Mặc dù phôi soma được tạo thành công, các phương pháp này sử dụng các phôi hợp tử làm vật liệu nuôi cấy khởi đầu và không hữu ích cho việc nhân giống vô tính. Các mô khác của ca cao không có phản ứng trong phát sinh phôi soma. Một số quy trình đã được nghiên cứu thành công. Phát sinh phôi soma đã được công bố từ mô lá ca cao, kích thích bởi auxin và cytokinin ở nồng độ rất cao (Litz, 1986). Các phôi được hình thành nhưng không phát triển tiếp mà chỉ dừng ở giai đoạn tạo phôi hình tim.
Quy trình phát sinh phôi soma từ mô phôi tâm và hoa với nhiều bước đã được Sondahl và đồng tác giả (1993) xây dựng. Quy trình sử dụng môi trường bán lỏng để tái sinh, phát triển phôi, tạo phôi trưởng thành và chuyển dạng.
Phôi tâm được nuôi cấy trong tối trên môi trường khoáng có giảm nồng độ các muối MS và bổ sung auxin, cytokinin, polyvinylpyrrolidone (PVP) cùng rất nhiều các hợp chất hữu cơ khác như casein hydrolysate, cystein, cao mạch nha, nước dừa. Các phôi nhỏ sau khi hình thành được chuyển sang nuôi cấy ngoài sáng trên môi trường phức tạp khác có chứa auxin và cytokinin, GA, abscisic acid (ABA). Sau khi lá mầm xuất hiện, các phôi được chuyển sang môi trường trưởng thành chứa cytokinin, auxin, GA và ABA cùng sucrose và charcoal với nồng độ tăng. Môi trường cho phép rễ hình thành và chồi phát triển chuẩn bị cho chuyển dạng. Các phôi soma cũng được tạo từ cánh hoa chưa trưởng thành nuôi cấy trên môi trường có auxin và cytokinin. Phôi hình thành được chuyển sang môi trường phát triển… giống như các phôi phát sinh từ phôi tâm
(Sondahl et al., 1993). Figueira và Janick (1993) cũng tiến hành nuôi cấy phôi tâm sử dụng môi trường cảm ứng dạng lỏng. Sau hai tháng nuôi trong tối, mô sẹo được chuyển sang môi trường bán lỏng bổ sung cytokinin, cao mạch nha, nước dừa và PVP, nuôi tiếp trong hai tháng. Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được chuyển sang môi trường duy trì với muối MS và casein hydrolysate nhưng không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng và các phức hợp khác.
Bước này có sự tạo phôi hình cầu và hình thủy lôi. Những phôi này sẽ tiếp tục trưởng thành và sẵn sàng cho chuyển dạng thành cây khi được chuyển sang môi trường lỏng có chứa sucrose nồng độ thấp 1% và 4,4% sorbitol. Tiền phôi được tạo thành công từ mô phôi tâm và mô trong vỏ sử dụng môi trường đơn giản hơn chứa auxin và cytokinin, nuôi trong tối. Tuy nhiên, các phôi này không phát triển tiếp, có thể do sự có mặt của các hợp chất phenolic tích tụ trong phôi. Vấn đề này không được giải quyết khi bổ sung nitrate bạc vào môi trường. Bước quyết định trong quá trình này là loại auxin và cytokinine sau 2 - 3 tuần trên môi trường cảm ứng sử dụng amino acid và nước dừa. Sau 6 - 8 tuần tiếp theo, các phôi hình cầu được chuyển sang môi trường thứ ba có bổ sung muối với nồng độ giảm một nửa, auxin, GA3, adenine sulfate và maltose để trưởng thành (Figueira, Janick, 1993).
Giai đoạn phát triển phôi soma: Sự phát triển trực tiếp phôi soma từ mô phôi hợp tử xảy ra qua 2 giai đoạn hoàn toàn khác biệt. Giai đoạn 1 là giai đoạn nảy chồi (budding). Trong giai đoạn này, các cấu trúc tương tự tuyến lông trên bề mặt của phôi hợp tử hình thành các phôi soma (các phôi trải qua các giai đoạn phát triển thông thường của sự hình thành phôi). Sự phát triển này được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét, trong đó bề mặt nhăn nheo của phôi ở giai đoạn phôi hình cầu chuyển sang nhẵn nhụi ở giai đoạn hình tim.
