chuẩn đoán dịch tả heo bằng nuôi cấy tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Nhóm thực hiện: Nhóm MỤC LỤC I Đặt vấn đề II Tổng quan Virus dịch tả heo Cơ chế gây bệnh virus dịch tả heo Bệnh dịch tả heo Chẩn đoán dịch tả heo nuôi cấy tế bào a Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào i Dòng tế bào thận heo PK15 ii Môi trường nuôi cấy tế bào iii.Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15 iv.Nuôi cấy không cần ly tâm v Thuốc thử b Phân lập virus dịch tả heo i Nguyên tắc kiểm tra ii Phương pháp nuôi cấy đế phân lập virus iii.Sự chuẩn bị mẫu Chuẩn bị quan Chuẩn bị bạch cầu c Phương thức kiểm tra i Sự sàn lọc ii Phân lập virus qua hai lần iii.Nguyên liệu d Miễn dịch đánh dấu để phát virus CFS nuôi cấy tế bào i Cố định tế bào ii Đánh dấu với thuốc nhuộm peroxidase iii.Đánh dấu với thuốc nhuộm FITC iv.Phương thức kiểm tra trực tiếp FAT v Nguyên liệu III Kết luận I Đặt vấn đề Bệnh dịch tà heo (Classical swine fever) bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh heo, nhận diện lần đầu vào năm 1833 Ohio Virus gây bệnh dịch tả heo ( DTH) virus RNA chuỗi đơn, mạch dương, có vỏ bọc bên ngoài, xếp vào giống Pestivirus, họ Flaviviridae (Wengler, 1995) Cho đến nay, DTH bệnh gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi heo quốc gia khắp giới Việt Nam Xét mặt kinh tế, bệnh DTH gây thiệt hại lớn do: (1) tỷ lệ bệnh tỷ lệ chết cao đàn nhạy cảm virus có độc lực cao, (2) heo mắc bệnh không chết còi cọc chậm lớn, (3) tổn phí tiêm phòng cao (nếu heo không tiêm phòng khả heo mắc bệnh cao), (4) quan trọng không xuất thịt heo đàn heo nước có bệnh DTH Xét mặt lâm sàng, bệnh DTH biểu nhiều thể khác cấp tính, bán cấp tính, mãn tính không điển hình (atypical) hay không biểu rõ (inapparent), thể mãn tính lại thể phổ biến Việt Nam (Nguyễn Tiến Dũng, 2002) Do đó, việc chẩn đoán bệnh DTH cần thiết để kịp thời điều trị Những kỹ thuật áp dụng để phát virus DTH mẫu nghi ngờ DTH kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật ELISA, kỹ thuật PCR phân lập virus tế bào nuôi cấy Trong đó, phân lập virus tế bào nuôi cấyđược xem phương pháp vàng chẩn đoán bệnh truyền nhiễm Phân lập virus thường có độ nhạy cao phương pháp xét nghiệm kháng nguyên virus II Tổng quan Virus dịch tả heo Virus DTH virus RNA chuỗi đơn, mạch dương, có vỏ bọc bên ngoài, kích thước tương đối nhỏ với đường kính khoảng 40 – 50 nm Virus DTH xếp vào giống Pestivirus, họ Flaviviridae (Wengler ctv, 1995) Virus DTH chia thành nhóm kháng nguyên sau: Nhóm 1.1: gồm chủng virus vaccine, phân lập virus Anh, Mỹ năm 1940 – 1950; Nhật năm 1960; Tây Âu năm 1920 năm 1970; Brazil Nam Triều Tiên năm 1980; Ukraine, Croatia, Mexico Thái lan năm 1990; Trung Quốc Nhóm 1.2: gồm chủng virus vaccine, phân lập virus Tây Âu năm 1940, Malaysia Mỹ năm 1960; Cuba ukraine năm 1990; Úc Nhóm1.3: gồm virus phân lập malaysia năm 1980; Thái Lan năm 1980 1990; Honduras năm 1990 Nhóm 2.1: virus phân lập malaysia năm 1980; Tây Âu năm 1980 1990; Đông Âu năm 1990 Nhóm 2.2: gồm virus phân lập Singapore năm 1980; Tây Âu năm 1980 1990; Thái Lan năm 1990 Nhóm 2.3: virus phân lập Nhật năm 1970; Tây Âu năm 1980 1990; Đông Âu năm 1990; Nga Nhóm 3.1: có dòng Congenital Tremor phân lập Anh năm 1960 Nhóm 3.2: gồm virus phân lập Nam Triều Tiên năm 1980 1990 Nhóm 3.3: gồm virus phân lập Thái Lan năm 1990 Nhóm 3.4: virus phân lập Nhật năm 1970; Đài Loan năm 1990 Cơ chế gây bệnh virus DTH Trong điều kiện tự nhiên, virus xâm nhập vào vật chủ chủ yếu thông qua đường miệng mũi, qua kết mạc, niêm mạc đường sinh dục vùng da bị trầy xước Bảy sau xâm nhập, vị trí virus tái sản tế bào thượng bì hạch hạnh nhân Sau tái sản ban đầu, mười sáu sau virus theo hệ thống mạch bạch huyết xâm nhập vào hạch bạch huyết, tiếp tục tái sản vào hệ thống mạch máu ngoại vi gây nhiễm virus huyết lần thứ Theo hệ thống tuần hoàn, lượng lớn virus nhân lên mô bào đích thứ hai lách, tuỷ xương, hạch bạch huyết nội tạng đường tiêu hoá, bạch cầu lưu hành tế bào đơn nhân Đồng thời với sinh sản, virus phá huỷ tế bào nội mạc mao mạch (máu, bạch huyết), mảnh vỡ tụ lại thành vật gây tắc mạch, dẫn đến nhồi huyết lách, xuất huyết hoại tử ruột… nhiễm virus huyết lần hai xảy vào ngày thứ – đạt tối đa vào ngày thứ bảy sau cảm nhiễm (Trần Thanh Phong, 1996) Như vậy, virus DTH có độc lực khắp tổ chức, biểu mô sau xâm nhập vào thể vật chủ – ngày Bệnh dịch tả heo a Dấu hiệu lâm sàng bệnh dịch tả heo Tuỳ thuộc vào tuổi gia súc độc lực virus mà có nhiều thể lâm sàng khác nhau: - Thể bệnh DTH điển hình gồm có cấp tính, cấp tính, mãn tính (thể mãn tính có thời gian biểu triệu chứng lâm sàng kéo dài tháng) triệu chứng thông thường hay gặp: + Heo bồn chồn, thường nằm góc chuồng, nằm rên nhẹ nghiến + Sốt cao (41- 42oC), chán ăn, lông xù, run rẩy + Thấy xuất huyết đám da, lấm chấm bụng + Lúc đầu heo bị bón, sau chuyển sang tiêu chảy + Viêm kết mạc mắt, mắt đỏ, có ghèn + Giảm bạch cầu huyết - Thể bệnh không điển hình có hai dạng: + Thứ nhất: sẩy thai, thai chết, thai dị dạng, heo sinh chết sớm… + Thứ hai: heo mang trùng phát bệnh vào khoảng – tháng tuổi b Một số bệnh tích đặc trưng bệnh dịch tả heo - Xuất huyết hạch hạnh nhân, loét cuống lưỡi hay hạch hạnh nhân - Nhồi huyết rìa lách - Xuất huyết da, phủ tạng, thận, bàng quang - Các hạch ruột bị xuất huyết - Loét hình cúc áo van hồi manh tràng Chẩn đoán dịch tả heo nuôi cấy tế bào a Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào i Dòng tế bào thận heo PK15 Dòng tế bào PK15 phù hợp cho tất phương pháp kiểm tra để chuẩn đoán CSF e.g phân lập virus, tái tạo virus, kiểm tra trung hoà Dòng tế bào lấy từ CRL Nó thành lập tạo dòng tế bào đơn Các tế bào cung cấp tự từ Mycoplasma, virus BVD, pestivirus khác kháng thể BVD ii Môi trường nuôi cấy tế bào • EMEM với FCS 5% • EMEM với FCS 10% • Môi trường EDulb với FCS 5% • Kháng sinh vi khuẩn kháng nấm (Penicillin/Streptomycin, Fungizone,…) • Huyết thai bê iii Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15 Sự nhân tế bào PK15 giữ bình nuôi cấy 75cm2 (250 ml) với 20ml môi trường nuôi cấy tế bào Hai tuần lý tưởng, tuần đủ  Lấy môi trường