chuẩn đoán dịch tả heo bằng nuôi cấy tế bào

Những kỹ thuật được áp dụng để phát hiện virus DTH trong các mẫu nghingờ DTH là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật ELISA, kỹ thuật PCR vàphân lập virus trên tế bào nuôi cấy.. Sự nh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

a Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào

i Dòng tế bào thận heo PK15

ii Môi trường nuôi cấy tế bào

iii.Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15

iv.Nuôi cấy không cần ly tâm

v Thuốc thử

b Phân lập virus dịch tả heo

i Nguyên tắc kiểm tra

ii Phương pháp nuôi cấy đế phân lập virus

iii.Sự chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị cơ quanChuẩn bị bạch cầu

c Phương thức kiểm tra

ii Đánh dấu với thuốc nhuộm peroxidase

iii.Đánh dấu với thuốc nhuộm FITC

iv.Phương thức kiểm tra trực tiếp FAT

tả heo ( DTH) là virus RNA chuỗi đơn, mạch dương, có vỏ bọc bên ngoài, và được

xếp vào giống Pestivirus, trong họ Flaviviridae (Wengler, 1995).

Cho đến nay, DTH vẫn là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tếnghiêm trọng nhất cho ngành chăn nuôi heo ở các quốc gia trên khắp thế giới cũngnhư ở Việt Nam Xét về mặt kinh tế, bệnh DTH gây thiệt hại lớn là do: (1) tỷ lệbệnh và tỷ lệ chết cao trong những đàn nhạy cảm và virus có độc lực cao, (2) heomắc bệnh không chết thì còi cọc chậm lớn, (3) tổn phí do tiêm phòng cao (nếu heokhông được tiêm phòng thì khả năng heo mắc bệnh rất cao), (4) quan trọng hơn cả

là sẽ không xuất khẩu được thịt heo nếu đàn heo trong nước có bệnh DTH

Xét về mặt lâm sàng, hiện nay bệnh DTH biểu hiện dưới nhiều thể khácnhau như cấp tính, bán cấp tính, mãn tính và không điển hình (atypical) hay khôngbiểu hiện rõ (inapparent), trong đó thể mãn tính lại là thể phổ biến ở Việt Namhiện nay (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) Do đó, việc chẩn đoán bệnh DTH là cần thiết

để kịp thời điều trị

Những kỹ thuật được áp dụng để phát hiện virus DTH trong các mẫu nghingờ DTH là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật ELISA, kỹ thuật PCR vàphân lập virus trên tế bào nuôi cấy Trong đó, phân lập virus trên tế bào nuôicấyđược xem là phương pháp vàng trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm Phânlập virus thường có độ nhạy cao hơn các phương pháp xét nghiệm kháng nguyênvirus

II Tổng quan

1 Virus dịch tả heo

Virus DTH là virus RNA chuỗi đơn, mạch dương, có vỏ bọc bênngoài, kích thước tương đối nhỏ với đường kính khoảng 40 – 50 nm Virus DTH

được xếp vào giống Pestivirus, họ Flaviviridae (Wengler và ctv, 1995).

Virus DTH được chia thành các nhóm kháng nguyên sau:

Nhóm 1.1: gồm các chủng virus vaccine, phân lập virus ởAnh, Mỹ năm 1940 – 1950; Nhật năm 1960; Tây Âu ở giữa năm 1920 và ở năm1970; Brazil và Nam Triều Tiên năm 1980; Ukraine, Croatia, Mexico và Thái lannăm 1990; Trung Quốc.

Nhóm 1.2: gồm các chủng virus vaccine, phân lập virus ởTây Âu năm 1940, Malaysia và Mỹ năm 1960; Cuba và ukraine năm 1990; Úc.Nhóm1.3: gồm các virus phân lập ở malaysia năm 1980; Thái Lan năm 1980 và1990; Honduras năm 1990

Nhóm 2.1: các virus phân lập ở malaysia năm 1980; Tây

Âu năm 1980 và 1990; Đông Âu năm 1990

Nhóm 2.2: gồm các virus phân lập ở Singapore năm 1980;Tây Âu năm 1980 và 1990; Thái Lan năm 1990

Nhóm 2.3: các virus phân lập ở Nhật năm 1970; Tây Âunăm 1980 và 1990; Đông Âu năm 1990; Nga