Trong khi đó, ở giai đoạn không nảy chồi (nonbudding), phôi soma phát triển từ mô lá mầm bên trong (Pence et al., 1980). Trong một số trường hợp, dường như phôi dạng không tạo chồi ngừng phát triển trước khi lá mầm xuất hiện và hình thành phôi dạng chồi từ bề mặt của chúng.
Tương tự về mặt hình thái như phôi hợp tử, các phôi soma của ca cao cũng có khả năng tổng hợp sinh học bình thường. Anthocyanins, acid béo,
triglycerides và alkaloids cũng có thể được tích tụ trong phôi soma trong quá trình trưởng thành in vitro theo cách tương tự như đối với phôi hợp tử in vitro mặc dù ở các mức thấp hơn so với những quan sát ở phôi hợp tử trưởng thành in vivo (Pence, 1989).
Giai đoạn chuyển dạng từ phôi sang cây: Các phôi ca cao chưa trưởng thành, từ phôi hợp tử hay soma không sẵn sàng trải qua giai đoạn chuyển dạng sớm thành cây bình thường. Một số phương pháp đã được xây dựng để chuyển phôi soma thành cây con. Rễ ở các phôi soma ca cao được phát triển nhờ nuôi cấy trên môi trường với nồng độ muối MS giảm 50% và nhờ chuyển phôi sang môi trường mới chuẩn bị (Wang, Janick, 1984). Các phôi soma ca cao nuôi cấy trên môi trường có chứa zeatin và naphthalene acetic acid (NAA) có thể nảy mầm khi lá mầm được loại (Noval et al., 1986). Điều này cho thấy khả năng có sự tồn tại của chất ức chế nảy mầm ở trong lá mầm. Sondahl và đồng tác giả (1993) sử dụng môi trường chứa nước dừa, BAP, IAA, GA3, ABA và charcoal cho quá trình nảy mầm phôi soma được tạo ra từ quá trình phát sinh phôi soma nhiều bước: phát sinh, phát triển và trưởng thành. Figueira và Janick (1993) đã chuyển phôi soma trưởng thành sang môi trường bán rắn của cây gỗ với fructose. Phôi sau đó được chuyển sang tủ nuôi cấy với 20.000 ppm - CO2 kích thích sự nảy mầm.
Chuyển dạng phôi sang cây là một bước không đơn giản. Nhiều quy trình đã được công bố, trong đó có quy trình loại bỏ một phần hoặc hoàn toàn lá mầm. Nếu phôi soma từ vật liệu nuôi cấy vô tính có thể chuyển dạng sang cây với hiệu suất cao, ứng dụng của công nghệ phát sinh phôi soma có thể giải quyết được vấn đề rất lớn trong cải tiến giống và bảo tồn nguồn gen ca cao.
Tiếp tục các nghiên cứu tái sinh in vitro cây ca cao, khắc phục các nhược điểm của các nghiên cứu trước đó, năm 1998, Li và đồng tác giả đã công bố quy trình tái sinh in vitro cây ca cao thành công từ phôi soma sử dụng các mô hoa của một số dòng ca cao. Quy trình này sau đó đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác (Maximova et al., 2002; Maximova et al., 2003; Traore et al., 2003; Maximova et al., 2005; Maximova et al., 2006; Maximova et al., 2008;
Silva et al., 2009). Các cây ca cao tạo ra từ phôi soma được trồng trong nhà
kính và biểu hiện những tính trạng nông học tương tự với các cây trồng có nguồn gốc từ hạt (Li et al., 1998). Niemenak và đồng tác giả (2008) đã nghiên cứu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System - TIS) trong sản xuất lượng lớn phôi soma và tăng hiệu suất chuyển dạng phôi (Niemenak et al., 2008).
Bên cạnh các nghiên cứu về hoàn thiện các quy trình để tái sinh in vitro cây ca cao với hiệu suất cao nhất, một số tác giả cũng tiến hành nghiên cứu các gen liên quan đến tăng cường phát sinh phôi soma. Các gen liên quan đến yếu tố phiên mã như BBM và LEC2 có trong cây Arabidopsis thaliana (AtBBM, AtLEC2) cũng đã được phân lập từ T. cacao (TcBBM, TcLEC2). Sự biểu hiện của TcBBM, TcLEC2 đã được quan sát thấy trong suốt quá trình phát triển phôi soma. Mức độ biểu hiện của các gen ở phôi soma và phôi hợp tử cũng được so sánh. Nghiên cứu của Zang và đồng tác giả (2014), Florez và đồng tác giả (2015) đã xác nhận rằng TcBBM, TcLEC2 là các gen tương đồng với AtBBM và AtLEC2 và có một vai trò đặc biệt trong phát sinh phôi soma và phôi hợp tử. Mức độ phiên mã của TcBBM, TcLEC2 có thể sử dụng như là một chỉ thị sinh học để đánh giá khả năng phát sinh phôi trong mô ca cao (Zhang et al., 2014; Florez et al., 2015).
