Các cây phục hồi đợc trồng ở nhà lới, sau 3-4 tuần có thể thu lá để tách chiết ADN. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phơng pháp tách chiết ADN hệ gen của Saghai Maroof (1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Các hoá chất để tách chiết ADN hệ gen nh sau:
- Đệm CTAB 100 ml gồm: 55 ml H20; 15 ml Tris HCl 8,0; 30 ml NaCl
- Đệm TE pH 8,0 gồm: 10 mM Tris HCl 8,0; 1 mM EDTA 8,0. - RNase 10 μg/ml - Cồn tuyệt đối, lạnh - Hỗn hợp: Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1) - Hỗn hợp: Chloroform/Isoamylalcohol (24:1) - Dung dịch rửa: Cồn 70%
Sau đây là các bớc tách chiết ADN từ lá lúa bằng phơng pháp CTAB
B
ớc 1: Nghiền 1 gam lá lúa trong nitơ lỏng bằng chày cố sứ. Bột đã nghiền
cho vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650C
trong 10 phút.
B
ớc 2: ủ các ống ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhng dứt khoát 20
phút một lần để việc tách có hiệu quả.
B
ớc 3: Chuyển các ống từ tủ ấm ra, để nguội ở nhiệt độ phòng 5 phút, thêm 0,7 ml dung dịch Chloroform/Isoamylacohol (24:1), lắc nhẹ nhàng
15-20 phút.
B
ớc 4: Ly tâm 15 phút tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
B
ớc 5: Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống mới, thêm 0,75 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1), xoay ống nhẹ nhàng trong 10 phút.
B
ớc 6: Ly tâm 12 phút tốc độ 10.000 vòng/phút.
B
ớc 7: Hút lớp trên sang ống mới thêm 0.75 ml dung dich Chloroform / Isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ nhàng 10 phút.
B
ớc 8: Ly tâm 12 phút tốc độ 10.000 vòng/phút.
B
ớc 9: Hút lớp trên sang ống mới, tủa bằng cồn tuyệt đối lạnh (1-1,2 ml)
ADN tủa nhiều thì có thể câu ra ống mới. Nếu tủa ít thì để tủ -200C trong 30 phút.
B
ớc 10: Ly tâm 7 phút tốc độ 10.000 vòng/phút để thu tủa.
B (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ớc 11: Rửa tủa (2 lần) bằng cồn 70%, ly tâm, thu tủa.
B
ớc 12: Hoà tan ADN bằng TE 8,0 lợng TE tuỳ vào lợng tủa. Sau đó thêm
10 μl Rnase đã đun sôi 15 phút rồi ủ ở 370C qua đêm.
ADN sau khi tinh sạch theo phơng pháp trên đợc đo nồng độ trên máy
quang phổ 8452 Hewllet và dựa vào đó để pha loãng ra nồng độ 25 ng/μl bằng
nớc cất 3 lần để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo.