Khảo sát điều kiện bất hoạt virus cúm a h7n9 trong quy trình sản xuất vắc xin cúm bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG - - LÊ THỊ KIM MẬN KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BẤT HOẠT VI RÚT CÚM A/H7N9 TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM BẰNG CƠNG NGHỆ NI CẤY TRÊN TRỨNG GÀ CĨ PHƠI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Giáo viên hướng dẫn: ThS Dương Hữu Thái ThS Nguyễn Thị Kim Cúc NHA TRANG – 07/2016 LỜI CÁM ƠN Để hồn thành đồ án này, trước hết tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang Ban giám đốc Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Vắc xin sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Bé - Viện trưởng Viện Vắc xin sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC), Ths Dương Hữu Thái - phó Viện trưởng (trưởng phịng Vắc xin Cúm - IVAC) Ths Nguyễn Thị Kim Cúc - giảng viên Viện công nghệ sinh học môi trường (Đại học Nha Trang) tận tình hướng dẫn, động viên suốt thời gian thực đồ án vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn tồn thể anh chị Phịng Vắc xin Cúm - Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang tạo điều kiện tốt cho thực tốt đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người ln quan tâm, giúp đỡ, động viên, đồng thời chỗ dựa tinh thần lớn giúp tơi hồn thành tốt cơng việc giao suốt thời gian học tập thực đồ án vừa qua.cảm ơn cha mẹ, bạn bè tồn thể q thầy Viện Cơng nghệ Sinh học Môi trường dạy dỗ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho suốt thời gian vừa qua Nha Trang, tháng năm 2016 Sinh viên Lê Thị Kim Mận MỤC LỤC Trang LỜI CÁM ƠN i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi rút cúm A/H7N9 1.1.1 Đặc điểm sinh học vi rút cúm A/H7N9 1.1.2 Độc lực sức đề kháng vi rút cúm A/H7N9 1.1.3 Cấu trúc, chức kháng nguyên HA (Haemagglutinin) 1.1.4 Cấu trúc, chức kháng nguyên NA (Neuraminidase) .7 1.1.5 Các phương thức biến đổi kháng nguyên .8 1.1.6 Cơ chế xâm nhiễm vào tế bào vật chủ 10 1.1.7 Khả gây bệnh 11 1.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 người giới Việt Nam 12 1.2.1 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 người giới 12 1.2.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 người Việt Nam 15 1.3 Nghiên cứu sản xuất vắc xin H7N9 ngồi nước 15 1.3.1 Tình hình nghiên cứu vắc xin H7N9 nước 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin H7N9 nước 17 1.4 Công nghệ sản xuất vắc xin Cúm .18 1.4.1 Tổng quan vắc xin cúm 18 1.4.2 Các loại vắc xin cúm 19 1.4.3 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm 22 1.5 Sản xuất vắc xin cúm quy mô lớn Viện vắc xin sinh phẩm y tế (IVAC) 25 1.5.1 Điều kiện sản xuất: 25 1.5.2 Tóm tắt quy trình cơng nghệ .25 1.5.3 Phát triển quy trình cơng nghệ 27 1.5.4 Tiêu chuẩn vắc xin .28 i 1.5.5 Tiêu chuẩn vắc xin cúm 29 1.6 Các hóa chất thường dùng bất hoạt vắc xin cúm 29 1.6.1 Beta - propiolactone (BPL) 29 1.6.2 Formalin (Formaldehyde) 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu .34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu .34 2.1.3 Dung dịch kháng nguyên vi rút 34 2.1.4 Các loại dung dịch, hóa chất .34 2.1.5 Thiết bị - dụng cụ 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Xác định điều kiện tối ưu .36 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 38 2.2.3 Xây dựng quy trình bất hoạt .39 2.2.4 Một số phương pháp kiểm định (Test) .40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Kết khảo sát yếu tố nồng độ formalin, nhiệt độ thời gian quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 lô 47 3.1.1 Kết khảo sát hiệu giá HA 47 3.1.2 Kết khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 48 3.1.3 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt lô (RIV) 52 3.2 Kết khảo sát yếu tố nồng độ formalin, nhiệt độ thời gian quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 lô 54 3.2.1 Kết khảo sát hiệu giá HA lô .54 3.2.2 Kết khảo sát xác định liều gây nhiễm lơ (EID50) nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô 55 3.2.3 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt lô (RIV) 58 3.3 Kết khảo sát yếu tố nồng độ formalin, nhiệt độ thời gian quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 lô 60 3.3.1 Kết khảo sát hiệu giá HA lô .60 ii 3.3.2 Kết khảo sát xác định liều gây nhiễm lơ (EID50) nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô 61 3.3.3 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt lô (RIV) 64 3.4 Xây dựng quy trình bất hoạt .66 3.5 Thẩm định quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 xây dựng .67 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 4.1 KẾT LUẬN 71 4.2 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic Acid EID50 Egg Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50 vi rút trứng gà) GMP Good manufacturing Practice (Thực hành sản xuất tốt) FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương giới) HA Haemagglutinin (Protein ngưng kết hồng cầu) HAU Haemagglutination Unit (Đơn vị Haemagglutinin) HI Haemagglutination Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu) HPAI Highly pathogenic avian influenza (chủng vi rút cúm gia cầm độc lực cao) IVAC Viện Vacxin Sinh phẩm Y tế NA Neuraminidase (enzyme bề mặt vi rút cúm) NIBSC National Insitute for Biological Sandards and Control (Viện Quốc gia tiêu chuẩn kiểm định Sinh học, Vương quốc Anh) OIE Office International Epizoot (Tổ chức Thú y giới) PBS Phosphat Buffer Saline (dung dịch đệm photphat) RNA Ribonucleic Acid RIV Residual Infectious Viruses (vi rút sống tồn lưu) RNP Ribo Nucleo Protein SA Sialic acid TCYTTG Tổ chức Y tế Thế giới TIV Trivalent - inactivated Influenza Vaccine (Vắc xin cúm ba thành phần bất hoạt) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) WSL Working Seed Lot (Chủng làm việc) iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Lấy mẫu thử nghiệm với [formalin] = 0,01% .37 Bảng 2.2 Lấy mẫu thử nghiệm với [formalin] = 0,02% .37 Bảng 2.3 Lấy mẫu thử nghiệm với [formalin] = 0,04% .37 Bảng 2.4 Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu 41 Bảng 2.5 Cách pha loãng mẫu thử nghiệm thành độ pha khác 42 Bảng 2.6 Kết EID50 chủng giống xác định phương pháp ReedMuench 43 Bảng 2.7 Cách tính EID50 liều gây nhiễm 44 Bảng 3.1 Kết khảo sát hiệu giá HA nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô 47 Bảng 3.2 Kết khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 49 nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô 49 Bảng 3.3 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô .53 Bảng 3.4 Kết khảo sát hiệu giá HA nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô 54 Bảng 3.5 Kết khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 55 Bảng 3.6 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô .58 Bảng 3.7 Kết khảo sát hiệu giá HA nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô 60 Bảng 3.8 Kết khảo sát xác định liều gây nhiễm (EID50) 61 Bảng 3.9 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô .64 Bảng 3.10 Kết khảo sát HA, RIV EID50 lô sản xuất thời gian khác quy trình bất hoạt 68 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mơ hình (B), phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) vi rút cúm A Hình 1.2 Sơ đồ minh họa đột biến điểm tượng “lệch kháng nguyên” (antigenic drift) (A) đột biến tái tổ hợp tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) vi rút cúm A (B) Hình 1.3 Cơ chế xâm nhiễm nhân lên vi rút cúm A tế bào 11 Hình 1.4 Phân bố trường hợp mắc bệnh cúm A/H7N9 13 Hình 1.5 Số trường hợp mắc cúm A/H7N9 theo thời gian 14 Hình 1.6 Các hệ vắc xin cúm 20 Hình 1.7 Quy trình lõi sản xuất vắc xin cúm IVAC 26 Hình 1.8 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus cúm A/H7N9 33 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35 Hình 2.2 Sơ đồ xác định điều kiện tối ưu 36 Hình 2.3 Sơ đồ bước tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bất hoạt 38 Hình 3.1 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,01% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 50 Hình 3.2 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,02% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 50 Hình 3.3 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,04% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 50 Hình 3.4 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,01% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 56 Hình 3.5 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,02% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 56 Hình 3.6 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,04% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 56 Hình 3.7 56 Hình 3.7 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,01% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 62 vi Hình 3.8 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,02% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 62 Hình 3.9 Sự biến đổi Log EID50 formalin 0,04% dải nhiệt độ thời gian bất hoạt lô 62 Hình 3.10 Quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 67 Hình 3.11 Hiệu lực bất hoạt vi rút cúm formalin 0,02% 22-250C lô CT_A/H7N9/01 69 Hình 3.12 Hiệu lực bất hoạt vi rút cúm formalin 0,02% 22-250C lô CT_A/H7N9/02 70 Hình 3.13 Hiệu lực bất hoạt vi rút cúm formalin 0,02% 22-250C lô CT_A/H7N9/03 70 vii LỜI MỞ ĐẦU Tháng 3/2013, vi rút cúm A/H7N9 xuất gây bệnh người lan nhiều địa phương Trung Quốc Từ đến nay, số ca mắc tử vong người tiếp tục tăng lên, thời điểm mùa đông xuân (từ tháng đến tháng 4) năm 2013 đến 2015 Thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) cho thấy, đến tháng 3/2015 có 568 trường hợp mắc cúm A/H7N9, có 212 người tử vong TCYTTG nhận định vi rút A/H7N9 “một vi-rút cúm gây nguy hiểm chết người đáng ý nhất” Nguồn gốc vi rút A/H7N9 xác định từ gia cầm gây bệnh cho người, chưa có chứng vi rút lây lan từ người sang