Nhóm 3.1: chỉ có dòng Congenital Tremor phân lập ở Anhnăm 1960

Nhóm 3.2: gồm các virus phân lập ở Nam Triều Tiên năm

1980 và 1990

Nhóm 3.3: gồm các virus phân lập ở Thái Lan năm 1990 Nhóm 3.4: các virus phân lập ở Nhật năm 1970; Đài Loannăm 1990

2 Cơ chế gây bệnh của virus DTH

Trong điều kiện tự nhiên, virus xâm nhập vào vật chủ chủ yếuthông qua con đường miệng mũi, đôi khi qua kết mạc, niêm mạc đường sinh dụchoặc vùng da bị trầy xước Bảy giờ sau khi xâm nhập, vị trí đầu tiên virus tái sản

là tế bào thượng bì trong hạch hạnh nhân Sau sự tái sản ban đầu, mười sáu giờ sauvirus theo hệ thống mạch bạch huyết xâm nhập vào các hạch bạch huyết, ở đây nótiếp tục tái sản và đi vào hệ thống mạch máu ngoại vi gây nhiễm virus huyết lầnthứ nhất Theo hệ thống tuần hoàn, một lượng lớn virus được nhân lên ở mô bàođích thứ hai là lách, tuỷ xương, hạch bạch huyết nội tạng và đường tiêu hoá, cácbạch cầu lưu hành và các tế bào đơn nhân Đồng thời với sự sinh sản, virus pháhuỷ những tế bào nội mạc mao mạch (máu, bạch huyết), những mảnh vỡ sẽ tụ lạithành vật gây tắc mạch, dẫn đến nhồi huyết ở lách, xuất huyết và hoại tử ở ruột…nhiễm virus huyết lần hai xảy ra vào ngày thứ 5 – 6 và đạt tối đa vào ngày thứ bảysau khi cảm nhiễm (Trần Thanh Phong, 1996) Như vậy, virus DTH có độc lực ởkhắp các tổ chức, biểu mô sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ 5 – 6 ngày

3 Bệnh dịch tả heo

a Dấu hiệu lâm sàng bệnh dịch tả heo

Tuỳ thuộc vào tuổi gia súc và độc lực của virus mà có nhiều thểlâm sàng khác nhau:

- Thể bệnh DTH điển hình gồm có quá cấp tính, cấp tính, mãn tính (thể mãntính là thế có thời gian biểu hiện triệu chứng lâm sàng kéo dài trên một tháng) vànhững triệu chứng thông thường hay gặp:

+ Heo bồn chồn, thường nằm một góc chuồng, khi nằm rên nhẹ hoặcnghiến răng.

+ Sốt cao (41- 42oC), chán ăn, lông xù, run rẩy

+ Thấy xuất huyết từng đám ở da, lấm chấm ở bụng

+ Lúc đầu heo bị bón, sau chuyển sang tiêu chảy

+ Viêm kết mạc mắt, mắt đỏ, có ghèn

+ Giảm bạch cầu huyết

- Thể bệnh không điển hình có hai dạng:

+ Thứ nhất: sẩy thai, thai chết, thai dị dạng, heo con sinh ra chết sớm… + Thứ hai: heo con mang trùng và phát bệnh vào khoảng 1 – 2 tháng tuổi

b Một số bệnh tích đặc trưng của bệnh dịch tả heo

- Xuất huyết ở hạch hạnh nhân, loét cuống lưỡi hay hạch hạnh nhân

- Nhồi huyết ở rìa lách

- Xuất huyết ngoài da, ở phủ tạng, thận, bàng quang

- Các hạch ruột bị xuất huyết

- Loét hình cúc áo ở van hồi manh tràng.

