Sử dụng bức xạ gamma và chỉ thị phân tử liên kết với tính chịu hạn để tạo giống lúa chịu hạn

Mở đầu Lúa lơng thực quan trọng ngời Trên giới lúa đợc xếp vào vị trí thứ hai sau lúa mỳ sản lợng diện tích Châu lúa đợc coi lơng thực quan trọng chiếm diện tích 135 triệu tổng số 148,4 triệu toàn giới Mặc dù sản lợng lúa gạo hàng năm tăng, nhiên theo thông báo FAO có 39 nớc thiếu lơng thực có 25 nớc Châu Phi Trong yếu tố khí hậu, đất đai, cỏ dại dịch bệnh, hạn hán yếu tố khốc liệt ảnh hởng lên suất trồng Đặc biệt lúa bán thuỷ sinh hạn hán yếu tố làm giảm suất chí làm mùa tuỳ vào cờng độ nh thời gian tác động lên trình sinh trởng phát triển Theo số liệu thống kê năm 2002 diện tích gieo trồng lúa hàng năm nớc ta biến thiên từ 7,3-7,5 triệu 1,5-1,8 triệu bị thiếu nớc 1,5-2,0 triệu cần phải đầu t để chống úng gặp ma to ma tập trung Điển hình cho hạn hán nớc ta phải kể đến hai năm 1993 1998 Trong năm 1993 hạn hán kéo dài miền Trung Nam làm suất lúa giảm từ xuống tấn/ Năm 1998 hạn nặng hai vụ (Xuân Mùa) làm tỉnh miền Trung nh Nghệ An, Quảng Trị hầu nh không đợc thu hoạch ( Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Vì việc nghiên cứu tính chịu hạn chọn tạo giống lúa có khả chịu hạn trở thành nội dung nghiên cứu quan trọng Việt Nam giới Các phơng pháp tạo giống truyền thống thời gian dài mang đến giá trị định thực tiễn sản xuất song nhiều hạn chế Ngày việc sử dụng đột biến nhân tạo phơng pháp có giá trị chọn giống trồng, thuận lợi chủ yếu phơng pháp kiểu gen giống bị thay đổi so với việc lai tạo hai giống khác biệt mà cải thiện đợc số đặc tính rút ngắn đợc thời gian chọn lọc Trong số tác nhân vật lý gây đột biến tia gamma đợc sử dụng nhiều nghiên cứu chọn giống với mục đích cải thiện đặc tính nông học trồng (Nguyễn Hữu Đống) [6] Cùng với trợ giúp thị phân tử (MAS-Marker Assisted Selecsion) liên kết chặt với gen đặc hiệu cho phép nhà chọn tạo giống phát có mặt hay vắng mặt gen quan tâm mà không cần đánh giá kiểu hình, mà chọn tạo giống trở nên nhanh hiệu lúa thị STS, SSR liên kết với tính trạng hình thái rễ đợc sử dụng để chọn dòng chịu hạn Xuất phát từ phân tích chọn đề tài: S dng bc x gamma v ch th phõn t liờn kt vi tớnh chu hn to ging lỳa chu hn Với mục đích nghiên cứu ảnh hởng phóng xạ lên khả nảy mầm, sinh trởng phát triển mạ, đánh giá thay đổi hệ gen dòng chiếu xạ, bớc đầu chọn lọc dòng mang tính chịu hạn phục vụ cho công tác chọn giống Chơng Tổng Quan Tài Liệu 1.1 Đại cơng lúa 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa trồng Cây lúa trồng có từ lâu đời, gắn liền với trình phát triển xã hội loài ngời Lúa trồng có nguồn gốc từ lúa hoang dại trình chọn lọc tự nhiên chọn lọc nhân tạo lâu dài mà nên Qua công trình nghiên cứu nhiều tác giả cho thấy nguồn gốc lúa từ vùng đầm lầy nóng ẩm Đông Nam á, sau đợc lan truyền nhiều nơi Theo đặc điểm sinh vật học trình diễn biến lúa trồng thuộc họ Graminae (nay Poaceae), chi Oryza, loài Oryza-sativa L Chi Oryza có 23 loài có hai loài lúa trồng Oryza sativa phổ biến Châu Oryza glaberrima phổ biến Tây Phi (Oka, 1958) Oryza sativa có loài phụ Indica (lúa tiên), Japonica (lúa cánh), Javanica (lúa bù lu) Indica loại hình lúa đợc trồng vùng nhiệt đới, Japonica lúa đợc trồng vùng ôn đới, loại hình trung gian Javanica Japonica nhiệt đới (Glaszman, 1987) [10] Lúa trồng chủ yếu Oryza sativa, loại lúa đợc trồng điều kiện ruộng nớc, trình sống phát triển chịu tác động chọn lọc tự nhiên chọn lọc nhân tạo mà hình thành nên nhiều loài lúa phù hợp với điều kiện sinh thái nh: lúa nớc, lúa nơng, lúa Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L) đợc gọi lúa Châu đợc hoá từ lúa dại từ trung tâm Châu á: Assam (ấn Độ), biên giới Thái Lan-Myanma, Trung Du Tây Bắc Việt Nam Theo đặc điểm lúa trồng việt Nam chủ yếu giống Indica (Bùi Huy Đáp, 2000) [5] 1.1.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam giới Lúa lơng thực quan trọng đời sống ngời Lúa cung cấp lơng thực cho 1/2 dân số giới, 2/3 lợng calo cho tỷ dân Châu , 1/3 lợng calo cho 1,5 tỷ dân Châu Phi Mỹ La Tinh Trong cấu sản xuất lơng thực giới, lúa mỳ chiếm 30,5%, lúa gạo 26,5%, ngô 24% lại loại ngũ cốc khác Trên giới diện tích trồng lúa Châu chiếm 89,5% tổng diện tích sản lợng chiếm 91,1% tổng sản lợng Trong ấn Độ nớc có diện tích trồng lúa lớn giới (42 triệu với sản lợng 121,3 triệu tấn), Trung Quốc nớc có sản lợng lúa cao giới (187,45 triệu tấn), Thái Lan nớc xuất gạo đứng đầu giới chiếm 30% thị phần thị trờng giới Việt Nam lúa trồng 70% dân số Diện tích trồng lúa không tăng nhng sản lợng lúa hàng năm tăng lên rõ rệt Đặc biệt 10 năm trở lại (1993-2003) sản lợng lúa bình quân tăng triệu năm (Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn) Hiện Việt Nam nớc xuất gạo đứng thứ hai giới, điển hình năm 1999 kỷ lục xuất gạo 4,55 triệu Tuy nhiên nớc ta suất lúa cha ổn định điều kiện khí hậu địa hình không phẳng, đồng thời cha trọng nhiều đến chất lợng nên nhiều vấn đề bất cập Vì cần phải đầu t để tạo giống lúa cho suất cao, ổn định; phẩm chất tốt; sức chống chịu thích nghi với vùng sinh thái khác 1.2 Đại cơng tính chịu hạn trồng 1.2.1 Hạn tác hại hạn lên thực vật 1.2.1.1 Khái niệm phân loại hạn Nớc có vai trò quan trọng thực vật, thiếu nớc gây nên hậu lớn cho hoạt động sống Trớc tiên ảnh hởng đến cân nớc cây, sau ảnh hởng đến quang hợp, hô hấp, trao đổi chất, sinh trởng phát triển Nguyên nhân gây nên thiếu nớc trồng thờng hạn hán Hạn khái niệm dùng để thiếu nớc thực vật môi trờng gây nên suốt trình hay giai đoạn làm ảnh hởng đến phát triển Những có khả trì phát triển bình thờng cho suất ổn định điều kiện khô hạn gọi chịu hạn Và khả thực vật để ngăn ngừa tổn thơng thiếu hụt nớc gây gọi tính chịu hạn Về mặt cân nớc hạn hán đợc chia làm hai giai đoạn chính: Hạn không khí hạn đất Hạn không khí thờng xẩy không khí môi trờng có nhiệt độ cao (39-42oC) độ ẩm thấp (dới 65%) nớc ta tợng thờng gặp tỉnh khu Bốn vào tháng có gió Tây Nam vùng Bắc vào cuối thu đầu đông Đối với thực vật nói chung lúa nói riêng hạn không khí thờng gây tợng héo tạm thời làm cho phận non bị thiếu nớc Mức độ phản ửng với thiếu hụt nớc tuỳ thuộc giai đoạn phát triển Đối với lúa, hạn không khí ảnh hởng nghiêm trọng giai đoạn bắt đầu hình thành quan sinh sản đến lúc kết thúc trình thụ phấn Nguy hại vào giai đoạn lúa phơi màu Vì nhiệt độ cao độ ẩm thấp làm cho hạt phấn khả nảy mầm , trình thụ phấn không diễn làm hạt bị lép Hạn không khí kéo dài làm khô đất dẫn đến hạn đất Hạn đất làm mức áp suất thẩm thấu không cạnh tranh đợc với lực giữ nớc đất khiến lấy nớc vào tế bào qua rễ, làm toàn bị thiếu nớc dẫn đến bị héo lâu dài Hạn đất phụ thuộc nhiều vào bốc nớc bề mặt khả giữ nớc đất Đất thịt nặng có khả giữ nớc cao (57%), đất cát giữ nớc (19%), (McKersie & Cs, 1994) Nói chung hạn không khí hạn đất thờng song song với đợc gọi hạn kết hợp Đây loại hạn khốc liệt nhất, kéo dài làm héo vĩnh viễn khả phục hồi Tuy nhiên, có lúc đất đủ nớc mà bị héo nh: gặp nhiệt độ thấp, thiếu oxy, hay bị ngập mặn bị bón phân hoá học đậm đặclàm hoạt động rễ bị giảm sút Trờng hợp gọi hạn sinh lý 1.2.1.2 Tác hại hạn lên thực vật Hạn có tác hại lớn Trớc tiên phá vỡ cân nớc cây, từ ảnh hởng đến hoạt động sinh lý khác nh: Hô hấp, quang hợp, dinh dỡng khoáng, vận chuyển tích luỹ chất hữu Hạn ảnh h ởng tổng hợp lên sinh trởng phát triển cây, làm giảm suất thu hoạch Hạn kết hợp với gió nóng, khô làm chết phần lớn lá, tầng dới ( hoà thảo làm khô đầu lá, gỗ gây chết đỉnh cành) Hạn gây nớc, để bù lại phần lợng nớc phải hút nớc từ nụ, hoa chồi non gây hại trực tiếp cho phận Làm rụng nụ, hoa non, làm giảm suất thu hoạch Nếu hạn muộn vào giai đoạn cuối làm ảnh hởng đến tạo vận chuyển dinh dỡng hạt làm hạt bị lép ( Trần Nguyên Tháp, 2001) [19] Về ảnh hởng hạn đến cấu trúc chức sinh lý tế bào hàng loạt nghiên cứu Maximop, Ratne, Moise thống bị héo trạng thái chất nguyên sinh tế bào bị thay đổi mạnh Độ phân tán hệ thống keo bị giảm , làm giảm khả trơng nớc tính đàn hồi keo sinh chất Các biến đổi chuyển từ chiều hớng tổng hợp sang phân giải hoàn toàn bất lợi cho trao đổi chất tế bào Hạn ảnh hởng pha sinh trởng giãn tế bào Nếu tế bào giai đoạn giãn mà bị thiếu nớc tế bào ngừng sinh trởng còi cọc Vì ngời ta điều khiển sinh trởng thông qua việc điều tiết nớc 1.2.2 Cơ chế chống chịu hạn Trong điều kiện hạn, số trồng sinh trởng phát triển hình thành suất, số trồng không cho thu hoạch Nguyên nhân chúng có chế chống chịu hạn khác Có ba kiểu chống chịu hạn trồng là: lẩn tránh hạn (trốn hạn), chịu hạn nớc mô cao chịu hạn nớc mô thấp 1.2.2.1 Cơ chế lẩn tránh hạn Lẩn tránh hạn khả hoàn thành chu kỳ sống chúng trớc thiếu hụt nớc nghiêm trọng xảy Thực vật thuộc nhóm thờng hàng năm, hay đoản sinh trởng sống xa mạc Chúng có thời gian sinh trởng ngắn Hạt giống chúng nảy mầm bắt đầu có ma đất ẩm, sau chúng sinh trởng phát triển nhanh chóng, hình thành hạt chết trớc mùa khô hạn đến Nói chung thực vật đặc trng thích ứng cho chống chịu hạn Song chúng thờng thẩm thấu thấp nên chống chịu thiếu hụt nớc môi trờng 1.2.2.2 Cơ chế chịu hạn nớc mô cao Để trì trạng thái nớc cao mô bay nớc mạnh độ thiếu hụt nớc đất lớn trồng cần có hai đặc trng sau: Hạn chế thoát nớc trì việc cung cấp nớc Cây giảm thoát nớc ba đờng hớng sau: - Điều chỉnh đóng mở khí khổng: Khí khổng đợc đặt biểu bì không thấm nớc hoạt động nh van điều chỉnh độ ẩm độ khô không khí, tạo chế kiểm soát tốc độ nớc Đây chế sinh lý hiệu để hạn chế nớc Những mọng nớc thờng đóng khí khổng để giảm nớc Khí khổng chúng nhạy cảm với giảm nớc tổng số có khuynh hớng mở khí khổng vào ban đêm thoát nớc thấp để tiếp nhận co2 Khí khổng chúng không mở liên tục, chí đến 40 ngày nh xơng rồng nớc đất thấp nớc Giá trị nớc gây đóng khí khổng khác khác nhau, phụ thuộc vào tuổi điều kiện môi trờng Ví dụ khí khổng dâu đóng nớc -8 bar, -28 bar Tuy đóng khí khổng quan trọng để trì trạng thái nớc mô Nhng gây hiệu ứng kèm theo giảm trao đổi khí quang hợp, giảm quang hợp suất Và nớc nhiều khí khổng không khả đóng dẫn đến nớc ạt chết (Bohnert & Jensen, 1996) [22] - Giảm hấp thụ xạ mặt trời: Cây giảm hấp thu xạ mặt trời cách vận động song song với tia sáng để nhận ánh sáng nhất, đặc biệt vào buổi tra Lá có góc nghiêng 70 độ làm giảm nhiệt độ điều kiện khắc nhiệt xuống 2-30C giảm thoát nớc 8-12% (Jone & Cs, 1981) [27] Ngoài cuộn tròn lá, cụp lá, phủ lớp lông dày lớp sáp dày hay lớp tinh thể muối tránh đợc bay nớc Trong số loài nghiên cứu lớp sáp lúa mỳ có hiệu cao nhất, lớp sáp lúa nớc thấp họ Graminae (bằng khoảng 1/5 so với lúa mỳ) hầu nh liên quan đến thoát nớc (OToole & Cruz, 1983; Jordan & Cs, 1983) [28] [34] - Giảm bề mặt bay nớc: Sự thiếu hụt nớc làm giảm sinh trởng lá, giảm diện tích Ngoài số bị chết bị rụng thiếu nớc làm giảm bay nớc lúa mỳ, giống có hẹp làm giảm bốc thoát nớc có hiệu (Jone & Cs, 1981) Sự giảm diện tích với đóng khí khổng, giảm luợng hấp thu làm giảm quang hợp, sinh trởng suất Cây trì trì hấp thu nớc : Để trì trạng thái nớc cao mô hệ rễ phải đợc tăng mạnh số lợng mật độ Bộ rễ phải ăn sâu để lấy nớc tầng đất sâu khô hạn Vì mà tỷ lệ rễ/ thân tăng lên gặp hạn Ngoài để tăng dòng vận chuyển nớc từ rễ lên đờng kính rễ số lợng mạch dẫn phải tăng Hơn hệ thống rễ phát triễn việc giải đợc vấn đề hạn cải thiện đợc cạnh tranh với cỏ dại dành đợc dinh dỡng (Mambani & Lal, 1983) [31] 1.2.2.3 Cơ chế chịu hạn nớc mô thấp Một đặc tính thích nghi quan trọng bị hạn khả trì sức trơng tế bào nớc chúng giảm Các trình sinh lý, sinh hoá phát sinh hình thái chịu ảnh hởng sức trơng tế bào Cơ chế đợc thực nhờ điều chỉnh áp suất thẩm thấu tính mềm dẻo mô tế bào - Điều chỉnh áp suất thẩm thấu: Khi thực vật tồn môi trờng thiếu nớc bị cân thẩm thấu Để chống lại có chế đặc biệt liên quan đến thay đổi tinh vi sinh hoá tế bào dẫn đến tích luỹ chất tan bao gồm: loại đờng, protein, axit amin, ion K+Các chất có chức điều chỉnh bảo vệ thẩm thấu loại bỏ gốc tự bị thiếu nớc Bng1 Các sản phẩm đợc tích luỹ chức chúng việc chống chịu thiếu nớc (Bohnert & Jensen, 1996) [22] Nhóm chất Tên chất hợp chất Chức Ion K+ Điều chỉnh thẩm thấu, loại bỏ thu nhận Na+ , điều tiết chất dinh dỡng Protein Acid amin Đờng Polyol LEA/dehydrin Bảo vệ thẩm thấu Osmotin Các protein hình thành điều kiện bất lợi SOD/catalase Phân giải gốc tự Proline Điều chỉnh áp suất thẩm thấu Ectoine Bảo vệ thẩm thấu Sucrose Điều chỉnh thẩm thấu Fructan Bảo vệ thẩm thấu, dự trữ carbon Manitol Dự trữ carbon, điều chỉnh thẩm thấu Pinitol Điều chỉnh bảo vệ thẩm thấu, loại bỏ gốc tự Polyamin Spermine Cân ion, bảo vệ chất nhiễm sắc Spermidine Amin bậc Glycine betaine Bảo vệ thẩm thấu - Alanine betaine Bảo vệ thẩm thấu Dimethyl sylfonio Bảo vệ thẩm thấu propionate Sắc tố Carotenoid, anthocyanin Bảo vệ quang ức chế carotenoid betalaine 10 M P2P2 P1P1 10 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 200 bp Hình 3.11 Sản phẩm điện di mồi RM250 dòng CC2 (10: CC2 không chiếu xạ, 11-31: dòng CC2 chiếu xạ) Vậy qua kết phân tích SSR cho thấy chọn lọc đợc 10 dòng lúa chiếu xạ mang thị chịu hạn RDB09, dòng có khả chịu hạn Để khảng định điều cần đánh giá tính chịu hạn điều kiện nhân tạo đồng ruộng Kết phân tích SSR đợc thể chi tiết bảng 3.7 54 Bảng 3.7 Tên dòng lúa phân tích RAPD, SSR kết phân tích SSR STT Tên dòng RM250 CC1 CC1.ĐC.1 P1 CC1.10.1 P2 CC1.10.4 CC1.15.2 CC1.20.6 CC1.20.3 CC1.25.1 CC1.30.4 10 CC2 11* CC2.10.3 ĐH 12 CC2.10.2 ĐH 13 CC2.10.12 ĐH 14 CC2.10.13 ĐH 15 CC2.10.6 P1 16 CC2.10.5 ĐH 17 CC2.10.8 ĐH 18 CC2.10.9 P1 19 CC2.10.15 P1 20 CC2.10.10 ĐH P1 21 CC2.10.11 P1 ĐH 22 CC2.15.9 ĐH 23 CC2.15.20 ĐH 24 CC2.15.19 ĐH 25 CC2.15.13 ĐH 26 CC2.15.16 ĐH 27 CC2.15.18 ĐH 28 CC2.15.6 ĐH ĐH RM263 P1 ĐH 55 29 CC2.15.3 ĐH 30 CC2.15.10 31 CC2.15.11 ĐH 32 CC2.15.5 ĐH 33 CC2.15.15 ĐH 34 CC2.15.4 ĐH 35* CC2.20.7 ĐH 36 CC2.20.16 ĐH 37 CC2.20.3 ĐH 38 CC2.20.15 P1 39 CC2.20.12 ĐH 40 CC2.20.2 ĐH 41* CC2.20.23 ĐH 42 CC2.20.11 ĐH 43 CC2.20.6 ĐH 44 CC2.20.18 ĐH 45 CC2.20.13 ĐH 46 CC2.20.5 ĐH 47 CC2.20.20 ĐH 48 CC2.20.4 ĐH 49 CC2.25.7 ĐH 50 CC2.25.5 ĐH 51 CC2.25.8 ĐH 52 CC2.25.1 ĐH P1 P1 * : Các dòng bổ sung chạy SSR P1: SSR RDP09 P2: SSR R2021 ĐH: SSR đa hình 56 57 Kết luận kiến nghị Kết luận Từ kết phân tích đây, rút kết luận sau Phóng xạ ảnh hởng đến khả nảy mầm thành hạt, ảnh hởng lên sinh trởng phát triển mạ cụ thể liều chiếu xạ tăng dần tỉ lệ nảy mần thành giảm, chiều cao giảm nhng không rõ rệt Từ rút liều chiếu xạ thích hợp cho việc tạo vật liệu khởi đầu cho công tác chọn giống từ 10 đến 25 krad Khả phục hồi sau hạn số dòng chiếu xạ cao so với dòng đối chứng, dòng CC2 chiếu xạ có khả phục hồi cao dòng CC1 chiếu xạ Điều cho thấy phóng xạ tạo đột biến chịu hạn làm tăng khả chống chịu hạn dòng lúa thí nghiệm Kết phân tích RAPD cho thấy có số thay đổi hệ gen nhân dòng lúa dới tác dụng chiếu xạ Kết phân tích SSR cho thấy chọn lọc đợc 10 dòng lúa chiếu