1.2.2.2 Nghiên cứu tạo cây ca cao chuyển gen
Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị vào cây ca cao: Trên đối tượng cây ca cao, những công bố đầu tiên cho thấy sự mẫn cảm của tế bào ca cao với A.
tumefaciens và sự biến đổi của các tế bào ca cao (Purdy, Dickstein, 1989; Sain et al., 1994). Việc sử dụng phương pháp bắn gen (bắn các hạt vàng vận tốc cao để gắn DNA vào tế bào thực vật nuôi cấy) đã được báo cáo trên đối tượng ca cao (Perry et al., 2000; Santos et al., 2002). Hai nghiên cứu đã cho thấy gen ngoại lai có thể được đưa vào các tế bào ca cao, tuy nhiên, không có nghiên cứu nào thành công trong việc tái sinh cây ca cao chuyển gen.
Hiện nay, với mục đích thiết lập và tối ưu hóa quy trình chuyển gen kết hợp hệ thống tái sinh in vitro từ phôi soma của ca cao, đã có một số nghiên cứu sử dụng các gen chỉ thị như gen mã hóa protein phát huỳnh quang (Enhanced Green Fluorescent Protein - EGFP) và gen chỉ thị nhuộm màu mụ tế bào ò-
glucuronidase (gus) chuyển vào cây ca cao thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Khởi đầu của những nỗ lực chuyển gen vào ca cao, nhóm nghiên cứu của Furtek tại Trường Đại học Bang Pennsylvania, Hoa Kỳ đã thăm dò phương pháp chuyển gen vào ca cao sử dụng các tế bào lá (Furtek, 1994). Mặc dù nhóm nghiên cứu đã có thể chuyển được gen ngoại lai vào các tế bào cây ca cao sử dụng A. tumefaciens, tuy nhiên hiệu quả chuyển gen thấp và không có khả năng phát sinh phôi. Năm 2003, Maximova và đồng tác giả đã mô tả quy trình chuyển gen mã hóa protein phát huỳnh quang vào ca cao thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens chủng AGL1. Kết quả đã tạo được các cây chuyển gen có khả năng tạo ra các protein có phát huỳnh quang khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Các nghiên cứu về hình thái và sinh lý học của nhiều cây ca cao chuyển gen cho thấy không có sự thay đổi về kiểu hình so với các cây ca cao không chuyển gen. Việc đưa các vùng MARs (Matrix attachment regions) của thuốc lá (Allen et al., 1996; Spiker, Thompson, 1996) vào T-DNA đã làm tăng sự biểu hiện, ổn định và đồng nhất của gen mã hóa protein phát huỳnh quang ở các cây ca cao chuyển gen. Sự phân ly và biểu hiện của các cây ca cao chuyển gen ở thế hệ T1 cho thấy sự tiếp hợp và biểu hiện ổn định của gen chuyển ở một trong các dòng ca cao được đánh giá. Một yếu tố quan trọng khác quyết định sự thành công của phương pháp này chính là nghiên cứu gần đây cho thấy kháng sinh moxalactam rất hiệu quả trong chọn lọc ngược (counter-selection) A.
tumefaciens và tăng hiệu quả tái sinh phôi soma thứ cấp (Antúnez de Mayolo et al., 2003).
Năm 2009, nhóm nghiên cứu tại Brazil thông qua gen chỉ thị gus đã nhận thấy ảnh hưởng tớch cực của cỏc polyamine và khỏng sinh diệt khuẩn ò-lactam đến quá trình phát sinh phôi soma trong quá trình chọn lọc và tái sinh cây ca cao chuyển gen. Cỏc khỏng sinh ò-lactam timentin và meropenem sử dụng chọn lọc A.tumefaciens có thể sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen vào ca cao.
Kháng sinh hygromycin sử dụng cho chọn lọc ở thực vật gây ức chế mạnh đến sự phát triển phôi soma thứ cấp. Nồng độ kháng sinh hygromycin sử dụng phù hợp nhất là ở 20 mg/l. Nghiên cứu cũng hoàn thiện quy trình chuyển gen với thời gian siêu âm mảnh mô là 100 giây, thời gian lây nhiễm A. tumefaciens là