CHẨN ĐOÁN VIRUS H5N1 BẰNG NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG

Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng TRNG I HC NễNG LM TP H CH MINH B MễN CễNG NGH SINH HC CHN ON VIRUS H5N1 BNG K THUT NUễI CY PHễI TRNG GVHD: PGS.TS NGUYN NGC HI SVTH: Nhúm -1- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Ti liu tham kho A t B Tng quan I Thụng tin chung v cỳm gia cm 1.Cỳm gia cm l gỡ? .3 Vi-rỳt cỳm khuych tỏn v lõy truyn nh th no? Hin dch cỳm gia cm xy nh th no? .7 Cỳm gia cm nh hng n sc kho ngi .8 (a) S lan rng v tn ti lõu di ca dch cỳm gia cm gõy mi nguy c ln i vi sc kho ngi (b) Cỏc trng hp cỳm gia cm H5N1 xy trờn ngi .9 (c) Con ngi b nhim vi-rỳt cỳm H5N1 trng hp no Triu chng ca bnh cỳm gia cm ngi l gỡ? 10 (a) Yu t dch t 10 (b) Lõm sng 10 (c) Cn lõm sng 11 II Chn oỏn bnh phũng thớ nghim 11 S thu thp mu xột nghim 11 S chuyn mu xột nghim 12 Phỏt hin trc tip s tiờm nhim ca AIV 13 Phõn lp v nhn dng virus 16 4.1 Phõn lp virus bng tiờm dch nhng qu trng g cú phụi 16 4.1.1 Quỏ trỡnh vt liu cho chn oỏn virus 16 4.1.1.1 Ming gt ly mu l huyt 16 4.1.1.2 Mu mụ (c quan phi) .16 4.1.1.3 Vt liu 17 4.1.2 Th tc 17 Soi trng .17 S tiờm chng cho nhng qu trng 18 kho sỏt nhng qu trng ó c tiờm chng 19 S thu hoch ca nhng qu trng g c tiờm chng 19 Xột nghim hemagglutination 20 c kt qu 20 -2- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng a) Gii thớch kt qu .20 b) Xột nghim nhanh bng s dng vet smartđ test .21 C Kt lun .23 D Ti liu tham kho .23 -3- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng A t Virus cỳm v i dch cỳm gia cm gõy thit hi rt ln v kinh t ca mi quc gia trờn th gii v chỳng l mt thỏch thc ln cho ngnh y t nhng nm qua Vit Nam l mt nhng quc gia chu nh hng nhiu nht ca i dch ny Mc dự chỳng ta ó cú nhiu bin phỏp v n lc vic phũng chng nhng cha mang li hiu qu nh mong mun Trong cụng tỏc phũng chng vic chn oỏn xỏc nh chớnh xỏc virus gõy bnh l mt khõu ht sc quan trng Mt nhng k thut chn oỏn virus cỳm gia cm cú chớnh xỏc cao ú l k thut nuụi cy phụi trng B Tng quan I Thụng tin chung v cỳm gia cm Cỳm gia cm l gỡ ? Cỳm gia cm, cũn c gi l cỳm g, l bnh truyn nhim trờn ng vt, ch yu l loi chim, ụi cng thy trờn ln virỳt cỳm gia cm týp A gõy Chng vi-rỳt cỳm ny cú c tớnh cao, ụi vt qua hng ro bo v lõy nhim cho ngi -4- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Da trờn khỏng nguyờn, ngi ta chia cỳm gia cm thnh 16 phõn nhúm H (Haemagglutinin: H1-H16) v phõn nhúm N (Neuraminidase: N1-N9), ú phõn nhúm H5 v H7 cú c tớnh cao Hin ch cú vi-rỳt H1N1 v H3N2 ang lu hnh v gõy bnh ngi Vi-rỳt cỳm gõy dch cỳm gia cm hin l H5N1 v c chia lm nhúm: - Vi-rỳt cỳm gia cm cú c tớnh thp (Low pathogenic avian virus: LPAV): thng lu hnh loi chim hoang dó, khụng gõy bnh hay gõy bnh nh: xự lụng, gim sn lng trng v thng khụng c phỏt hin - Vi-rỳt cỳm gia cm cú c tớnh cao (Highly pathogenic avian virus: HPAV): rt nguy him Chỳng lan truyn rt nhanh n gia cm, gõy bnh nng nh hng n nhiu c quan v cui cựng gõy t vong gn 100% vũng 48 gi k t nhim bnh Bnh lý -5- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng LPAI ( low pathogenic avian influenza virus ) Nhng thng tn thay i vi ging, loi virus v tui ca kớ ch Thụng thng, ch nhng g tõy v nhng g biu l mt vi s thay i c bit ln v cc k nh vi nhng ging ó thớch nghi vi ký ch ( Capua v Mutinelli 2001) Trong g tõy, bnh viờm xoang, viờm khớ qun v airsacculitis ó c phỏt hin, mc du s tiờm nhim vi khun s cp cú th gúp phn khụng cú hi gỡ.Tu ca g tõy ó c mụ t vi nhng g bỡnh thng, s bc nh ca ng hụ hp thỡ thng c thy Thờm vo, nhng tn thng trung trờn nhng c quan sinh sn ca nhng g trng ( bung trng, vũi trng, viờm mng noón hon.) HPAI (hightly pathogenic avian influentza viruses ) Nhng thay i ln v bnh lý v mụ bnh hc ca HPAI bc l s ph thuc ging ghi vo danh sỏch cho s hin