Để nghiên cứu tính chịu hạn, cần có cách tiếp cận phù hợp đó là phân tích riêng biệt các tính trạng tham gia vào việc làm tăng tính chịu hạn ở cây trồng với việc sử dụng mô hình locus đặc tính số lợng ( QTL). Hớng tiếp cận này rất phù hợp với cây lúa vì hiện nay đã có một số bản đồ liên kết di truyền với nhiều loại chỉ thị ADN nh RFLP, AFLP, SSR (Causse & Cs, 1994; Harushima & Cs, 1998; McCouch & Cs, 1997).
ở lúa, các tính trạng rễ đợc xem là những tính trạng hình thái quan
trọng trong việc đánh giá khả năng chịu hạn (Nguyen & Cs, 1997). ở lúa nớc,
các tính trạng nh mật độ rễ, số lợng rễ, khả năng đâm xuyên của rễ và tỷ lệ khối lợng rễ trên thân có vai trò quan trọng. Đối với lúa cạn thì độ dài rễ, đờng kính rễ, tỷ lệ khối lợng rễ trên thân và tỷ lệ khối lợng rễ sâu trên thân lại là quan trọng, vì đối với lúa cạn cần có bộ rễ khỏe và ăn sâu để hút nớc ở tầng sâu (Yoshida, Hasegawa, 1982) [39].
ở Việt Nam đã xây dựng đợc bản đồ QTL cho một số tính trạng hình
thái rễ đóng vai trò quan trọng cho tính chịu hạn ở lúa cạn. Quần thể sử dụng để lập bản đồ là quần thể F6 tự phối phát triển từ cặp lai của hai giống lúa cạn Việt Nam là RDB09 và R2021. Đây là bản đồ QTL cho tính chịu hạn ở lúa cạn lần đầu tiên đợc xây dựng tại Việt Nam (Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Đức Thành, 2002).
Với sự ra đời của bản đồ QTL đã mở ra một hớng mới cho chọn giống chịu hạn đó là chọn giống nhờ chỉ thị phân tử liên kết với tính chịu hạn và ở lúa các chỉ thị SSR đang đợc sử dụng để chọn dòng chịu hạn.
Dựa vào những phân tích trên đây chúng tôi đã sử dụng hai giống RDB09 và R2021 để làm chỉ thị chuẩn và một số mồi SSR liên kết với tính trạng rễ lúa để đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng nghiên cứu.
Chúng tôi sử dụng 3 cặp mồi SSR là RM250, RM263 và RM221. Trong đó mồi RM250 liên kết với tính trạng độ dài rễ, là chỉ thị của RDB09. Mồi RM263 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của rễ trên thân, là chỉ thị của RDB09. Mồi RM221 liên kết với tỷ lệ khối lợng khô của rễ sâu trên thân và là chỉ thị của R2021. Kết quả phân tích SSR đợc thể hiện trong bảng 3.6 và các hình 3.10, 3.11 và 3.12.
Bảng 3.6. Kết quả SSR của các dòng lúa nghiên cứu
Giống Mồi SSR chịu hạn SSR đa hình
CC1 RM250 1 1 RM250 1 1 RM263 1 0 RM221 0 0 Tổng 2 1 CC2 RM250 5 36 RM263 3 2 RM221 0 0 Tổng 8 38
Qua kết quả bảng 3.6 nhận thấy mồi RM221 không cho băng SSR chịu hạn cũng không cho băng SSR đa hình vì vậy không thể sử dụng mồi này để chọn lọc ra những dòng chịu hạn từ những dòng nghiên cứu. Kết quả 8 dòng CC1 chiếu xạ chạy với 3 mồi SSR cho tổng cộng 2 dòng mang băng SSR chịu hạn (dòng 2, 8) và 1 dòng mang băng SSR đa hình, 42 dòng CC2 chiếu xạ chạy với 3 mồi SSR cho tổng cộng 8 dòng mang băng SSR chịu hạn (là các dòng số 15,18,19,20,21,31,36,38) và 38 dòng mang băng SSR đa hình.