xạ (2 dòng CC1 dòng CC2) có khả mang tính chịu hạn Kiến Nghị Sử dụng thêm mồi SSR liên kết với tính trạng hình thái rễ khác, để đánh giá cách toàn diện khả chịu hạn dòng chiếu xạ Có thể sử dụng thêm hình thức chọn lọc qua tính trạng hình thái thân nh chiều cao cây, số nhánh, tỷ lệ hạt lép Tiếp tục nghiên cứu khả chịu hạn dòng chọn lọc hệ để chọn dòng chịu hạn cao, cho suất ổn định điều kiện khô hạn 58 Tài liệu tham khảo Tiếng việt Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1995); ứng dụng công nghệ sinh học cải tiến giống lúa; Nxb Nông Nghiệp TPHCM Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003); Cơ sở di truyền tính chống chịu với thiệt hại môi trờng lúa; Nxb Nông nghiệp TPHCM Bùi Chí Bửu (2004); Hội nghị quốc gia chọn tạo giống lúa; Nxb Nông nghiệp, TPHCM; 12-18 Lê Tiến Dũng (2002); ứng dụng đột biến thực nghiệm tia gamma tạo nguồn vật liệu khởi đầu, phục vụ công tác chọn giống lạc mới, phù hợp với điều kiện sinh thái Thừa Thiên Huế; Luận án TS Nông nghiệp; Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam Bùi Huy Đáp (2000); Nguồn gốc lúa, lúa gạo Việt Nam kỷ 21 hớng xuất khẩu; Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hữu Đống, Đào Thanh Bằng, Lâm Quang Dụ, Phan Đức Trực (1997); Đột biến: Cơ sở lý luận ứng dụng; Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dơng (1998); Sinh học phân tử; Nxb Giáo Dục, Hà Nội Nguyễn Thị Kim Liên (2002); Chọn dòng chịu hạn định vị locut số tính trạng hình thái rễ liên quan đến tính chịu hạn lúa cạn; Luận án TS sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Nguyễn Thị Kim Liên, Nông Văn Hải, Nguyễn Đức Thành (2003); Kết bớc đầu việc ứng dụng thị SSR chọn dòng chịu hạn lúa cạn; Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội; 898-901 59 10.Nguyễn Thị Lẫm, Hoàng Văn Phụ, Dơng Văn Sơn, Nguyễn Đức Thạnh (2003); Giáo trình lơng thực; Nxb Nông nghiệp 11.Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004); Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống trồng; Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 12.Lê Thị Nguyên (2002); Giáo trình kỹ thuật nông nghiệp; Nxb Nông nghiệp, TPHCM 13.Đinh Thị Phòng (2002); Nghiên cứu chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật; Luận án TS Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học 14.Trơng Thị Bích Phợng, Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Hữu Đống (2003); Sự thay đổi cấu trúc tế bào lúa (Oryza Sativa L.) chịu hạn chọn lọc nuôi cấy từ callus đợc chiếu xạ tia gamma Co 60; Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc; Hà Nội 2003 15.Trần Duy Quý (1997); Các phơng pháp chọn tạo giống trồng; Nxb Nông nghiệp Hà Nội; 237-255 16.Khuất Hữu Thanh (2004); Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen; Nxb Khoa học Kỹ thuật; 151-200 17.Nguyễn Đức Thành, Phan Thị Bảy, Lê Hồng Điệp (1999); Phát triển ứng dụng thị phân tử nghiên cứu đa dạng phân tử lúa; Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học; 1205-1215 18.Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Thúy Hạnh (2003); Định vị số locus kiểm soát tính chịu hạn lúa; Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội 2003; 810814 19.Trần Nguyên Tháp (2001); Nghiên cứu xác định số đặc trng giống lúa chịu hạn chọn dòng lúa chịu hạn CH 5; Luận án TS Nông nghiệp, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam 60 20.Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1997); Sinh lý học thực vật; Nxb Giáo Dục 61 Tiếng Anh 21.Adkin S.W, Kunanuvatchaidach R, Godwin I D (1995); Somaclonal variation in rice drought tolerace and other argronomic character; Australia jounal of Botany V4 N2; 201-209 22.Bohert H J, Jensen R G (1996); Strategies for engineering water-stress tolerance in plants; TIBTECH 14; 89-97 23.Brown SM, Kresovich S (1996); Molecular characterization for plant gentic resources conservation; In: Genom mapping in plant; 85-93 24.Champoux MC, Wang G, Sarkarung S, Mackill DT, O'Toole JC, Huang N, McCouch SR (1995); Locating genes associated with root morphology and drought avoidance in rice via linkage to molecular markers theor App Genet 90; 969-981 25.Guerrero F D, Jones T T, Mullet J E (1990); Turgor-reponsive gene trancription and RNA levels increase rapidly when pea shoots are wilted: Sequence and expression of three inducible genes, plant Mol Biol 15; 11-26 26.Gupta P.K, Balyan H.S, Sharama P.C and Ramesh B (1996); Microsettlites in plants: A new class of molecular markers; Current science Vol.70 No.1; 46-53 27.Jones M M, Turner N C, Osmond C B (1981); Mechanisms of drought resistance, physiology and biochemistry of drought resistance in plants; 15-37 28.Jordan W R, Monk R L, Miller F R, Rosenow D T, Clark R E, Shouse P J (1983); Environmental physiology of sorghum I Environmental genetic control of epicular wax load Crop Sci 23; 552-555 29.Kiramat Khan, Muhammad, Abdul, Bashir, Fazli, Hanssan (2003); "Effect of gamma irradiation on yield and yield components of Barley", Pakistan Journal of Biological Sciences (19); 1695-1697 62 30.Kiyosue T, Yamaguchi, Shinozaki K (1994); Cloning of cDNAs for genes that are early-reponsive to dehydration stress (ERDs) in Arabidopsis thaliana L indentification of three ERDs as HSP cognate genes; Plant Mol Biol 25; 791-798 31.Manbani B, Lal R (1983); Reponse of upland rice varieties to drought stress I Relation between root system development and leaf water potential Plant soil 73; 59-72 32.Mckersie B D, Lesham Y Y (1994); Stress and stress croping in cultivated plants Academic Publishers 33.Nguyen H T, Babu C R, Blum A (1997); Breeding for drought in rice: Physiology and molecular genetic considerations Crop Sci 37: 14201434 34.O'Toole J C (1982); Adaptation of rice to drought prone environments, In: Drought resistance in crops with emphasis on rice IRRI Los Banos Philipines; 195-213 35.Saghai Maroof M A, Biyashev R M, Yang G P, Zhang Q, Allard R W (1994); Extraodirarily polymorphic microsetellite DNA in barley: Species diversity, chromosome location, and population dynamics; Proc Natl Acad Sci USA, 91; 5466-5470 36.Saradhi A, Saradhi P P (1991); Proline accumulation under heavy metal stress; J plants physiol 138; 554-558 37.Shen L, Courtois B, McNally K, McCouch S R, Li Z (1999); Developing near- isogenic lines of IR64 introgressed with QTLs for deeper and thicker roots through marker-aided selection In: Genertic improvement of rice for water limited environments; IRRI; 275-289 38.Winter P, Kahl G (1995); Molecular marker technologies for plant improvement; World journal of microbiology and biotechnology 11; 438-448 63 39.Yoshida S, Hasegawa S (1982); The rice root system: Its development and function; In: Drought resistance in crops with emphasis on rice IRRI; 87-114 40.Zhang J, Chandra Babu R, Pantuwan G, Kamoshita A, Blum A, Wade L, Sarkarung S, O'Toole J C, Nguyen H T (1999); Molecular dissection for drought tolerance in rice from physio-morphological traits to field performance; In genetic improvements of rice for water limited environments; IRRI; 331-343 64 Những từ viết tắt ADN : Acid deoxyribonucleic AFLP : Đa hình độ dài đoạn đợc nhân chọn loc (Amplified Fragment Length Polymorphism) bp : Cặp bazơ (base pair) CTAB : Cetyltrimethyl- amoniumbromide Cs : Cộng dNTP : Deoxyribonucleic triphosphate EDTA : Ethylenediamin tetraacetate EtBr : Ethidium bromide Kb : Kilo bazơ NST : Nhiễm sắc thể PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) RAPD : Đa hình ADN nhân ngẫu nhiên (Random amplified polymorphic DNA) RFLP : Đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism) Rnase : Ribonuclease SSR : Các đoạn lặp lại có trình tự đơn giản ( Simple sequence repeats) STS : Trình tự vị trí đợc đánh dấu (Sequence tagged site) TBE : Tris borate EDTA TE : Tris EDTA 65 Mục Lục Mở đầu Chơng 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Đại cơng lúa 1.1.1 Nguồn gốc phân loại lúa trồng 1.1.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam giới 1.2 Đại cơng tính chịu hạn trồng 1.2.1 Hạn tác hại hạn lên thực vật 1.2.1.1 Khái niệm phân loại hạn 1.2.1.2 Tác hại hạn lên thực vật 1.2.2 Cơ chế chống chịu hạn 1.2.2.1 Cơ chế lẩn tránh hạn 1.2.2.2 Cơ chế chịu hạn nớc mô cao 1.2.2.3 Cơ chế chịu hạn nớc mô thấp 1.2.2.4 Cơ chế phục hồi sau hạn 1.2.3 Các biện pháp khắc phục nâng cao nâng cao tính chịu hạn 1.3 Một số phơng pháp tạo dòng chịu hạn 11 11 13 1.3.1 Chọn giống chịu hạn thông qua kỹ thuật chọn dòng tế bào 13 1.3.2 Chọn giống chịu hạn kỹ thuật chuyển gen 13 1.3.3 Chọn lọc tính chịu hạn nhờ thị phân tử MAS 14 1.4 Đột biến phóng xạ tạo giống 14 1.4.1 Các thành tựu chọn tạo giống đột biến 14 1.4.2 Đột biến nhân tố gây đột biến 16 1.4.3 Bức xạ ion hóa chế gây đột biến 17 1.4.3.1 Bức xạ ion hoá 17 1.4.3.2 Cơ chế tác động 18 1.4.4 Phơng pháp đột biến nhân tạo trồng 1.5 Một số thị phân tử sử dụng chọn dòng chịu hạn lúa 1.5.1 Phản ứng PCR 19 20 20 66 1.5.2 Kỹ thuật RAPD ứng dụng 22 1.5.3 Kỹ thuật SSR ứng dụng 23 1.5.4 Kỹ thuật STS ứng dụng 24 Chơng Vật liệu phơng pháp 26 2.1 Vật liệu 26 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phơng pháp xử lý phóng xạ 26 2.2.2 Phơng pháp xử lý hạn PEG với M0 26 2.2.3 Phơng pháp tách chiết ADN hệ gen 27 2.2.4 Phơng pháp phân tích RAPD 29 2.2.4.1 Phản ứng PCR với mồi RAPD 29 2.2.4.2 Phơng pháp phân tích số liệu RAPD 31 2.2.5 Phơng pháp phân tích SSR 32 2.2.5.1 Phản ứng PCR với mồi SSR 32 2.2.5.2 Phơng pháp phân tích số liệu SSR 34 Chơng Kết thảo luận 35 3.1 ảnh hởng phóng xạ lên khả nảy mầm hạt 35 3.2 ảnh hởng phóng xạ lên sinh trởng phát triển mạ 36 3.3 Kết xử lý PEG 37 3.4 Kết phân tích RAPD 41 3.4.1 Kết tách chiết AND hệ gen 41 3.4.2 Phân tích đa dạng di truyền dòng lúa 42 3.4.3 So sánh khác dòng lúa mức độ phân tử 45 3.5 Kết phân tích SSR 49 Kết luận kiến nghị 55 Tài liệu tham khảo 56 67 68 [...]... với sự ra đời của các chỉ thị phân tử liên kết với các đặc trng chống chịu hạn, đã tạo ra bớc tiến mới trong công tác chọn giống cây trồng ở lúa những nghiên cứu về đặc điểm hình thái, chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của hai nhóm: lúa nớc, lúa cạn và lúa chịu hạn cho thấy: - Bộ rễ của nhóm lúa cạn và lúa chịu hạn ăn sâu hơn đáng kể so với nhóm lúa nớc Sự phân bố khối lợng rễ của nhóm lúa nớc tập trung chủ... nhuộm bạc ở lúa các chỉ thị SSR đợc xác định là liên kết chặt với một số tính trạng hình thái đã đợc sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn nh: RM104 liên kết với tính trạng chiều cao cây; RM250, RM270 liên kết với độ dài rễ; RM156 liên kết với tính trạng số lợng rễ; RM263 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của rễ trên thân; RM221, RM242, RM228 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của rễ sâu trên thân (Nguyễn... chọn giống Thờng thì liều chiếu xạ thấp hơn liều tới hạn 1,5-2 lần là đợc, tốt nhất là sử dụng liều chiếu xạ chỉ làm giảm tỉ lệ nảy mầm và ít kìm hãm sinh trởng Sau đây là liều lợng chiếu xạ và liều lợng tới hạn ở một số cây trồng chính (bộ phận chiếu xạ là hạt khô) Bng 2 Liều tới hạn và