din ca triu chng lõm sn Bn loi thay i ca tỏc nhõn gõy bnh ó c thm dũ nguyờn lớ c bn ( Perkins and Swayne 2003): (i) Cú l (cht khong thi gian 24- 36 hours tiờm nhim, phn ln trụng thy loi galliforme) v dng cp tớnh ca bnh biu l nhng thay i bnh tớch khụng c thự: mt s hydropericardium ri rc, sung huyt nh rut v thnh thong cú nhng úm xut huyt trờn mng treo v mng ngoi ca mng c mụ t khụng nht quỏn ( Mutinelly 2003a, Jones and Swayne 2004) Nhng g ó b tỏc ng bi dũng H 5N1 chõu ụi lỳc biu hin xut huyt tng mng v tng lng cht nhy ỏng k khớ qun ( Elbers 2004) Tit dch r huyt cỏc khoang c th v phự n phi cú th c trụng thy khụng cú hi gỡ Nhng úm chy mỏu mng nhy ca d dy tuyn, nú thng c mụ t phn chớnh ca sỏch phn trc, ch cú s khỏc bit c gp gia cm ó nhim vi dũng H 5N1 chõu (Elbers 2004) Nhng tn thng mụ hc khỏc gn vi khỏng nguyờn ca virus cú th c phỏt hin cỏc mụ khỏc ( Mo 1997) Virus c trụng thy u tiờn mng -6- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng ca nhng t bo Vo mt giai on sau ú nhng t bo b nhim virus c phỏt hin c tim, tuyn thng thn v tu tng Nhng t bp thn kinh cng nh t bo thn kinh m ca b nóo cng b nhim.V bnh lý, mt tin trỡnh tng t virus mng khỏc cú th c tha nhn ni mng v s hot hoỏ ca bch cu ch dn n mt h thng v s phõn bo ri rc phúng thớch kh nng d mc bnh n tim phi hoc nhiu c quan hot ng kộm (Feldmann 2000, Klenk 2005) (ii) ng vt hu nh chỳng th hin mt s tn cụng kộo di ca nhng triu chng bnh v mt tin trỡnh kộo di ca bnh, triu chng thn kinh v mụ hc, nhng tn thng b nóo gõy mng m tri hn hn s hỡnh dung (Perkins and Swayne 2002a, Kwon 2005) Tuy nhiờn, virus cng cú th c phõn lp t nhng c quan khỏc Quỏ trỡnh c mụ t ngng, vt, diu v nhng loi khỏc tiờm thớ nghim vi dũng HPAI H5N1 chõu Trong nhng chim cho trng, chng viờm ca bung trng, vũi trng, v sau ú nang b v, cỏi gi l viờm phỳc mc lũng trng, cú th c trụng thy (iii) vt, mng bin, chim s, ch s tỏi bn ca virus c tỡm thy Nhng loi chim ny ó th hin viờm phi nh, viờm khớ qun v thnh thong t bo bch cu v viờm mụ c tim ( Perkins and Swayne 2002a, 2003) (iv) Trong nhng thớ nghim c mụ t bi Perkins v Swayne (2003), chim b cõu v chim sỏo bin chng t kh nng khỏng li s tiờm nhim ca virus H 5N1 Tuy nhiờn, Werner v cng s ( cụng b) ó cú kh nng gõy bnh thn kinh, s tha hng n viờm nóo khụng lm mng m (KlopBesch 2006), 5/16 chim b cõu dựng mt chng H5N1 HPAI phõn lp cỏch ay khụng lõu Vi-rỳt cỳm khuych tỏn v lõy truyn nh th no? -7- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Loi thy cm l ngun ca tt c cỏc loi vi-rỳt cỳm t nhiờn qua hng th k, k c týp H5 v H7 nhng thng cú c tớnh thp Tuy nhiờn chớnh cỏc chng c tớnh thp H5 v H7 ny truyn cho gia cm, chỳng bin i, t bin gen tr thnh chng c tớnh cao gõy nờn dch Trong thi gian gn õy, ngi ta ghi nhn mt s loi chim di trỳ cú kh nng khuych tỏn vi-rỳt H5N1 c tớnh cao ny Hin dch cỳm gia cm xy nh th no? - Dch cỳm gia cm bt u xy vo gia nm 2003 ti ụng Nam , l dch cỳm gia cm ln nht v nghiờm trng nht lch s loi ngi, lm cht hng lot cỏc loi chim Tỏc nhõn gõy bnh l vi-rỳt H5N1 tn ti dai dng, ó git cht hay khin ngi tiờu hy c tớnh khon 150 triu chim v gia cm Hin vi-rỳt ny c xem l tỏc nhõn gõy dch ti Indonesia, Vit Nam, mt s tnh Cambodia, Trung Quc, Thỏi Lan v Cng Ho Nhõn Dõn Lo Ngoi t gia thỏng 12/2003 u thỏng 2/2004, cỳm gia cm H5N1 c bỏo cỏo quc gia Chõu : Hn Quc, Vit Nam, Nht Bn, Thỏi Lan, Cambodia, Cng Ho Nhõn Dõn Lo, Indonesia v Trung Quc Hu ht cỏc quc gia ny cha bao gi tng xy dch cỳm gia cm lch s ca h - u thỏng 8/2004: cỳm gia cm H5N1 ln u tiờn bựng n ti Malaysia, k n l Nga vo cui thỏng 7/2005, mt s tnh Cng Ho Kazakhtan v Mụng C vo u 8/2005 Vo u 9/2005 cỳm cng ghi nhn ti Th Nh K v Romania Hin Nht Bn, Hn Quc v Malaysia c a danh sỏch cỏc quc gia b dch - Tớnh n 24/08/2006 cú 59 quc gia cú gia cm b nhim vi-rỳt cỳm H5N1 -8- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Cỳm gia cm nh hng n sc kho ngi nh th no? (a) S lan rng v tn ti lõu di ca dch cỳm gia cm gõy mi nguy c ln i vi sc kho ngi: - Nguy c lõy nhim trc tip vi-rỳt cỳm t gia cm b bnh, gõy bnh rt nng, ú chng vi-rỳt H5N1 gõy bnh nghiờm trng v cú t l t vong cao (>50%), ch yu l bnh viờm phi v suy a c quan a s xy trờn nhng bnh nhõn trc mc bnh thỡ hon ton kho mnh - Quan trng hn, nguy c vi-rỳt b t bin, bin i gen nờn d lõy truyn t gia cm sang ngi, ri t ngi sang ngi S bin i ny l phỏt i dch (b) Cỏc trng hp cỳm gia cm H5N1 xy trờn ngi: - 1997: cú 18 trng hp u tiờn xy Hong Kong, gõy t vong trng hp (chim t l 33,33%) - 2003: cú trng hp xy Hong Kong gia ỡnh cú tin s i du lch Trung Quc gn õy, gõy t vong trng hp (chim t l 50 %) - 2004: ti Thỏi-lan cú 17 ca v t vong 12 (chim t l 70,59%), Vit Nam cú 29 ca v t vong 20 (chim t l 68,97 %) -9- Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng - 2005: cú quc gia cú bnh nhõn nhim, tng cng 95 ca v t vong 41 (chim t l 43,16 %) - Tớnh n 23/08/2006: cỏc trng hp nhim vi-rỳt cỳm H5N1 c xỏc nh bng xột nghim c bỏo cỏo ti quc gia vi 96 ca b nhim v t vong 64 (chim t l 66,67 %) ú khụng cú Vit Nam Túm li, dch cỳm A (H5N1) ngi ó ghi nhn ti 10 quc gia trờn th gii, vi 232 trng hp mc bnh v cú tng cng 134 trng hp t vong (chim 57,9%) - Riờng ti Vit Nam, t ngy 14/11/2005 n gn thỏng khụng ghi nhn trng hp mc mi cỳm A (H5N1) ngi Tớnh t trng hp mc cỳm A(H5N1) u tiờn ti Vit Nam (26/12/2003) n ó ghi nhn 93 trng hp mc ti 32 tnh/thnh ph, ú cú 42 trng hp t vong (xem chi tit s liu bng 1) (c) Con ngi b nhim vi-rỳt cỳm H5N1 trng hp no? - Tip xỳc trc tip vi gia cm b bnh, tip xỳc vi b mt hay vt dng b nhim phõn ca gia cm b bnh - Hu ht cỏc trng hp xy nụng thụn, ngoi ụ hay ni cú nuụi gia cm - Phõn v cht tit ca chim nhim bnh thy mụi trng cha nhiu vi-rỳt cỳm gõy bnh xung mụi trng rt ln - Nghiờm trng hn c l ngi nuụi gia cm vựng dch t thy gia cm cú triu chng nhim bnh l lm tht, ch bin ri dựng hay bỏn th trng Ngun tip xỳc cú nguy c cao l ngi git gia cm, nh lụng v ch bin trc em nu chớn Triu chng ca bnh cỳm gia cm ngi l gỡ? Da trờn cỏc yu t v triu chng sau: (a) Yu t dch t: - Tip xỳc vi gia cm b bnh vũng tun trc ú (nuụi, buụn bỏn, chuyn, git m, n tht gia cm b bnh, n tit canh v.v ), hoc sng vựng cú dch cỳm gia cm - 10 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng - Tip xỳc gn vi ngi bnh ó xỏc nh cỳm, hoc ngi bnh t vong vỡ viờm phi cha rừ nguyờn nhõn (b) Lõm sng: Bnh din bin cp tớnh v cú th cú cỏc biu hin sau õy: - Cú du hiu nhim khun: st trờn 38oC, cú th rột run - Cỏc triu chng v hụ hp: o Ho, thng ho khan, au ngc, ớt gp triu chng viờm long ng hụ hp trờn o Khú th, th nhanh, tớm tỏi, o Ran n, ran m nghe phi o Cú th dn n suy hụ hp cp tin trin (ARDS) - Triu chng tun hon: nhp tim nhanh, ụi cú sc - Cỏc triu chng khỏc: au u, au c, tiờu chy, ri lon ý thc - Suy a tng (c) Cn lõm sng: - X quang phi: Tn thng thõm nhim lan to mt bờn hoc hai bờn, tin trin nhanh - Xột nghim mỏu: o Cụng thc mỏu: s lng bch cu: bỡnh thng hoc gim o Khớ mỏu: gim oxy mỏu bnh tin trin nng + PaO2 gim (< 85 mmHg), cú th gim nhanh (di 60 mmHg) T l PaO 2/FiO2 di 300 cú tn thng phi cp (ALI), di 200 cú suy hụ hp cp tin trin (ARDS) - Chn oỏn vi sinh vt: o Lm RT-PCR xỏc nh vi rỳt cỳm A/H5 o Phõn lp vi khun theo thng quy II Chn oỏn bnh phũng thớ nghim S thu thp mu xột nghim - 11 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Nhng mu xột nghim nờn dc thu thp t mt vi xỏc xỳc vt cht cũn ti v t nhng chim b bnh ca mt òock Theo lý tng, s ly mu y c nhỡn li bng phng phỏp thng kờ v s chn oỏn c lm trờn mt òock Khi thu thp mu nghi nhim HPAI, tiờu chun an ton phi c kho sỏt trỏnh s phi by ca nhng ngi su mu n kh nng ca HPAIV (Bridges 2002), Nguyờn tc ch o c ngh bi CDC (CDC 2005) Khi xột nghim virus, nhng bụng