Chỉ thị phân tử liên kết với các gen cần quan tâm cho phép ta chọn lọc các cá thể ngay từ giai đoạn sớm và không cần đánh giá đến kiểu hình cũng nh tác động của điều kiện môi trờng. Hơn nữa chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội nên có thể phát hiện đợc cả những đột biến lặn ngay trong thế hệ đầu tiên. Vì vậy các dòng SSR chịu hạn chọn lọc đợc có thể mang tính chịu hạn. Còn các dòng SSR đa hình có thể là những locus SSR chịu hạn khác.
Vì vậy, để đánh giá một cách toàn diện khả năng chịu hạn của các dòng nghiên cứu, cần phải sử dụng thêm nhiều mồi SSR liên kết với các tính trạng
MP2P2 P1P1 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hình 3.10. Sản phẩm điện di mồi RM263 của các dòng CC1
(P1: RBD09, P2: R2021, 1: CC1 không chiếu xạ, 2-9: các dòng CC1 chiếu xạ)
Trong các tính trạng hình thái rễ, giữa độ dày rễ và các tính trạng hình thái rễ khác không có mối tơng quan di truyền chặt (Champoux & Cs, 1995; Nguyễn Thị Kim Liên, 2002) kết quả cho thấy sự di truyền độc lập cao của tính trạng độ dày rễ. Nhng giữa độ dài rễ, độ sâu rễ và số lợng rễ có một mối tơng quan thuận hết sức chặt chẽ, giữa tỷ lệ rễ trên thân với các tính trạng hình thái rễ khác (độ dài, độ sâu, số lợng) cũng có môi tơng quan chặt [24] [8].
Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong chọn dòng có khả năng chịu hạn. Vì khi các tính trạng hình thái rễ có liên quan đến tính chịu hạn có mối quan hệ chặt chẽ với nhau thì có thể hy vọng thu đợc các dòng mang các tính trạng có lợi luôn đi cùng nhau trong quá trình chọn lọc.
Ngoài các đặc điểm về hình thái rễ ta có thể sử dụng các đặc điểm hình thái khác dễ quan sát và theo dõi hơn để chọn lọc dòng có khả năng chịu hạn nh chiều cao cây, số nhánh. Theo Yoshida (1982) hệ thống rễ sâu có tơng quan với chiều cao cây lớn và số nhánh thấp. Những giống đẻ nhánh ít và sớm thờng có hệ thống rễ sâu hơn những giống khác. Những giống có tỷ lệ rễ trên thân lớn có xu hớng cao hơn và đẻ nhánh ít hơn. Điều này cho thấy các đặc điểm về thân lá có quan hệ mật thiết với các đặc điểm về hình thái rễ. Vì vậy trong quá trình chọn lọc có thể rút ngắn đợc thời gian và công sức.
M P2P2 P1P1 10 1011 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Hình 3.11. Sản phẩm điện di mồi RM250 của các dòng CC2
(10: CC2 không chiếu xạ, 11-31: các dòng CC2 chiếu xạ)
Vậy qua kết quả phân tích SSR cho thấy đã chọn lọc đợc 10 dòng lúa chiếu xạ mang chỉ thị chịu hạn của RDB09, và các dòng này có thể có khả năng chịu hạn. Để khảng định điều này cần đánh giá tính chịu hạn trong điều kiện nhân tạo và trên đồng ruộng.