rửa với PBS/Versene  Ủ 10phút 37oC với PBS/V  Thêm 0.1ml Trypsin hoà tan 1%  Ủ 10 – 20phút 37oC tế bào lấy từ đĩa  Thêm môi trường với FCS để ngăn chặn phản ứng trypsin  Ly tâm dịch huyền phù tế bào loại bỏ mặt  Tái lơ lửng viên kết 10ml môi trường thể tích thích hợp khác iv Nuôi cấy không cần ly tâm Để tránh tế bào bị tổn hại ly tâm bỏ qua bước tiêu tốn thời gian, phương pháp hữu dụng  Lấy môi trường từ bình nuôi cấy 250ml  Rửa đơn lớp với 5ml ATV hoà tan khoảng 30giây  Lấy ATV thay với 2ml ATV  Ủ 37oC 15phút tế bào tách  Thêm 8ml môi trường nuôi cấy chứa 5% FCS để có thể tích tổng cộng 10ml v Thuốc thử PBSV:  NaCl: 8,0 g/l  KCl : 0,2 g/l  Na2HPO4 x 12 H2O: 2,37 g/l  KH2PO4: 0,2 g/l  Versene: 0,2 g/l 10  Tế bào cố định nhuộm màu iii Nguyên liệu Dextran solution 5%:  Dextransulphat-Na, MW 500.000: 5g  EDTA-Solution 1.5%: 100 ml PBSM :  NaCl: 8,0 g  KCl: 0,2 g  Na2HPO4: 2,37 g  Dextrose: 1,0 g  Phenolred: 0,016 g  Aqua bidest: ad 1000 ml Dung dịch kháng sinh  Penicilline/Streptomycin:  Na-Benzylpenicilline 107 I.U  Streptomycinsulphate: 10 g  PBS: 100 ml  Glutamine based antibiotic cocktail: 15  Streptomycinsulfate 11,25 g dissolved in 390 ml Aqua dest  Na-Benzylpenicilline x 106 I.U dissolved in 90 ml Aqua dest  L-Glutamine 26,28 g dissolved in 420 ml Aqua dest  Mix and filter the three solutions  Fungizone x 105 I.U dissolved in 100 ml Aqua dest  Add to the above filtrate and store at –20°C in 10 ml aliquotes until use  Application: 10 ml in liter medium d Miễn dịch đánh dấu đế phát virus CFS nuôi cấy tế bào Nói chung CSF không gây hiệu ứng cytopathic Do đó, tế bào gây đôc CSF phải ghi dấu miễn dịch để phát kháng nguyên virus tế bào chất tế bào i Cố định tế bào Việc cố định phụ thuộc vào việc môi trường nuôi cấy phát triển bề mặt thuỷ tinh hay nhựa Đối với môi trường phát triển bề mặt thuỷ tinh, cố định aceton 100% khoảng 5phút Trong trường hợp bề mặt nhựa sử dụng phương pháp định hình khác nhau: 16  Chuyển môi trường nuôi cấy hoàn toàn ủ 70 – 80oC khoảng – 3h  Thêm vào giếng 100ul dung dịch aceton/methanol ( 1:1) để 10phút nhiệt độ phòng  Ổn định aceton 20% khoảng 10phút Sấy khô đèn bàn 25 – 30oC khoảng 4h ii Đánh dấu với thuốc nhuộm peroxidase Đánh dấu trực tiếp  Rửa đĩa lần PBS – Tween  Thêm vào giếng dung dịch pha loãng PBS – Tween Đĩa 24 giếng thêm 200ul/giếng, đĩa 96 giếng thêm 50ul/ giếng  Ủ 1h 37oC phòng ẩm  Rửa đĩa 3lần với PBS –Tween lần với Aqua dest  Thêm vào giếng 200 hay 50ul dung dịch chromogen-substrate nhuộm khoảng 15 – 30phút nhiệt độ phòng  Loại bỏ dung dịch chromogen-substrate rửa với 1/3 PBS/H2O 17  Làm đầy giếng với Aqua dest, đọc kết low-power microscopy.Tế bào chất tế bào nhiễm bệnh có màu đỏ sẫm Đánh dấu gián tiếp  Thêm vào giếng dung dịch pha loãng huyết đặc hiệu dịch tế bào lai đơn dòng thích hợp có chứa pestivirus ủ khoảng 1h 37 oC Đĩa 24 giếng thêm 200ul/ giếng, đĩa 96 giếng thêm 50ul/ giếng  Rửa lần với PBS – Tween lần với Aqua dest  Thêm vào giếng dung dịch pha loãng PBS – Tween có chứa peroxidase công nghiệp ủ khoảng 1h 37oC  