thm thu c t l huyt v vựng hu thụng thng cho phộp mt phũng thớ nghim iu tra y v hon chnh Vt liu thu thp trờn nhng mu bụng nờn c trn vo 2-3ml mu i din ca mt mụi trng chuyn ng trng vụ trựng bao gm khỏng sinh b sung v mt protein ngun (e.g 0,5%[ w/v] albumin huyt bũ, 10% huyt bũ hoc mt dung dch pha ly gia nóo) Khi m x phõn tớch, mang ngoi di nhng iu kin an ton v trỏnh phỏt tỏn mm bnh (xem trng), nhng mu bnh phm ca nóo, khớ qun/phi, lỏch v cỏi gỡ ú cha rut khụng c bo qun c thu thp cho vic phõn lp virus Mc ớch ca huyt hc, nhng mu mỏu t nhiờn c ly Mt s mu ó thu thp nờn phỏt hin bng mt khong thi gian tin cy 95% cho mt gii hn vi mt s ph bin 30% S chuyn mu xột nghim - 12 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Nhng mu bụng thm, mụ v mỏu nờn c gi lnh chuyn nhng khụng cho phộp ụng ỏ Nu nhng tr ngi gp phi trờn ng chuyn lm thi gian kộo di hn 48h, nhng mu xột nghim nờn c úng bng v chuyn trờn cacbondioxit m c Trong tt c cỏc trng hp, nhng iu chnh an ton chuyn (e.g IATA rules) nờn c kho sỏt k trỏnh phỏt tỏn mu bnh v s phi nhim ca ngi sut quỏ trỡnh chuyn Nú l thớch hp cao tip xỳc phũng thớ nghim c b nhim cho vic chn oỏn trc gi nhng mu phõn tớch n v, lý tng, troen tru trc thu thp chỳng Phỏt hin trc tip s tiờm nhim ca AIV C bn, ú l hai (parallel) ng ca nhng phng phỏp chn oỏn chỳng c th phõn lp v kiu ph ca virus bng nhng phng phỏp c bn ( xem s tay OIE 2005 ) v phỏt hin phõn t v c trng ca b gen virus Thụng thng, AI virus c phõn lp bi s tiờm dch ca nhng gt t hoc nhng mụ ng cht ca trng g cú phụi t 9- 11 ngy tui, thng bng mng m tỳi niu ( Woolcock 2001 ) Ph thuc dng tỏc nhõn, nhng phụi cú th hoc khụng th cht vi ngy kho sỏt , v thng ú l nhng thng tn c thự c trụng thy phụi ny hoc mng tỳi niu ( Mutinelli 2003b) Nhng qu trng c tiờm chng vi HPAIV bao gm vt liu thng cht vũng 48 gi S xut hin ca mt tỏc nhõn ngng kt cú th c phỏt hin tm gt ca tỳi niu S ngng kt (HA) l mt k thut vụ tỡnh yờu cu ớt nht 10 6.0 mnh nh mi ml Nu ch trung mt lng thp virus c hin din cht tiờm chng, tu vo hai s i qua c y mnh nhng trng c th tinh cú th - 13 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng cn thit cho mt vi ging LPAIV, kiu sn xut virus phỏt hin bng HA Trong trng hp ca HPAIV , mt s i qua th hai s dng cht tiờm chng pha loóng cú th thun li cho s sn xut ti u ca s ngng kt S phõn lp ngng kt c mụ t khỏng nguyờn bng th nghim c ch ngng kt (HI) s dng (mono-) khỏng khỏng huyt loi ph 16 H v cho vic kim soỏt, khỏng li nhng nhng type khỏc ca virus trờn gia cm, nhng type ny cng th hin hot ng nhng kt Loi ph NA cú th c c xỏc nh sau ú bi th nghim c ch neuraminidase, mc khỏc yờu cu lai ph huyt dc bit ( Aymard 2003 ) Trong trng hp phõn lp nhng dũng H hoc H7 c chm trỏn, bng lit kờ tỏc nhõn ng mch gõy bnh (IVPI) cn thit cho vic xỏc nh phõn bit gia kiu LP v HP (Allan 1977 ) ú c hon thnh bi s tiờm chng iv ca 10 g c tun tui vi virus phõn lp trng phỏt trin ( 0,1 ml ca 10dung dch pha loóng ca dch tỳi niu bao gm mt chun ln hn 16) Nhng g c kho sỏt trờn mt thi k mi ngy cú triu chng bnh Nhng kt qu c nhp v bờn mt bng biu th mt virus HPAI t l ln hn 1.2 c s dng Nh mt s la chn, mt HPAI phõn lp c th sc ti thiu ngoi 10 ( 75% ) g c tiờm chng cht vi giai on kho sỏt Nhng th tc c bn c mụ t cú th a n mt s chn oỏn HPAI khong thi gian ngy nhng cú th ũi hi nhiu hn hai tun loi tr s cú mt ca AIV Trong tỡnh thờm vo, nhng cụng c chn oỏn cht lng cao ( SPF eggs, H- and N-subtype specific antisera) v k nng ca mi ngi l iu kin quyt nh trc ht Ngy nay, khụng mt s ng dng nuụi cy t bo no cho vic phõn lp AIV, s phõn lp AIV cú th t c s nhy cm ca nhng trng mỏi cú phụi ( Seo 2001) ii) Mt s tip cn nhanh chúng, c bit loi tr s tiờm nhim c ũi hi, tn dng k thut sinh hc phõn t, nú nờn theo mt kiu phõn tng: s hin din ca RNA c bit ca virus cỳm c phỏt hin thụng qua k thut