4 Chẩn đoán dịch tả heo bằng nuôi cấy tế bào

a Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào

ii Môi trường nuôi cấy tế bào

• EMEM với FCS 5%

• EMEM với FCS 10%

• Môi trường EDulb với FCS 5%

• Kháng sinh vi khuẩn và kháng nấm(Penicillin/Streptomycin, Fungizone,…)

• Huyết thanh thai bê

iii Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15

Sự nhân của các tế bào PK15 được giữ trong những bìnhnuôi cấy 75cm2 (250 ml) với 20ml môi trường nuôi cấy tế bào Hai tuần là lýtưởng, nhưng một tuần là đủ

 Lấy đi môi trường và rửa với PBS/Versene

 Ủ 10phút ở 37oC với PBS/V

 Thêm 0.1ml Trypsin hoà tan 1%

 Ủ 10 – 20phút ở 37oC cho đến khi các tế bào được lấy đi từ đĩa

 Thêm môi trường với FCS để ngăn chặn phản ứng trypsin

 Ly tâm dịch huyền phù tế bào và loại bỏ nổi trên mặt

 Tái lơ lửng viên kết trong 10ml môi trường hoặc thể tích thích hợp khác

iv Nuôi cấy không cần ly tâm

Để tránh tế bào bị tổn hại do ly tâm và bỏ qua nhữngbước tiêu tốn thời gian, phương pháp này thì cũng hữu dụng

 Lấy đi môi trường từ một bình nuôi cấy 250ml

 Rửa đơn lớp với 5ml ATV hoà tan khoảng 30giây

 Lấy đi ATV và thay thế với 2ml ATV mới

 Ủ ở 37oC trong 15phút cho đến khi các tế bào được tách ra

 Thêm 8ml môi trường nuôi cấy chứa 5% FCS để có được một thể tích tổngcộng là 10ml

b Phân lập virus dịch tả heo

i Nguyên tắc kiểm tra

Mẫu cơ quan hoặc bạch cầu được nuôi trên những tếbào virus CFS nhạy cảm để cho phép gắn và nhân lên của virus Từ sự tăng trưởngcủa virus không gây ra một cytopathic có hiệu lực, sự hiện diện của nó phải đượcchứng minh bằng một phương pháp immunostaining Các tế bào thì được cố định

và kháng nguyên virus thì được phát hiện với peroxidase hoặc fluorecein

ii Phương pháp nuôi cấy tế bào để phân lập virus

Nuôi cấy tế bào của những tế bào PK15 thì sau 24giờ

và nên tiêm confluent 50 – 80% vào các mẫu xét nghiệm

iii Sự chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị cơ quan Thích hợp cho các mẫu cơ quan như lách, thận, mô bạchhuyết hoặc hồi tràng Mẫu nên được giữ lạnh và xử lý càng sớm càng tốt

 Mẫu cơ quan 1cm3 được nghiền trong một cối xay với 9ml môi trườngnuôi cấy tế bào có chứa kháng sinh hoà Những mẫu có kích thước nhỏ

hơn có thể được nghiền với môi trường ít hơn để không loãng virus Cátkhử trùng có thể được thêm vào để tạo điều kiện cho sự đồng nhất.Ngoài ra, máy đồng nhất có thể được sử dụng

Ưu điểm là mô được đồng nhất trong một hệ thống kín, nhưng nhiệt độ cao sẽđốt nóng mẫu có thể ảnh hưởng đến virus

 Sự chuẩn bị ở nhiệt độ phòng trong 1giờ

 Ly tâm 15phút, 2500vòng

 Nổi tầng mặt thì được sử dụng để tiêm trong nuôi cấy tế bào Sự phaloãng 1 : 10 và 1 : 100 có thể được xử lý song song, trong trường hợphiệu ứng độc tế bào Sự khử trùng có thể được thực hiện nếu được coicần thiết

Chuẩn bị bạch cầu ( leukocyte)

 Mẫu máu được kháng đông bởi EDTA

 Hoà tan 0.5ml Dextran vào 10ml máu có EDTA và để

ở nhiệt độ phòng 1giờ

 Nổi tầng mặt có chứa bạch cầu thì được thu thập và lytâm tại 500vòng

 Viên kết được tái lơ lửng trong 5ml PBSM, ly tâm

 Viên kết được tái lơ lửng trong 2ml PBSM để tiếp tục

sử dụng hoặc lưu trữ

 Trong trường hợp dịch huyền phù bạch cầu được tiêmđồng thời với những tế bào nhạy cảm nên được đônglạnh trong thời gian ngắn để tan bạch cầu và tránh hiệulực độc tế bào

