TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS (ADV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO Aujeszky’s disease virus (ADV) gây ra những thiệt hại to lớn về kinh tế đồi với ngành chăn nuôi...
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************* Bài tiểu luận CHẨN ĐOÁN AUJESZKY’S DISEASE VIRUS (ADV) BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY TẾ BÀO Mơn học: Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm GVHD: TS Nguyễn Ngọc Hải SVTH: Vũ Thị Phương Thảo Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 2 Mục lục I Đặt vấn đề II Tổng quan II.1 Virus Aujeszky II.1.a Tình hình II.1.b Đặc tính, phân loại II.1.c Hình thái cấu trúc ADV II.1.d Sức đề kháng ADV II.1.e Dịch tễ học Các loài vật mẫn cảm với ADV Đường lây nhiễm II.1.f Triêu chứng lâm sàng II.1.g Bệnh tích 11 II.2 Phân lập ADV môi trường tế bào 11 II.2.a Chuẩn bị mẫu 12 II.2.b Chuẩn bị môi trường tế bào 14 II.2.c Chẩn đoán ADV Shell Vial Assay 15 II.2.d Chẩn đoán ADV 24-Well Plate Cell Culture Assay 15 II.2.e Thí nghiệm Rafique A Tahir, Sagar M Goyal 17 III Kết luận 18 IV Tài liệu tham khảo 18 3 I Đặt vấn đề Aujeszky’s disease virus (ADV) gây thiệt hại to lớn kinh tế đồi với ngành chăn nuôi heo làm tăng tỉ lệ chết gây rối loạn sinh sản heo (Pensaert and Kluge, 1989) Vì cần có phương pháp chẩn đốn nhanh vấy nhiễm ADV bầy đàn để kiểm soát cách hiệu lây nhiễm bênh cách cách ly loại bỏ đàn gia súc nhiễm nhằm làm giảm thiệt hại kinh tế mà ADV gây Nhiều phương pháp sử dụng để chẩn đoán vấy nhiễm ADV, bao gồm phân lập virus phương pháp nuôi cấy tế bào, phương pháp miễn dịch peroxidase, phương pháp miễn dịch huỳnh quang, dot-blot, PCR Mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm riêng so sánh mặt độ nhậy, độ đặc hiệu, dễ phát hiện, chi phí tốc độ Trong năm gần đây, phân lập virus shell vial assay (SVA) kết hợp với kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang hay miễn dịch peroxidase sử dụng để phát cytomegaloviruses, herpes simplex virus, respiratory virus Kĩ thuật SVA nhanh, nhậy phương pháp đặc biệt chẩn đoán loại virus (b) II Tổng quan 1) Virus Ạujeszky a) Tình hình A Aujeszky phát bệnh vào năm 1902 Hungary bị chó, đặt tên bệnh “giả dại” phần lớn lồi động vật mắc bệnh có triệu chứng ngứa ngáy tự cắn xé Lợn mắc bệnh khơng có triệu chứng riêng lợn kí chủ tự nhiên virus Các động vật mắc bệnh có độ mẫn cảm cao, tỉ lệ chết lên tới 100% 4 Ở nước ta, bệnh có từ chưa rõ, từ năm 1975 đến bệnh có khắp tỉnh phía Nam nhiều tỉnh phía Bắc (a) Phân bố • AJD xuất hầu hết quốc gia Châu Âu, Mỹ, Mexico, Cuba, Brazil, Venezuela, Nhật Bản, Đài Loan, Đơng Nam Á • Trong năm gần bệnh gia tăng tỷ lệ nhiễm bệnh trở nên nghiêm trọng vùng có nơng trai chăn ni heo tập trung • Ở Thái Bình Dương, AJD xảy New Caledonia tới năm 1984, Newzealand Polynesia thuộc Pháp (bằng chứng huyết học) tới năm 1999, biết xảy