RT-PCR k thut ny - 14 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng nhm vo nhng on ca gen M, hu ht nhng vựng genome bo tn cao ca nhng virus cỳm ( Fouchier 2000, Spackman 2002), hoc nhng gen mó hoỏ capsid (Dykaer 2004) Khi mt kt qu dng tớnh t c, RT-PCRs s khuch i nhng on ca gen ngng kt ca loi ph H5 v H7 c chy phỏt hin s cú mt ca AIVs cú th khai bỏo ( Dybkear 2004, Spackman 2002) Khi s ỏp li dng tớnh, mt chn oỏn phõn t ca loi tỏc nhõn gõy bnh (LP chng li HP) cú th thc hin c sau gii trỡnh t mt on ca gen HA tri di vựng phõn tỏch bi enzyme proteoza ni thớch ng Hin ti phõn lp vi nhng amino acid phc cú tớnh baz c phõn loi nh HPAI PCRs v nhng k thut DNA khỏc ang c thit k cho vic phỏt hin dũng H5N1 chõu (Collins 2002, Payoungporn 2004, Ng 2005) Loi ph Non-H5/ H7 cú th c nhn din bi mt RT-PCR hp vi tiờu chun v phõn tớch trỡnh t sau ú ca n v di HA-2 (Phớpp 2004).ú l nhng primer cho mi loi ph NA Mt c trng y cú th t c vũng ngy, c bit k thut real time PCR c s dng (Perdue 2003, Lee and Suarez 2004) Tuy nhiờn nhng chip DNA c phỏt trin chỳng cú th xỳc tin vic sp xp cú hiu qu hn cỏc loi virus AI (Li 2001, Kessler 2005) Mt s chn oỏn loi tr thỡ cú kh nng thc hin khong mt ngy lm vic mt mỡnh Nhng bt li ca nhng phng phỏp chn oỏn phõn t l giỏ thnh tr cho vic mua nhng thit b v nhng th cú th dựng, nhng nu cú sn, mt vi mu cú th c phõn tớch vi ớt ngi thi gian ngn hn cc kỡ so vi phõn lp virus trng Tuy nhiờn, khụng nờn gi mt rng mi phn ng PCR hoc lai phõn t, ngc vi phõn lp virus nhng qu trng, cha chp mt bn cht khụng rừ rng liờn quan n s hin din ca nhng thay i c bit vic phõn lp ti nhng v trớ liờn kt ca nhng primer v/hoc nhng probe chỳng cú th a n th nghim õm tớnh gi Do ú, mt s kt hp ca sinh hc phõn t ( e.g kt qu sng lc) v nhng phng phỏp phõn loi (e.g c trng khụng thay i ca phõn lp v xỏc nhn ca - 15 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng phng phỏp chn oỏn ca mt bng ph lc) cú th giỳp i trng s bt li ca hai nguyờn lý Nhng phng phỏp th nghim nhanh c thit k cho vic phỏt hin khỏng nguyờn ca virus nhng vt mụ phng phỏp xột nghim kớnh pht v cryostat section s dng dch phỏt hunh quang hoc th nghim dch liờn kt enzyme bt gi khỏng nguyờn (ELISA) v nhng h thng que o mc nc dũng chy phn bờn cht lu ming gt Cho n bõy gi, nhng k thut cú nhy thp hn k thut phõn lp virus hoc PCR,v ú cú th gp khú khn chp nhn cho mt phng phỏp chn oỏn hp lý, c bit ca mt bng danh mc ( Davision 1998, Selleck 2003, Cattoli 2004) ng dng ca nhng phng phỏp xột nghim nht trờn mt phng lnh vc thỳ y thỡ cũn giai on phụi thai v cn c y mnh vic phỏt trin Phõn lp v nhn dng virus 4.1 Phõn lp virus bng tiờm dch nhng qu trng g cú phụi 4.1.1 Quỏ trỡnh vt liu cho chn oỏn virus 4.1.1.1 Ming gt ly mu l huyt 30 ming gt ly mu l huyt s c chia nh mt mu c phõn phi buffer cha nhng khỏng th 30 ml ( isotonic PBS, pH 7,2, penicilin 2000 IU/ml, streptomycin mg/ml v fungizone 0,025mg/ml) Ly ming gt ngoi trc tim chng Sau ú, mu i chng dng tớnh nhúm u tiờn tiờm chng 200 àl avian influenza virus HA 10 7,5 Nhúm th hai tiờm chng 200 àl PBS 1x cho i chng õm Nhúm cui cựng tiờm chng 200 àl th bc u ca nng virus Th t nhúm c ly tõm 3000 vũng 30 phỳt mỏy ly tõm lnh (4oC) lng nhng mnh mụ v tt c vi khun, cht lng sch c thu thp, sau ú cht lng c lc bng mng lc (0,45àm) Khi nhúm i chng dng v õm mi th ly 3ml vt liu tiờm chng cho vo ng siờu li tõm, v nhúm cui cựng cho th bc u ca nng virus chia vo 10 phn ging ht - 16 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Cho dung dch pha loóng tip (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) th tc ging nh núi ộn trờn c s dng 4.1.1.2 Mu mụ (c quan phi) 20 mu phi thu thp t t 10 g c chia nh mt mu cho s phõn lp virus Nghin mu mụ mt cỏi ci v chy tit trựng vi thu tinh tỏn t mt pipette tit trựng, to mt th 10% vi mụi trng chuyn