người nguy bùng phát dịch khả lan tràn sang quốc gia lớn [33] Việt Nam nước tiếp giáp với Trung Quốc, có trao đổi thương mại, dịch vụ du lịch phát triển, có tương đồng điều kiện địa lý khí hậu Do vậy, Chính phủ, Bộ Y tế Bộ ngành liên quan đánh giá nguy xâm nhập vi rút cúm A/H7N9 vào nước ta lớn Chính Phủ Việt Nam Bộ Y tế chủ động đạo, lập kế hoạch triển khai nhiều biện pháp nhằm phát hiện, ngăn chặn phịng chống bệnh cúm có xuất Việt Nam Vắc xin biện pháp hữu hiệu để phòng ngừa, kiểm sốt đẩy lùi dịch bệnh nói chung bệnh cúm nói riêng Tuy nhiên, việc sản xuất lượng vắc xin đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng tồn giới cịn gặp nhiều khó khăn lực sản xuất quốc gia không đồng thách thức công nghệ Mặc dù vắc xin cúm sản xuất từ thập niên 60 tập trung nước Châu Âu Bắc Mỹ Với lực sản xuất vắc xin giới 300 triệu liều/năm, đại dịch cúm người xảy lượng vắc xin đáp ứng cho khoảng 10% dân số giới Trước tình hình đó, TCYTTG khuyến cáo tất nước, đặc biệt quốc gia Châu Á, chủ động nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 để kịp thời cung ứng cho nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng xảy đại dịch Để giải vấn đề này, nhà sản xuất vắc xin tập trung đầu tư nghiên cứu nhiều dạng vắc xin cúm khác nhau: vắc xin cúm bất hoạt, vắc xin cúm giảm độc lực vắc xin tái tổ hợp [4] Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) nghiên cứu sản xuất thành công vắc xin cúm A/H7N9 bất hoạt trứng gà có phơi quy mơ thí nghiệm Hiện việc mở rộng sản xuất quy mơ lớn, việc tối ưu hóa quy trình bất hoạt Dựa vào bảng 3.8 hình 3.7, 3.8, 3.9 cho thấy kết khảo sát liều gây nhiễm EID50 lơ có tương đồng với kết EID50 lô lô khảo sát trên, nhiệt độ bất hoạt hàm lượng formalin cao liều gây nhiễm EID50 giảm nhanh theo thời gian bất hoạt Cụ thể sau: - Liều gây nhiễm EID50 mốc 0h tất mẫu nhau: log EID50/ml = 8,82 - Sau 6h bất hoạt, liều gây nhiễm EID50 nồng độ formalin khoảng nhiệt độ khảo sát giảm + EID50 giảm nhiều khoảng nhiệt 36-380C: với formalin 0,01% giảm từ 8,825,61 EID50/ml, formalin 0,02% giảm từ 8,825,25 EID50/ml, formalin 0,04% giảm từ 8,824,97 EID50/ml + Liều gây nhiễm EID50 giảm khoảng nhiệt 22-250C: với formalin 0,01% giảm từ 8,826,58 EID50/ml, formalin 0,02% giảm từ 8,826,64 EID50/ml, formalin 0,04% giảm từ 8,826,28 EID50/ml + EID50 giảm khoảng nhiệt 2-80C: : với formalin 0,01% giảm từ 8,827,34 EID50/ml, formalin 0,02% giảm từ 8,827,10 EID50/ml, formalin 0,04% giảm từ 8,827,09 EID50/ml - Sau 12h bất hoạt, EID50 nồng độ formalin dải nhiệt độ tiến hành khảo sát tiếp tục giảm mạnh + 36-380C, log EID50/ml = 1,5 nhóm nồng độ formalin khảo sát, tương tự lô lô 2, tượng dương tính giả, chứng tỏ điều kiện vi rút khơng cịn khả nhân lên dịch niệu trứng gà có phơi Để khẳng định chắn cần thực test RIV + Ở 22-250C, EID50 giảm so với dải nhiệt độ 36-380C: với formalin 0,01% đạt 3,43 EID50/ml, formalin 0,02% đạt 3,39 EID50/ml, formalin 0,04% đạt 3,18 EID50/ml + Liều gây nhiễm EID50 sau 12h bất hoạt giảm 2-80C: với formalin 0,01% đạt 4,25 EID50/ml, formalin 0,02% đạt 3,91 EID50/ml, formalin 0,04% đạt 3,76 EID50/ml - Sau 18h 24h, EID50 khảo sát cho kết tương tự nhau: với formalin 0,01% 2-80C có giá trị log EID50/ml > 1,5; chứng tỏ điều kiện vi rút chưa bất hoạt hoàn toàn, chúng khả nhân lên dịch niệu 63 trứng gà có phơi - mẫu cịn lại 22-250C 36-380C formalin 0,01% tất mẫu dải nhiệt khác formalin 0,02%, formalin 0,04% sau 18h 24h bất hoạt có giá trị log EID50/ml = 1,5 điều kiện chứng tỏ vi rút gần bất hoạt hoàn toàn nên chúng khơng cịn khả nhân lên dịch niệu trứng gà có phơi, để kết luận xác cần tiến hành test RIV Dựa vào kết bảng 3.8 vừa phân tích cho thấy dải nhiệt độ 22-250C vừa nhiệt độ hoạt động thích hợp formalin vừa không ảnh hưởng nhiều tới kháng nguyên vi rút, nên khoảng nhiệt độ nhiệt độ tốt để tiến hành bất hoạt vi rút Kết hoàn toàn tương đồng với kết khảo sát EID50 lô lô 3.3.3 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt lô (RIV) Bảng 3.9 Kết khảo sát hiệu lực bất hoạt nhóm nồng độ formalin, nhiệt độ bất hoạt khoảng thời gian khác lô [formalin] (w/v) Nhiệt độ (0C) Thời gian (giờ) 12h 18h 24h 48h 2-80C + + + Đạt 22-250C + Đạt Đạt Đạt 36-380C Đạt Đạt Đạt Đạt 2-80C + Đạt Đạt Đạt 22-250C + Đạt Đạt Đạt 36-380C Đạt Đạt Đạt Đạt 2-80C + Đạt Đạt Đạt 22-250C + Đạt Đạt Đạt 36-380C Đạt Đạt Đạt Đạt 0,01% 0,02% 0,04% 64 Kết bảng 3.9 cho thấy: - Sau 12h bất hoạt, mẫu dải nhiệt độ 2-80C 22-250C nồng độ formalin khảo sát cho kết phản ứng HA dương tính, chứng tỏ điều kiện vi rút chưa bất hoạt hoàn toàn Riêng mẫu 36-380C nồng độ formalin khảo sát sau 12h bất hoạt cho kết RIV đạt (phản ứng HA âm tính 100%), chứng tỏ điều kiện vi rút bất hoạt hoàn tồn Điều ngồi tác nhân formalin gây bất hoạt nhiệt độ 36-380C cộng với trình khuấy đảo làm cho nhiệt độ tăng cao tác nhân làm bất hoạt vi rút phần nên sau 12h test RIV cho kết đạt - Sau 18h 24h bất hoạt cho kết test RIV giống nhau, mẫu 2-80C formalin 0,01% cho kết test RIV không đạt (phản ứng HA dương tính) Điều nói lên điều kiện vi rút chưa bất hoạt hoàn tồn Do formalin có nồng độ thấp đồng thời 2-80C dải nhiệt độ hoạt động tối ưu formalin dẫn đến trình bất hoạt diễn chậm - mẫu 22-250C 36-380C formalin 0,01% tất mẫu dải nhiệt độ khác formalin 0,02%, formalin 0,04% sau 18h 24h bất hoạt cho kết test RIV đạt (phản ứng HA âm tính 100%), chứng tỏ dịch vi rút bất hoạt hoàn toàn điều kiện - Tiến hành tương tự với mẫu sau 48h bất hoạt cho kết test RIV đạt, vi rút bất hoạt hoàn toàn Từ kết bảng 3.9 cho thấy chúng có tương đồng với kết kiểm tra hiệu lực bất hoạt vi rút cúm (RIV) lô lơ 2, vi rút bất hoạt tất mẫu formalin 0,02% formalin 0,04% sau 18h Đối chiếu với kết kiểm tra hiệu giá HA lô cho thấy HA tương đối cao ổn định sau 18h bất hoạt nên 18h thời gian bất hoạt tối ưu chủng vi rút cúm A/H7N9 Tuy nhiên formalin hóa chất cực độc hại nguy hiểm nên cần ưu tiên sử dụng formalin có nồng độ thấp mà hiệu bất hoạt cao nên formalin 0,02% nồng độ tối ưu 65  Nhận xét: Dựa vào kết kiểm tra HA, RIV, EID50 lô thử nghiệm liên tiếp: lô 1, lô 2, lô cho thấy yếu tố nồng độ formalin có ảnh hưởng vơ lớn đến hiệu trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9, nồng độ formalin cho hiệu suất bất hoạt vi rút khác Ở lô thử nghiệm sử dụng formalin 0,02% formalin 0,04% để bất hoạt cho hiệu tốt, vi rút bị bất hoạt hoàn toàn sau 18h khảo sát Tuy nhiên trình bày trên, formalin loại hóa chất độc hại nguy hiểm, cần chọn nồng độ thấp mà đảm bảo hiệu bất hoạt tốt để ứng dụng vào sản xuất quy mơ cơng nghiệp Do đó, chúng tơi chọn nồng độ formalin 0,02% thời gian bất hoạt sau 18h để nhằm đạt hiệu bất hoạt tốt nhất, hiệu giá HA cao ổn định để hàm lượng formalin tồn dư sau bất hoạt thấp Theo khuyến cáo WHO nồng độ formalin 0,02% không vượt nồng độ cho phép hóa chất bất hoạt (nồng độ theo thể tích khơng vượt 0,1% lúc trình bất hoạt) hàm lượng formalin tồn dư bán thành phẩm không vượt 0,02% Dựa vào kết khảo sát EID50 lô, thấy dải nhiệt độ 22-250C vừa nhiệt độ hoạt động thích hợp formalin vừa khơng ảnh hưởng nhiều tới kháng nguyên vi rút, nên khoảng nhiệt độ nhiệt độ tốt để tiến hành bất hoạt vi rút Như vậy, từ việc phân tích kết khảo sát HA, EID50, RIV lô liên tiếp, nhận thấy nồng độ formalin 0,02%, nhiệt độ bất hoạt 22-250C thời gian bất hoạt 18 điều kiện thích hợp để bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 Ở nồng độ, nhiệt độ thời gian bất hoạt hiệu giá HA tương đối cao ổn định, liều gây nhiễm trứng gà có phơi cho kết log EID50/ml ≤1,5 hiệu lực bất hoạt đạt, đồng thời điều kiện phù hợp với khuyến cáo WHO nồng độ, nhiệt độ thời gian bất hoạt vi rút, thuận tiện cho thực hành, hồn tồn ứng dụng vào sản xuất quy mơ cơng nghiệp 3.4 Xây dựng quy trình bất hoạt Các thơng số thích hợp cho q trình bất hoạt vi rút khảo sát (nhiệt độ bất hoạt 22-250C, thời gian bất hoạt 18 giờ, nồng độ formalin 0,02%) sử dụng để xây dựng quy trình bất hoạt cho vi rút cúm A/H7N9 66 Quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9: Dịch vi rút Pha loãng với PBS Khuấy từ Bất hoạt formalin 0,02% 22-250C Khuấy từ Lọc sau bất hoạt (5µm) Tráng lọc PBS chứa formalin 0,02% Ủ nhiệt độ phòng 18h Khuấy từ Ủ lạnh 2-80C/72-96h Hình 3.10 Quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 3.5 Thẩm định quy trình bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 xây dựng Để đưa quy trình bất hoạt vào sản xuất, quy trình cần đảm bảo tính ổn định, hiệu an tồn Để khảo sát tính ổn định hiệu quy trình bất hoạt, tiến hành kiểm tra HA, EID50 RIV khoảng thời gian khác quy trình bất hoạt Tiến hành thẩm định lô liên tiếp Tham khảo tài liệu thẩm định quy trình bất hoạt vi rút cúm phịng Vắc xin cúm, chúng tơi tiến hành lấy mẫu bất hoạt với formalin 0,02% 22-250C kiểm tra sau khoảng thời gian: sau siêu ly tâm (Sau SLT), sau pha loãng (Sau PL), 1h, 6h, 12h, 18h, 48h, 60h, 72h, 96h Mỗi mẫu lấy 2,97ml, riêng mẫu từ sau 1h  96h trung hòa formalin natri bisulfite 1/8 (mẫu T1  T8) (N/A: khơng tiến hành thí nghiệm) - Thử nghiệm EID50 mẫu Tz, T0, T1, T2, T3, T4 Các mẫu thử nghiệm EID50 pha loãng theo nồng độ sau: mẫu Tz (10 10-12), mẫu T0 (10-710-11), mẫu T1 (10-610-10), mẫu T2 (10-510-9), mẫu T3 (10010-4), mẫu T4 (10010-4) 67 - Thử nghiệm RIV mẫu T4, T5, T6, T7, T8 - Thử nghiệm HA tất mẫu từ Tz  T8 Bảng 3.10 Kết khảo sát HA, RIV EID50 lô sản xuất thời gian khác quy trình bất hoạt Lơ thẩm định Lô CT_A/H7N9/01 Lô CT_A/H7N9/02 Lô CT_A/H7N9/03 Mẫu thử Thời gian Log EID50/ml RIV Mẫu số Tz Mẫu số T0 Sau SLT Sau PL 10,58 10,38 N/A N/A HA (HAU/ml) 25.600 12.800 Mẫu số T1 Mẫu số T2 1h 6h 9,25 7,4 N/A N/A 6.400 6.400 Mẫu số T3 Mẫu số T4 12h 18h 2,86 1,5 N/A Đạt 6.400 6.400 Mẫu số T5 Mẫu số T6 Mẫu số T7 48h 60h 72h N/A N/A N/A Đạt Đạt Đạt 6.400 6.400 6.400 Mẫu số T8 Mẫu số Tz Mẫu số T0 96h Sau SLT Sau PL N/A 10,50 9,63 Đạt N/A N/A 6.400 6.400 3.200 Mẫu số T1 Mẫu số T2 1h 6h 9,32 6,75 N/A N/A 1.600 1.600 Mẫu số T3 Mẫu số T4 12h 18h 3,58