 Mẫu máu được kháng đông bởi Heparin

 Hoà tan 20ml NH4Cl (0.84%) với 10ml mẫu máu cóHeparin ( 2 : 1) và để ở nhiệt độ phòng khoảng 15 –30phút Kích thước mẫu nhỏ thì thể tích NH4Cl đượcđiều chỉnh cho phù hợp ( 2 : 1)

 Dịch hoà tan được ly tâm ở 1000vòng

 Viên kết được tái lơ lửng trong 5ml PBSM, ly tâm

 Viên kết được tái lơ lửng trong 2ml PBSM để tiếp tục

sử dụng hoặc lưu trữ

 Trong trường hợp dịch huyền phù bạch cầu được tiêmđồng thời với những tế bào nhạy cảm nên được đônglạnh trong thời gian ngắn để tan bạch cầu và tránh hiệulực độc tế bào

 Mẫu huyết tương

 10ml máu đã được kháng đông bởi EDTA hoặcHeparin phải được đóng băng và làm tan để tiêu diệtcác bạch cầu Sau khi làm tan huyết tương được tiêmtrực tiếp vào nuôi cấy tế bào

c Phương thức kiểm tra

i Sự sàn lọc (Screening)

 Tiêm 200 – 300ul mẫu (cơ quan hoặc bạch cầu) trênmôi trường nuôi cấy tế bào có chứa confluent 50 –80% trong đĩa hoặc ống Leighton, đủ để trải lớp đơn.Nên nuôi cấy hai bản của mỗi mẫu

 Ủ ở 37oC trong 1 – 2h

 Rửa một lần với PBSM và trải với môi trường mới

 Ủ lên đến 72h ở 37oC trong tủ CO2

 Có thể tiêm tế bào và mẫu đồng thời, nếu mẫu mới vàhiệu lực độc tế bào không xảy ra

 Đối chứng dương và âm phải được xử lý theo cùngmột cách

 Tế bào được cố định và được nhuộm màu

ii Phân lập virus qua hai lần

 Tiêm 200 – 300ul mẫu (cơ quan hoặc bạch cầu) trênống môi trường nuôi cấy tế bào Luôn luôn nuôi cấyhai bản của mỗi mẫu

 Ủ ở 37oC trong 1 – 2h

 Tế bào được rửa hai lần với PBSM và tiếp tục nuôi ítnhất 72h ở 37oC EMEM với FCS 10% là môi trường

lý tưởng cho phát triển virus

 Có thể tiêm tế bào và mẫu đồng thời, nếu mẫu mới vàhiệu lực độc tế bào không xảy ra

 Ống nuôi cấy tế bào được đông lạnh ở -80oC ít nhất 1h

 Ống nuôi cấy được rả đông và được ly tâm 2500vòng

 Lấy 200 – 300ul dịch nổi và ủ khoảng 1 – 2h

 Thêm môi trường nuôi cấy vào giếng cho đầy và ủ 72h

 Đối chứng dương và âm phải được xử lý theo cùng

 Tế bào được cố định và được nhuộm màu

iii Nguyên liệu

 Mix and filter the three solutions.

 Fungizone 9 x 105 I.U dissolved in 100 mlAqua dest

 Add to the above filtrate and store at –20°C in

10 ml aliquotes until use

 Application: 10 ml in 1 liter medium

d Miễn dịch đánh dấu đế phát hiện virus CFS trong nuôi cấy

tế bào

Nói chung CSF không gây ra hiệu ứng cytopathic Do đó,những tế bào gây đôc CSF phải được ghi dấu miễn dịch để phát hiện các khángnguyên virus trong tế bào chất của tế bào

i Cố định tế bào

Việc cố định sẽ phụ thuộc vào việc môi trường nuôicấy phát triển trên bề mặt thuỷ tinh hay nhựa

Đối với môi trường phát triển trên bề mặt thuỷ tinh,

cố định trong aceton 100% khoảng 5phút

Trong trường hợp bề mặt nhựa thì sử dụngnhững phương pháp định hình khác nhau:

 Chuyển môi trường nuôi cấy hoàn toàn và ủ ở

70 – 80oC khoảng 2 – 3h hoặc

 Thêm vào mỗi giếng 100ul dung dịchaceton/methanol ( 1:1) và để 10phút ở nhiệt độphòng hoặc

 Ổn định trong aceton 20% khoảng 10phút Sấykhô dưới một đèn bàn ở 25 – 30oC khoảng 4h

ii Đánh dấu với thuốc nhuộm peroxidase

Đánh dấu trực tiếp

 Rửa đĩa một lần trong PBS – Tween

 Thêm vào mỗi giếng dung dịch pha loãng PBS –Tween Đĩa 24 giếng thì thêm 200ul/giếng, đĩa 96giếng thì thêm 50ul/ giếng

 Loại bỏ dung dịch chromogen-substrate và rửa với 1/3PBS/H2O

 Làm đầy giếng với Aqua dest, và đọc kết quả bằnglow-power microscopy.Tế bào chất của các tế bàonhiễm bệnh có màu đỏ sẫm.