c phõn phi buffer bao gm khỏng th 30 ml (PBS ng trng, pH 7,2, penicilin 2000 IU/ml, streptomycin 2mg/ml v fungizone 0,025mg/ml), sau ú chuyn mu ng nht vi mụi trng chuyn vo bờn ng li tõm Khi i chng dng nhúm u tiờm chng 200àl vius cỳm gia cm HA 7,5 Nhúm th hai tiờm chng 200 àl PBS 1x cho mu i chng õm Nhúm cui cựng tiờm chng 200 àl th bc u ca nng virus Th t nhúm c li tõm 3000 vũng 30 phỳt mỏy li tõm lnh (4oC) lng nhng mnh mụ v hu ht vi khun, dch lng sch bờn trờn c thu thp, sau ú dch lng c lc bng mng lc (0,45àm), Sau ú nhúm i chng ly 3ml vt liu tiờm chng vo ng siờu li tõm, nhúm th hai l i chng õm ly 3ml vt liu tiờm chng vo ng siờu li tõm, v nhúm cui cựng cho th bc u ca nng virus chia vo 10 bn ging ht Cho dung dch pha loóng cn (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) tin trỡnh ging nh cp trờn c s dng 4.1.1.3 Vt liu Nhng qu trng g c bit sch vi mm bnh (SPF), 9-11 ngy tui Vt soi trng Ethanol 70% Kim nhn 22 Mỏy o ng tiờm 1ml, 1/1/2 - 17 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Cỏi thoi dựng to l thng trờn qu trng Keo h hoc men trỏm Cht tiờm chng Khay trng 4.1.2 Th tc Soi trng Kho sỏt nhng qu trng vi mt bin phỏp soi trng v t u cựng ca qu trng quay lờn vo bờn nhng cỏi khay trng Loi b nhng trng khụng c th tinh, cú nhng vt nt, phỏt trin khụng y , hoc xut hin l thng S tiờm chng cho nhng qu trng t nhng qu trng vi u cựng ca nú quay lờn vo bờn nhng cỏi khay trng v ỏnh du mi qu trng vi mt s nhn dng c bic ( qu trng cho mt mu bnh phm) Lau sch mt trờn ca nhng qu trng bng ethanol 70% v thc mt l nh vo bờn v xuyờn qua tỳi khớ Ba qu trng cho mi mu bnh phm thng c tiờm chng tỳi niu Hỳt 200àl mu ó c x lý vo bờn mt ng tiờm vaccine vi mt 22 gauge, kiờm tiờm 1/1/2 inch Lng kiờm vo bờn cỏi l ó c to ca qu trng dng mt mỏy õm ngn , tiờm chng 200àl mu x lý chỳng c chun b t ming gt l huyt v phi mi dung dch pha loóng cho s trung virus bờn khoang huyt, 10 mu cho mi nng pha loóng Rỳt kim Tim chng hai qu trng khỏc vi cỏch ging vi ng tiờm ging nhau, kim ging cho ton b trng ó tiờm chng mi mu xột nghim Vt b ng tiờm vo bờn mt vt cha an ton riờng bit Bt kớn nhng cỏi l thng nhng qu trng bng mt git keo - 18 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng dỏng p nhng qu trng nhit 38-39oC v m 60%- 70% thi gian ngy kho sỏt nhng qu trng ó c tiờm chng Trng c tiờm chng c soi n ngy Ghi nhn nhng qu trng b cht v ghi chộp thi gian lm cho phụi cht Nhng qu trng cht ngy u tiờn c quan tõm nh khụng c bit v khụng cn ý n Vt b nhng phụi ny Nhng qu trng cht nhng ngy sau ú thớ cú kh nng tha hng virus cỳm gia cm.( hỡnh 2) HPAI cht 1-2 ngy LPAI cht sau 2-4 ngy Thun li: - Nguyờn tc vng: Phng phỏp c bi WHO, OIE - Chớnh xỏc : chớnh xỏc cao nht - Hu ớch : cho phộp nhng nghiờn cu tip sau Bt li : - Tn thi gian : thng mt hn ngy - 19 - tin c Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng - S an ton phũng thớ nghim : BLS-3 - Cht lng cao hn ca mu - Nhng tỏc nhõn khỏc nờn c loi tr - S nhim chộo S thu hoch ca nhng qu trng g c tiờm chng Nhng qu trng c gi lnh 4oC qua ờm hoc khong gi trc thu hoch Dỏng nhón mt ng plastic (15ml) cho mi qu trng tng ng vi s ghi cho mu bnh phm Lau sch chúp ca mi qu trng bng ethanol 70% Vi kim vụ trựng, lm v lp v bờn trờn tỳi khớ v y mng tỳi niu v mt bờn bng kim Sau ú s dng mt ng tiờm v kim, chc thng tỳi v rỳt kim mt s lng ln dch tỳi cú th chp nhn c t kt qu mt ng tỏch ri, kt hp dch tỳi niu t qu trng c tiờm chng mi mu xột nghim Ly tõm dch thu hoch v thc hin mt xột nghim hemagglutination v 4oC/30 phỳt Xột nghim hemagglutination Vt liu S dng 96 a vi chun tt vi kiu ỏy ch V Multichannel micropipette 5-50 àl.,single micropipette 1-200 àl ng h bm gi Mui phosphate buffer (PBS) pH 7,2 1% t bo mỏu ca g - 20 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng Mu i chng dng v huyt virus bnh