Kết quả phân tích SSR đợc thể hiện chi tiết trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Tên các dòng lúa phân tích RAPD, SSR và kết quả phân tích SSR STT Tên dòng RM250 RM263 1 CC1 2 CC1.ĐC.1 P1 3 CC1.10.1 P2 4 CC1.10.4 5 CC1.15.2 6 CC1.20.6 7 CC1.20.3 8 CC1.25.1 ĐH P1 9 CC1.30.4 10 CC2 11* CC2.10.3 ĐH 12 CC2.10.2 ĐH 13 CC2.10.12 ĐH 14 CC2.10.13 ĐH 15 CC2.10.6 P1 16 CC2.10.5 ĐH 17 CC2.10.8 ĐH 18 CC2.10.9 P1 ĐH 19 CC2.10.15 P1 20 CC2.10.10 ĐH P1 21 CC2.10.11 P1 ĐH 22 CC2.15.9 ĐH 23 CC2.15.20 ĐH 24 CC2.15.19 ĐH 25 CC2.15.13 ĐH 26 CC2.15.16 ĐH 27 CC2.15.18 ĐH 28 CC2.15.6 ĐH
29 CC2.15.3 ĐH30 CC2.15.10 30 CC2.15.10 31 CC2.15.11 ĐH P1 32 CC2.15.5 ĐH 33 CC2.15.15 ĐH 34 CC2.15.4 ĐH 35* CC2.20.7 ĐH 36 CC2.20.16 ĐH P1 37 CC2.20.3 ĐH 38 CC2.20.15 P1 39 CC2.20.12 ĐH 40 CC2.20.2 ĐH 41* CC2.20.23 ĐH 42 CC2.20.11 ĐH 43 CC2.20.6 ĐH 44 CC2.20.18 ĐH 45 CC2.20.13 ĐH 46 CC2.20.5 ĐH 47 CC2.20.20 ĐH 48 CC2.20.4 ĐH 49 CC2.25.7 ĐH 50 CC2.25.5 ĐH 51 CC2.25.8 ĐH 52 CC2.25.1 ĐH
* : Các dòng bổ sung khi chạy SSR P1: SSR RDP09
P2: SSR R2021 ĐH: SSR đa hình
Kết luận và kiến nghị
Kết luận
Từ các kết quả phân tích trên đây, chúng tôi rút ra các kết luận sau
1. Phóng xạ ảnh hởng đến khả năng nảy mầm thành cây của hạt, ảnh hởng lên sự sinh trởng và phát triển của cây mạ cụ thể là khi liều chiếu xạ tăng dần thì tỉ lệ nảy mần thành cây giảm, chiều cao cây cũng giảm nh- ng không rõ rệt. Từ đó rút ra liều chiếu xạ thích hợp cho việc tạo vật liệu khởi đầu cho công tác chọn giống là từ 10 đến 25 krad.
2. Khả năng phục hồi sau hạn ở một số dòng chiếu xạ cao hơn so với dòng đối chứng, các dòng CC2 chiếu xạ có khả năng phục hồi cao hơn các dòng CC1 chiếu xạ. Điều này cho thấy phóng xạ đã tạo ra các đột biến chịu hạn và có thể làm tăng khả năng chống chịu hạn của các dòng lúa thí nghiệm.
3. Kết quả phân tích RAPD cho thấy đã có một số thay đổi trong hệ gen nhân của các dòng lúa dới tác dụng của chiếu xạ.
4. Kết quả phân tích SSR cho thấy đã chọn lọc đợc 10 dòng lúa chiếu xạ (2 dòng CC1 và 8 dòng CC2) có khả năng mang tính chịu hạn.
Kiến Nghị
• Sử dụng thêm các mồi SSR liên kết với các tính trạng hình thái rễ
khác, để đánh giá một cách toàn diện về khả năng chịu hạn của các dòng chiếu xạ.
• Có thể sử dụng thêm các hình thức chọn lọc qua các tính trạng
hình thái thân lá nh chiều cao cây, số nhánh, tỷ lệ hạt chắc lép trên bông...
• Tiếp tục nghiên cứu khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc ở
các thế hệ tiếp theo để chọn ra những dòng chịu hạn cao, cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn.
Tài liệu tham khảo
Tiếng việt
1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1995); ứng dụng công nghệ sinh học
trong cải tiến giống lúa; Nxb Nông Nghiệp TPHCM.
2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003); Cơ sở di truyền tính chống chịu với thiệt hại do môi trờng của cây lúa; Nxb Nông nghiệp TPHCM.