Đánh dấu gián tiếp

 Thêm vào mỗi giếng dung dịch pha loãng huyết thanhđặc hiệu hoặc dịch nổi tế bào lai đơn dòng thích hợp

có chứa pestivirus và ủ khoảng 1h ở 37oC Đĩa 24giếng thì thêm 200ul/ giếng, đĩa 96 giếng thì thêm50ul/ giếng

 Rửa 3 lần với PBS – Tween và 1 lần với Aqua dest

 Thêm vào mỗi giếng dung dịch pha loãng PBS –Tween có chứa peroxidase công nghiệp và ủ khoảng1h ở 37oC

 Rửa 3 lần với PBS – Tween và 1 lần với Aqua dest

 Ủ với kháng thể thứ hai, nếu yêu cầu bởi nhà sản xuất

 Thêm vào mỗi giếng 200 hay 50ul dung dịchchromogen-substrate và nhuộm khoảng 15 – 30phút ởnhiệt độ phòng

 Loại bỏ dung dịch chromogen-substrate và rửa với 1/3PBS/H2O

 Làm đầy giếng với Aqua dest và đọc kết quả bằnglow-power microscopy.Tế bào chất của các tế bàonhiễm bệnh có màu đỏ sẫm

Immune labelling using peroxidase

 Rửa lamme, đĩa hoặc lame một lần với washingbuffer.

 Nếu cần thiết, có thể pha loãng kháng thể kếthợp FITC trong washing buffer và lọc qua một

bộ lọc để loại bỏ tinh thể FITC

 Phủ những tế bào cố định với FITC kết hợptrong washing buffer và ủ khoảng 30 – 60phút ở

37oC trong một phòng ẩm Những tế bào cầnđược che phủ hoàn toàn với sự kết hợp Một vài

sự kết hợp không tương thích với tủ CO2

 Rửa trong washing buffer 3 lần khoảng 5phút

 Rửa một lần trong destilled water

 Đặt một giọt mounting buffer lên trên tế bào.Nếu cần thiết sử dụng lamme để phủ tế bào

 Kiểm tra huỳnh quang tế bào chất bằng UVmicroscopy

iv Phương thức kiểm tra trực tiếp FAT

 Cắt phần mẫu thành những mảnh có độ dày tối

đa 5um và gắn chúng lên trên lam kính hiển vi

đã được làm sạch với cồn Chuẩn bị một số lamvới những phần của cùng một mô

 Làm khô phần gắn kết ở nhiệt độ phòng khoảng20phút

 Ổn định phần gắn kết trong aceton khoảng10phút ở -20oC

 Ngâm trong washing buffer một thời gian ngắn,loại bỏ chất lỏng thừa bằng khăn giấy và đặtchúng trong một khung trong một buồng tối ẩm

 Loại bỏ sự kiểm soát cố định hoàn toàn từ ổnđịnh sâu ( -70oC)

 Phân phối FITC kết hợp (FITC-conjugate) ở độpha loãng thích hợp trong washing buffer lêntrên toàn bộ mẫu, ủ trong bóng tối khoảng30phút ở 37oC

 Kiểm tra, dung dịch kết hợp không bay hơi vàsấy khô các mô

 Rửa mẫu 3 lần với washing buffer ở nhiệt độphòng trong 10phút

 Ngâm mẫu một thời gian ngắn trong distilledwater

 Nếu cần thiết, counterstain in evansblue khoảng

30 giây

 Cẩn thận loại bỏ chất lỏng thừa bằng khăn giấy

và đặt lamme với mounting buffer lên trên mẫu

 Kiểm tra huỳnh quang mẫu bằng UVmicroscopy