Rửa lần với PBS – Tween lần với Aqua dest  Ủ với kháng thể thứ hai, yêu cầu nhà sản xuất  Thêm vào giếng 200 hay 50ul dung dịch chromogen-substrate nhuộm khoảng 15 – 30phút nhiệt độ phòng  Loại bỏ dung dịch chromogen-substrate rửa với 1/3 PBS/H2O  Làm đầy giếng với Aqua dest đọc kết low-power microscopy.Tế bào chất tế bào nhiễm bệnh có màu đỏ sẫm 18 19 Immune labelling using peroxidase iii Đánh dấu với thuốc nhuộm FITC 20  Rửa lamme, đĩa lame lần với washing buffer  Nếu cần thiết, pha loãng kháng thể kết hợp FITC washing buffer lọc qua lọc để loại bỏ tinh thể FITC  Phủ tế bào cố định với FITC kết hợp washing buffer ủ khoảng 30 – 60phút 37oC phòng ẩm Những tế bào cần che phủ hoàn toàn với kết hợp Một vài kết hợp không tương thích với tủ CO2  Rửa washing buffer lần khoảng 5phút  Rửa lần destilled water  Đặt giọt mounting buffer lên tế bào Nếu cần thiết sử dụng lamme để phủ tế bào  Kiểm tra huỳnh quang tế bào chất UV microscopy 21 iv Phương thức kiểm tra trực tiếp FAT  Cắt mảnh mô để sử dụng, x x 0.5cm gắn với hợp chất cryo-embedding distilled water vào khối gắn kết cryostat  Ổn định mẫu lên khối cryostat Nhiệt độ ổn định -15 – 20oC Shock-freezing nHeptan làm mát với Nitơ lỏng  Cắt phần mẫu thành mảnh có độ dày tối đa 5um gắn chúng lên lam kính hiển vi làm với cồn Chuẩn bị số lam với phần mô  Làm khô phần gắn kết nhiệt độ phòng khoảng 20phút 22  Ổn định phần gắn kết aceton khoảng 10phút -20oC  Ngâm washing buffer thời gian ngắn, loại bỏ chất lỏng thừa khăn giấy đặt chúng khung buồng tối ẩm  Loại bỏ kiểm soát cố định hoàn toàn từ ổn định sâu ( -70oC)  Phân phối FITC kết hợp (FITC-conjugate) độ pha loãng thích hợp washing buffer lên toàn mẫu, ủ bóng tối khoảng 30phút 37oC  Kiểm tra, dung dịch kết hợp không bay sấy khô mô  Rửa mẫu lần với washing buffer nhiệt độ phòng 10phút  Ngâm mẫu thời gian ngắn distilled water  Nếu cần thiết, counterstain in evansblue khoảng 30 giây  Cẩn thận loại bỏ chất lỏng thừa khăn giấy đặt lamme với mounting buffer lên mẫu  Kiểm tra huỳnh quang mẫu UV microscopy 23 Demonstration of viral antigen in cryostat sections (Direct Fluorescent Antibody Test - FAT) 24 v Nguyên liệu 25 Nhuộm peroxidase  PBS-Tween: litre PBS containing ~0,01% Tween20 2-3 drops  1/3 PBS: PBS : H2O = :  Antispecies antibodies: Commercially available  Chromogen-substrate solution: 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC): 20 mg Dimethylformamide: ml Sodium Acetate-Buffer: ad 50 ml H2O2 (3 %): 0,4 ml  Sodium Acetate-Buffer (pH 5,0; 0,05 M): Sodium Acetate-Trihydrate: 6,804 g Aqua bidest: 1000 ml Nhuộm FITC 26  washing buffer:  Phospate buffered (Physiological saline saline (pH buffered 7.4 with - 7.6): 0.01M phosphate)  NaCl: 8.78 g/l  Na2HPO4 x 12H2O: 3.58 g/l (pH adjusted with 1M KH2HPO4)  mounting buffer  washing buffer with 20% glycerine (buffered glycerine)  Or commercial NON-FADING mountant Nhuộm FAT  washing buffer:  Phosphate buffered saline (pH 7.4 - 7.6): (Physiological saline buffered with 0.01M phosphate)  NaCl: 8.78 g/l  Na2HPO4 x 12H2O: 3.58 g/l (pH adjusted with 1M KH2HPO4)  Evans Blue  Stock solution 1:100 in destilled H2O  For use dilute 1:2000 in PBS 27  Mounting buffer  washing buffer with 20% glycerine (buffered glycerine) III Kết luận Đã phân lập virus nhờ phương pháp nuôi cấy tế bào Đây phương pháp vàng chẩn đoán bệnh truyền nhiễm có độ nhạy cao Việc đánh giá kết phải thực với kết hợp phương pháp nhuộm màu virus khả gây bệnh tích tế bào Là phương pháp thu nhận virus cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp chậm, đắt tiền, đòi hỏi tay nghề cao áp dụng chủ yếu phòng thí nghiêm tham chiếu 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học thú y Nguyễn Ngọc Hải Hess, R G., Coulibaly, C O., Greiser-Wilke, I., Moennig, V., and Liess, B., 1988 Identification of hog cholera viral isolates by use of monoclonal antibodies to pestiviruses Greiser-Wilke, I., Zimmermann, B., Fritzemeier, J., Floegel, G., and Moennig, V., 2000 Structure and presentation of a world wide web database of CSF virus isolates held at the EU eference laboratory Vet.Microbiol 73, 2-3 131-136 Peters, W., Greiser-Wilke, I., Moennig, V., and Liess, B., 1986 Preliminary serological characterization of bovine viral diarrhoea virus strains using monoclonal antibodies Vet.Microbiol 12, 195-200 www.google.com The Gray Book - Classical Swine Fever 29 [...]... trên ống môi trường nuôi cấy tế bào Luôn luôn nuôi cấy hai bản của mỗi mẫu  Ủ ở 37oC trong 1 – 2h  Tế bào được rửa hai lần với PBSM và tiếp tục nuôi ít nhất 72h ở 37oC EMEM với FCS 10% là môi trường lý tưởng cho phát triển virus  Có thể tiêm tế bào và mẫu đồng thời, nếu mẫu mới và hiệu lực độc tế bào không xảy ra  Ống nuôi cấy tế bào được đông lạnh ở -80oC ít nhất 1h  Ống nuôi cấy được rả đông và... Phương pháp nuôi cấy tế bào để phân lập virus Nuôi cấy tế bào của những tế bào PK15 thì sau 24giờ và nên tiêm confluent 50 – 80% vào các mẫu xét nghiệm iii Sự chuẩn bị mẫu Chuẩn bị cơ quan Thích hợp cho các mẫu cơ quan như lách, thận, mô bạch huyết hoặc hồi tràng Mẫu nên được giữ lạnh và xử lý càng sớm càng tốt  Mẫu cơ quan 1cm3 được nghiền trong một cối xay với 9ml môi trường nuôi cấy tế bào có chứa... until use  Application: 10 ml in 1 liter medium d Miễn dịch đánh dấu đế phát hiện virus CFS trong nuôi cấy tế bào Nói chung CSF không gây ra hiệu ứng cytopathic Do đó, những tế bào gây đôc CSF phải được ghi dấu miễn dịch để phát hiện các kháng nguyên virus trong tế bào chất của tế bào i Cố định tế bào Việc cố định sẽ phụ thuộc vào việc môi trường nuôi cấy phát triển trên bề mặt thuỷ tinh hay nhựa Đối với... trường nuôi cấy tế bào có chứa confluent 50 – 80% trong đĩa hoặc ống Leighton, đủ để trải lớp đơn Nên nuôi cấy hai bản của mỗi mẫu  Ủ ở 37oC trong 1 – 2h 13  Rửa một lần với PBSM và trải với môi trường mới  Ủ lên đến 72h ở 37oC trong tủ CO2  Có thể tiêm tế bào và mẫu đồng thời, nếu mẫu mới và hiệu lực độc tế bào không xảy ra  Đối chứng dương và âm phải được xử lý theo cùng một cách  Tế bào được... giếng 200 hay 50ul dung dịch chromogen-substrate và nhuộm khoảng 15 – 30phút ở nhiệt độ phòng  Loại bỏ dung dịch chromogen-substrate và rửa với 1/3 PBS/H2O 17  Làm đầy giếng với Aqua dest, và đọc kết quả bằng low-power microscopy .Tế bào chất của các tế bào nhiễm bệnh có màu đỏ sẫm Đánh dấu gián tiếp  Thêm vào mỗi giếng dung dịch pha loãng huyết thanh đặc hiệu hoặc dịch nổi tế bào lai đơn dòng thích... Antibiotics if considered necessary  b Phân lập virus dịch tả heo i Nguyên tắc kiểm tra Mẫu cơ quan hoặc bạch cầu được nuôi trên những tế bào virus CFS nhạy cảm để cho phép gắn và nhân lên của virus Từ sự tăng trưởng của virus không gây ra một cytopathic có hiệu lực, sự hiện diện của nó phải được chứng minh bằng một phương pháp immunostaining Các tế bào thì được cố định và kháng nguyên virus thì được... lưu trữ  Trong trường hợp dịch huyền phù bạch cầu được tiêm đồng thời với những tế bào nhạy cảm nên được đông lạnh trong thời gian ngắn để tan bạch cầu và tránh hiệu lực độc tế bào  Mẫu huyết tương  10ml máu đã được kháng đông bởi EDTA hoặc Heparin phải được đóng băng và làm tan để tiêu diệt các bạch cầu Sau khi làm tan huyết tương được tiêm trực tiếp vào nuôi cấy tế bào c Phương thức kiểm tra i... khoảng 30 – 60phút ở 37oC trong một phòng ẩm Những tế bào cần được che phủ hoàn toàn với sự kết hợp Một vài sự kết hợp không tương thích với tủ CO2  Rửa trong washing buffer 3 lần khoảng 5phút  Rửa một lần trong destilled water  Đặt một giọt mounting buffer lên trên tế bào Nếu cần thiết sử dụng lamme để phủ tế bào  Kiểm tra huỳnh quang tế bào chất bằng UV microscopy 21 iv Phương thức kiểm tra trực... nhiệt độ cao sẽ đốt nóng mẫu có thể ảnh hưởng đến virus  Sự chuẩn bị ở nhiệt độ phòng trong 1giờ  Ly tâm 15phút, 2500vòng  Nổi tầng mặt thì được sử dụng để tiêm trong nuôi cấy tế bào Sự pha loãng 1 : 10 và 1 : 100 có thể được xử lý song song, trong trường hợp hiệu ứng độc tế bào Sự khử trùng có thể được thực hiện nếu được coi cần thiết Chuẩn bị bạch cầu ( leukocyte)  Mẫu máu được kháng đông bởi... glycerine) III Kết luận Đã phân lập được virus nhờ phương pháp nuôi cấy tế bào Đây là phương pháp vàng trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và có độ nhạy cao Việc đánh giá kết quả phải được thực hiện với sự kết hợp phương pháp nhuộm màu do virus không có khả năng gây bệnh tích tế bào Là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các nghiên cứu tiếp theo Tuy nhiên, phương pháp này rất chậm, đắt tiền, đòi hỏi ... tràng Chẩn đoán dịch tả heo nuôi cấy tế bào a Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào i Dòng tế bào thận heo PK15 Dòng tế bào PK15 phù hợp cho tất phương pháp kiểm tra để chuẩn đoán CSF e.g...a Dòng tế bào thích hợp cho nuôi cấy tế bào i Dòng tế bào thận heo PK15 ii Môi trường nuôi cấy tế bào iii .Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15 iv .Nuôi cấy không cần ly tâm v Thuốc... (Penicillin/Streptomycin, Fungizone,…) • Huyết thai bê iii Nuôi cấy truyền thống tế bào PK15 Sự nhân tế bào PK15 giữ bình nuôi cấy 75cm2 (250 ml) với 20ml môi trường nuôi cấy tế bào Hai tuần lý tưởng, tuần đủ  Lấy