3. Bùi Chí Bửu (2004); Hội nghị quốc gia về chọn tạo giống lúa; Nxb Nông nghiệp, TPHCM; 12-18.
4. Lê Tiến Dũng (2002); ứng dụng đột biến thực nghiệm tia gamma tạo
nguồn vật liệu khởi đầu, phục vụ công tác chọn giống lạc mới, phù hợp với điều kiện sinh thái ở Thừa Thiên Huế; Luận án TS Nông nghiệp; Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.
5. Bùi Huy Đáp (2000); Nguồn gốc cây lúa, lúa gạo Việt Nam thế kỷ 21 hớng xuất khẩu; Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Nguyễn Hữu Đống, Đào Thanh Bằng, Lâm Quang Dụ, Phan Đức Trực (1997); Đột biến: Cơ sở lý luận và ứng dụng; Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
7. Hồ Huỳnh Thùy Dơng (1998); Sinh học phân tử; Nxb Giáo Dục, Hà Nội.
8. Nguyễn Thị Kim Liên (2002); Chọn dòng chịu hạn và định vị locut của một số tính trạng hình thái rễ liên quan đến tính chịu hạn ở lúa cạn; Luận án TS sinh học, Viện Công nghệ Sinh học.
9. Nguyễn Thị Kim Liên, Nông Văn Hải, Nguyễn Đức Thành (2003); Kết quả bớc đầu của việc ứng dụng chỉ thị SSR trong chọn dòng chịu hạn ở lúa cạn; Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội; 898-901.
10.Nguyễn Thị Lẫm, Hoàng Văn Phụ, Dơng Văn Sơn, Nguyễn Đức Thạnh (2003); Giáo trình cây lơng thực; Nxb Nông nghiệp.
11.Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004); Cơ sở lý thuyết và ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng; Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
12.Lê Thị Nguyên (2002); Giáo trình kỹ thuật nông nghiệp; Nxb Nông nghiệp, TPHCM.
13.Đinh Thị Phòng (2002); Nghiên cứu chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật; Luận án TS Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học.
14.Trơng Thị Bích Phợng, Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Hữu Đống (2003);
Sự thay đổi cấu trúc của các tế bào lúa (Oryza Sativa L.) chịu hạn chọn
lọc nuôi cấy từ callus đợc chiếu xạ bằng tia gamma Co60; Hội nghị
Công nghệ Sinh học toàn quốc; Hà Nội 2003.
15.Trần Duy Quý (1997); Các phơng pháp mới trong chọn tạo giống cây trồng; Nxb Nông nghiệp Hà Nội; 237-255.
16.Khuất Hữu Thanh (2004); Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen; Nxb Khoa học Kỹ thuật; 151-200.
17.Nguyễn Đức Thành, Phan Thị Bảy, Lê Hồng Điệp (1999); Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa; Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học; 1205-1215.
18.Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Thúy Hạnh (2003); Định vị một số locus kiểm soát tính chịu hạn ở lúa; Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội 2003; 810- 814.
19.Trần Nguyên Tháp (2001); Nghiên cứu xác định một số đặc trng của
các giống lúa chịu hạn và chọn dòng lúa chịu hạn CH5; Luận án TS
20.Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1997); Sinh lý học thực vật; Nxb Giáo Dục.
Tiếng Anh
21.Adkin S.W, Kunanuvatchaidach R, Godwin I. D (1995); Somaclonal variation in rice drought tolerace and other argronomic character; Australia jounal of Botany V4 N2; 201-209.
22.Bohert H J, Jensen R G (1996); Strategies for engineering water-stress tolerance in plants; TIBTECH 14; 89-97.
23.Brown SM, Kresovich S (1996); Molecular characterization for plant gentic resources conservation; In: Genom mapping in plant; 85-93. 24.Champoux MC, Wang G, Sarkarung S, Mackill DT, O'Toole JC, Huang
N, McCouch SR (1995); Locating genes associated with root morphology and drought avoidance in rice via linkage to molecular markers theor App Genet 90; 969-981.
25.Guerrero F D, Jones T T, Mullet J E (1990); Turgor-reponsive gene trancription and RNA levels increase rapidly when pea shoots are wilted: Sequence and expression of three inducible genes, plant Mol Biol 15; 11-26.