Newcastle Phng phỏp Dựng khay dựng mt ln ỏy ch V Phõn phi 50àl dch tỳi niu t mi mu cho vo mt a vi chun tt Dựng mt tip riờng bit cho mi mu K c chng õm v chng dng kim soỏt nhng mu dch tỳi niu trờn mt nhng cỏi a Phõn phi 50àl PBS vo mi a Thờm 25 àl 1% red blood cell vo mi a M nh nhng tm ca a trn t mt v bc lờn trờn a cho a ng 45 phỳt ti phũng nhit kho sỏt v ghi chộp kt qu c kt qu a) Gii thớch kt qu HI õm tớnh: Mt cỏi nỳt nhn ca nhng t bo mỏu mu ti ỏy ca Vbotton well HI dng tớnh: mt hỡnh nh m m ca nhng t bo mỏu , khụng nỳt hoc mt nỳt rt nh ca nhng t bo mỏu ti ỏy ca V-botton well ú s th hin s khỏng ngng kt hng cu v cha ng mt n v khỏng ngng kt hng cu Nu virus gõy bnh Newcastle (NDV) thỡ xột nghim ngng kt hng cu l õm tớnh Sau ú, chng thc bng kiu ph vi xột nghim nhanh trc tip bi vic s dng vet smartđ test b) Xột nghim nhanh bng s dng vet smartđ test B kit xột nghim vet smartđ test qung cỏo trờn th trng Rockeby Avian Influenza Virus Antigen ó c s dng B kớt l mt s phỏt hin khỏng nguyờn ca Avian Influenza (Test Type A) cho vic chn oỏn, Rockeby biomed(Singapore.Pte.Ltd) Phng phỏp xột ny c thit k o lng cht lng ca khỏng nguyờn 200 àl mu c ly t mi ng nghi ng kt qu avian influenza t xột nghim khỏng ngng kt hng cu v gúp phn nh mt mu Ly mt - 21 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng phn chia ca mu (dch tỳi niu) t ng vi ly tõm vi mu gt thu thp chốn ming gt vo ng mu xột nghim cha ng dung dch xột nghim pha loóng Trn ming gt cho n mu c tan ró vo bờn dung dich xột nghim pha loóng mt ng xột nghim cho n nhng mu rng c ng xung ỏy ca ng Thoỏt thit b chn oỏn t tỳi nn, v t nú lờn trờn mt b mt nhn khụ Dựng ng nh git dựng mt ln ó cung cp, gi ni trờn b mt t mu phõn tỏch ng Thờm git vo bờn l thng ca mu bng ng nh git dựng ln (Hỡnh 3) Gii thớch kt qu sau 10 phỳt S gii thớch kt qu C : band i chng c tỡm thy ch band ny nú l kt qu õm tớnh T : Nhúm xột nghim c xột nghim mu Kt qu õm tớnh t xột nghim tỡm thy band C Kt qu dng tớnh t xột nghim tỡm thy c band C v T Xột nghim nhanh trc tip bi s dng vet smartđ test bc trc phỏt hin khỏng nguyờn th ca nghiờn ca thớ nghim mi dch pha loóng ca nng virus Kt qu dng tớnh xột nghim nhanh dựng cú kh nng th hin ghi nhn kt qu ( Cho vic phõn lp virus v phỏt hin virus bng vic s dng nhng qu trng g cú phụi) - 22 - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng C Kt lun - Chn oỏn virus cỳm gia cm bng k thut nuụi cy phụi trng cho kt qu chớnh xỏc nht - Phng phỏp chn oỏn bng k thut nuụi cy phụi trng tn nhiu thi gian - Trong phng phỏp chn oỏn bng k thut nuụi cy phụi trng vic m bo nhng qu trng sch l rt quan trng - khc phc nhng nhc im ca phng phỏp chn oỏn bng k thut nuụi cy phụi trng cn kt hp vi cỏc phng phỏp khỏc nh : sinh hc phõn t, huyt hc, D Ti liu tham kho: www.influenzaReport.com www.adb.org/Documents/Events/2007/HPAI-control-technologyCAREC/Detection-Avian-influe www.vphcap.org www.who.int - 23 - [...]... độ virus Kết quả dương tính trong xét nghiệm nhanh dùng để có khả năng thể hiện ghi nhận kết quả ( Cho việc phân lập virus và phát hiện virus bằng việc sử dụng những quả trứng gà có phôi) - 22 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng C Kết luận - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết quả chính xác nhất - Phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy. .. phôi trứng cho kết quả chính xác nhất - Phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng tốn nhiều thời gian - Trong phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm bảo những quả trứng sạch là rất quan trọng - Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cần kết hợp với các phương pháp khác như : sinh học phân tử, huyết thanh học,…... cái lỗ thủng trong những quả trứng bằng một giọt keo - 18 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng dáng