liều chiếu xạ ở một số cây trồng chính Cây trồng Liều tới hạn (krad) Liều chiếu xạ Lúa mỳ 10-15 (krad) 5-10 Lúa nớc... gen liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu[13] 13 1.3.3 Chọn dòng chịu hạn nhờ chỉ thị phân tử MAS MAS (Marker Assisted Selection) và bản đồ di truyền đã cho các nhà chọn giống thấy rõ mối quan hệ giữa tính trạng-gen-môi trờng Nhờ những chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen quan tâm cho phép chọn lọc các cá thể ngay ở giai đoạn sớm mà không cần đánh giá kiểu hình cũng nh không phụ thuộc vào... gen tính trạng số lợng (đặc biệt là các gen chống chịu điều kiện bất lợi) việc ứng dụng MAS còn nhiều khó khăn và đến nay mới đạt đợc những kết quả bớc đầu nh việc lập bản đồ và xây dựng QTL (Quantitative Trait Loci) cho một số tính trạng ở lúa nh tính chịu hạn, tính chịu nhôm Về tính chịu hạn thì MAS liên kết với tính trạng hình thái rễ nh: độ dài rễ, số lợng rễ, tỷ lệ khối lợng khô của rễ trên thân,... chỉ thị RAPD đã đợc xác định trên bản đồ di truyền và liên kết với một tính trạng nào đó Chỉ thị này dựa trên sự tách dòng và đọc trình tự các đoạn RAPD đợc quan tâm Từ đó thiết kế mồi dài khoảng 25 mer bổ sung với trình tự đầu và cuối của đoạn RAPD ban đầu Do đó mỗi mồi SCARP sẽ xác định đợc một locus đơn tơng ứng với đoạn ADN ban đầu STS là chỉ thị đồng trội, đợc ứng dụng trong đánh giá và chọn giống. .. giống nhờ chỉ thị phân tử MAS, ngoài ra còn đợc ứng dụng trong đánh dấu gen, nhận dạng giống Hiện nay có một số chỉ thị STS đợc sử dụng trong chọn dòng lúa chịu hạn nh: RZ19, RG690, RZ730 và RZ801 trên NST số 1; RG171, RG157, RZ318 trên NST số 2; RZ978, RZ288, RZ12 trên NST số 9 đợc xác định là liên kết chặt với các locus kiểm soát hình thái rễ dài, rễ dày (Shen & Cs, 1999) Các locus RG140 liên quan... NST số 9 có ảnh hởng lớn đến khả năng chịu hạn của các dòng lúa chọn lọc và có thể sử dụng nh một chỉ tiêu trong chọn dòng chịu hạn (Nguyễn Thị Kim Liên, 2003) [9] Các locus kiểm soát rễ dài, rễ dày nh RM29 trên NST số 1;RM234, RM248 trên NST số 7 cũng đợc xem là những chỉ thị chuẩn trong chọn lọc các cá thể chịu hạn (Shen & Cs, 1999) [37] 1.5.4 Kỹ thuật STS và ứng dụng Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site)... tia bức xạ đối với tế bào sinh vật tạo nên các hợp chất độc Thuyết Enzym: Thuyết enzym cho rằng tia bức xạ làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, làm cho các enzym trong lyzoxom bị giải phóng vào tế bào chất gây rối loạn sự trao đổi chất của tế bào Thuyết cơ chế tác dụng gián tiếp: Bức xạ ion hóa tác dụng gián tiếp lên phân tử nớc trong tế bào tạo nên các gốc tự do Các gốc tự do có thể tác động với. .. nh: Lúa, ngô, đậu, táo, cà chua, da hấu, lạc Nhiều dòng cây đột biến có giá trị cao đã đợc tạo ra và chọn lọc để sử dụng trực tiếp trong sản xuất, hoặc gián tiếp cho việc lai tạo ra giống mới Đến nay có nhiều giống đột biến đã đợc công nhận là giống quốc gia nh: Giống lúa DT10, DT11, DT13, DT33, A20, Xuân số 5, Tám thơm, CM1, CM6 ; Giống đậu phộng V70 ;Giống đậu nành DT84, DT95; Giống bắp DT6, DT8; Giống ... Thành, 2002) Với đời đồ QTL mở hớng cho chọn giống chịu hạn chọn giống nhờ thị phân tử liên kết với tính chịu hạn lúa thị SSR đợc sử dụng để chọn dòng chịu hạn Dựa vào phân tích sử dụng hai giống RDB09... nhuộm bạc lúa thị SSR đợc xác định liên kết chặt với số tính trạng hình thái đợc sử dụng để đánh giá khả chịu hạn nh: RM104 liên kết với tính trạng chiều cao cây; RM250, RM270 liên kết với độ dài... Kết phân tích SSR Để nghiên cứu tính chịu hạn, cần có cách tiếp cận phù hợp phân tích riêng biệt tính trạng tham gia vào việc làm tăng tính chịu hạn trồng với việc sử dụng mô hình locus đặc tính