26.Gupta P.K, Balyan H.S, Sharama P.C and Ramesh B (1996); Microsettlites in plants: A new class of molecular markers; Current science. Vol.70. No.1; 46-53.
27.Jones M M, Turner N C, Osmond C B (1981); Mechanisms of drought resistance, physiology and biochemistry of drought resistance in plants; 15-37.
28.Jordan W R, Monk R L, Miller F R, Rosenow D T, Clark R E, Shouse P J (1983); Environmental physiology of sorghum. I. Environmental genetic control of epicular wax load. Crop Sci. 23; 552-555.
29.Kiramat Khan, Muhammad, Abdul, Bashir, Fazli, Hanssan (2003); "Effect of gamma irradiation on yield and yield components of Barley", Pakistan Journal of Biological Sciences 6 (19); 1695-1697.
30.Kiyosue T, Yamaguchi, Shinozaki K (1994); Cloning of cDNAs for genes that are early-reponsive to dehydration stress (ERDs) in
Arabidopsis thaliana L. indentification of three ERDs as HSP cognate genes; Plant Mol Biol 25; 791-798.
31.Manbani B, Lal R (1983); Reponse of upland rice varieties to drought stress. I. Relation between root system development and leaf water potential. Plant soil 73; 59-72.
32.Mckersie B D, Lesham Y Y (1994); Stress and stress croping in cultivated plants. Academic Publishers.
33.Nguyen H T, Babu C R, Blum A (1997); Breeding for drought in rice: Physiology and molecular genetic considerations. Crop Sci 37: 1420- 1434.
34.O'Toole J C (1982); Adaptation of rice to drought prone environments, In: Drought resistance in crops with emphasis on rice. IRRI. Los Banos. Philipines; 195-213.
35.Saghai Maroof M. A, Biyashev R. M, Yang G. P, Zhang Q, Allard R. W (1994); Extraodirarily polymorphic microsetellite DNA in barley: Species diversity, chromosome location, and population dynamics; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91; 5466-5470.
36.Saradhi A, Saradhi P P (1991); Proline accumulation under heavy metal stress; J plants physiol 138; 554-558.
37.Shen L, Courtois B, McNally K, McCouch S R, Li Z (1999); Developing near- isogenic lines of IR64 introgressed with QTLs for deeper and thicker roots through marker-aided selection. In: Genertic improvement of rice for water limited environments; IRRI; 275-289. 38.Winter P, Kahl G (1995); Molecular marker technologies for plant
improvement; World journal of microbiology and biotechnology 11; 438-448.
39.Yoshida S, Hasegawa S (1982); The rice root system: Its development and function; In: Drought resistance in crops with emphasis on rice IRRI; 87-114.
40.Zhang J, Chandra Babu R, Pantuwan G, Kamoshita A, Blum A, Wade L, Sarkarung S, O'Toole J C, Nguyen H T (1999); Molecular dissection for drought tolerance in rice from physio-morphological traits to field performance; In genetic improvements of rice for water limited environments; IRRI; 331-343.
Những từ viết tắt
ADN : Acid deoxyribonucleic
AFLP : Đa hình độ dài các đoạn đợc nhân bản chọn loc (Amplified
Fragment Length Polymorphism)
bp : Cặp bazơ (base pair)
CTAB : Cetyltrimethyl- amoniumbromide
Cs : Cộng sự
dNTP : Deoxyribonucleic triphosphate
EDTA : Ethylenediamin tetraacetate
EtBr : Ethidium bromide
Kb : Kilo bazơ
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction)
RAPD : Đa hình ADN nhân bản ngẫu nhiên (Random amplified
polymorphic DNA)
RFLP : Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment length
polymorphism)
Rnase : Ribonuclease
SSR : Các đoạn lặp lại có trình tự đơn giản ( Simple sequence repeats)
STS : Trình tự vị trí đợc đánh dấu (Sequence tagged site)
TBE : Tris borate EDTA
Mục Lục
Mở đầu 1