Ấp những quả trứng ở nhiệt độ 38-39oC và độ ẩm 60%- 70% thời gian 5 ngày 3 khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng Trứng được tiêm chủng được soi đến 5 ngày Ghi nhận những quả trứng bị chết và ghi chép thời gian làm cho phôi chết Những quả trứng chết trong ngày đầu tiên... Chẩn đoán vi sinh vật: o Làm RT-PCR để xác định vi rút cúm A/H5 o Phân lập vi khuẩn theo thường quy II Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm 1 Sự thu thập mẫu xét nghiệm - 11 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Những mẫu xét nghiệm nên dược thu thập từ một vài xác xúc vật chết còn tươi và từ những chim bị bệnh của một ßock Theo lý tưởng, sự lấy mẫu đầy đủ được nhìn lại bằng. .. nhất 10 6.0 mảnh nhỏ trong mỗi ml Nếu chỉ tập trung một lượng thấp virus được hiện diện trong chất để tiêm chủng, tuỳ vào hai sự đi qua được đẩy mạnh trong những trứng được thụ tinh có thể - 13 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cần thiết cho một vài giống LPAIV, trong kiểu để sản xuất đủ virus để phát hiện bằng HA Trong trường hợp của HPAIV , một sự đi qua thứ hai sử dụng... pháp phân loại (e.g đặc trưng không thay đổi của phân lập và xác nhận của - 15 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng phương pháp chẩn đoán của một bảng phụ lục) có thể giúp để đối trọng sự bất lợi của hai nguyên lý Những phương pháp thử nghiệm nhanh được thiết kế cho việc phát hiện kháng nguyên của virus trong những vết mô trong phương pháp xét nghiệm kính phết và cryostat section... đạt được sự nhạy cảm của những trứng mái có phôi ( Seo 2001) ii) Một sự tiếp cận nhanh chóng, đặc biệt khi loại trừ sự tiêm nhiễm được đòi hỏi, tận dụng kỷ thuật sinh học phân tử, nó nên theo một kiểu phân tầng: sự hiện diện của RNA đặc biệt của virus cúm được phát hiện thông qua kỹ thuật RT-PCR kỹ thuật này - 14 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng nhằm vào những đoạn của... trong ruột không được bảo quản được thu thập cho việc phân lập virus Mục đích của huyết thanh học, những mẫu máu tự nhiên được lấy Một số mẫu đã thu thập nên phát hiện bằng một khoảng thời gian tin cậy 95% cho một giới hạn với một sự phổ biến 30% 2 Sự vận chuyển mẫu xét nghiệm - 12 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Những mẫu bông thấm, mô và máu nên được giữ lạnh khi vận... của Avian Influenza (Test Type A) cho việc chẩn đoán, Rockeby biomed(Singapore.Pte.Ltd) Phương pháp xét này được thiết kế để đo lường chất lượng của kháng nguyên 200 µl mẫu được lấy từ mỗi ống nghi ngờ kết quả avian influenza từ xét nghiệm kháng ngưng kết hồng cầu và góp phần như một mẫu Lấy một - 21 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng phần chia của mẫu (dịch túi niệu) từ... vẩn bước đầu của nồng độ virus chia vào 10 phần giống hệt nhau - 16 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Cho dung dịch pha loãng tiếp nhau (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9) thủ tục giống như nói đén ở trên được sử dụng 4.1.1.2 Mẫu mô (cơ quan phổi) 20 mẫu phổi thu thập từ từ 10 con gà được chia ra như một mẫu cho sự phân lập virus Nghiền mẫu mô trong ... cấy phôi trứng C Kết luận - Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết xác - Phương pháp chẩn đoán kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng tốn nhiều thời gian - Trong phương pháp chẩn. .. gian - Trong phương pháp chẩn đoán kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm bảo trứng quan trọng - Để khắc phục nhược điểm phương pháp chẩn đoán kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cần kết hợp với phương... 18 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng dáng Ấp trứng nhiệt độ 38-39oC độ ẩm 60%- 70% thời gian ngày khảo sát trứng tiêm chủng Trứng tiêm chủng soi đến ngày Ghi nhận trứng