Samoa, Tonga, Vanuatu, Wallis, Futuna đàn lợn hoang dã Papua New Guinea Chưa có báo cáo từ Úc (http://spc.int/rahs/manual/Multiple_Species/AUJESZKYSE.H TM) b) Đặc tính, phân loại Herpesvirus loại virus có lượng DNA lớn chu kì sinh sản xảy nhân tế bào Họ Herpesviridae chia làm họ phụ: • Alphaherpesvirinae • Betaherpesvirinae • Gammaherpesvirinae (i) Aujeszky’s disease (AJD), cịn gọi bệnh giả dại (pseudorabies), bệnh porcine herpesvirus-1 [Aujeszky’s disease virus (ADV), pseudorabies virus (PRV)] gây Virus thuộc Herpesviridae, giống Alphaherpesvirinae 5 ADV nhiễm vào hệ thống thần kinh trung ương quan khác, ví dụ quan hơ hấp, nhiễm vào nhiều loại động vật có vú ngoại trừ người lồi khỉ khơng Kí chủ tự nhiên ADV heo, nguồn lây nhiễm tiềm tàng (ngoại trừ heo tuần tuổi bị chết viêm não) (g) c) Hình thái cấu trúc ADV Cấu trúc tổng quát ADV cho thấy hình • Phần lõi bao gồm sợi đôi DNA dài khoảng 150 kbp bao bọc capsid, vỏ (tegument) vỏ bọc (envelope) • Bộ gen ADV bao gồm vùng đơn vị (two unique regions), đơn vị dài (unique long UL), đơn (unique vị ngắn shot US), cặp sườn trình tự lặp lại, bên (an internal one-IRS), phía cuối (a terminal one-TRS) Cả gen Klupp ctv giải trình tự • Những gen khác gen alphaherpesvirus định kí tự US hay UL phụ thuộc vào vị trí đơn vị dài UL hay đơn vị ngắn US theo sau số, số vị trí gen vùng đặc biệt • Vỏ capsid ADV đóng gói bảo vệ gen Nó bao gồm 162 capsomers, 150 hexon (1 hexon có phân tử VP5 protein biểu UL19 (pUL19) phân tử VP26 (pUL35) 12 penton (11 penton bao gồm phân tử VP5, penton 12 6 phân tử pUL6 hình thành lỗ xâm nhập hình trụ cho DNA sản xuất (newly produced dsDNA), hai liên kết cấu trúc (1 phân tử VP19C (pUL38) hai phân tử VP23 (pUL18) tất xắp xếp hàng rào 20 mặt • Khoảng trống vỏ capsid vỏ envelope lắp đầy với protein tegument Protein tegument quan trọng trình xâm nhập nhân lên virus, xâm nhập màng bao bọc màng nhân màng thể golgi • Vỏ envelope virus màng phospholipids lớp bao gồm 10 glycoprotein (gB, gC, gD, gE, gH, gI, gK, gL, gM, gN) Vỏ envelope đóng vai trị quan trọng việc gắn kết, xâm nhập, đóng gói, ngồi Lan truyền tế bào, đáp ứng miễn dịch tế bào chủ (f) d) Sức đề kháng ADV Khả sống môi trường ADV thấp ADV sống thời gian ngắn mơi trường lạnh, ẩm với pH từ đến Môi trường có ánh nắng khơ giết virus (c) 7 Phần lớn chất sát trùng, tiêu độc tiêu diệt virus dung dịch NaOH 1%, giờ, formal 3% giờ, nhiệt độ 60oC virus bị diệt sau Virus xác chết thối rữa bị diệt sau 10 ngày, thịt ướp sau 20 ngày Trong nước tiểu lợn bệnh, virus sống tuần, chất độn chuồng virus bị bất hoạt vòng 8-15 ngày Các chất hóa học có hợp chất Clo thuốc sát trùng có hiệu nước vơi đặc, chế phẩm Clorua vơi hịa tan nước (a) e) Dịch tễ học Các loài vật mẫn cảm với ADV • Heo kí chủ ADV, nguồn lây nhiễm cho phổ rộng kí chủ thứ hai bị, cừu, chó, mèo, chuột lồi gặm nhấm • Ngựa, chim, người có khả kháng ADV (c) Đường lây nhiễm • ADV tồn dạng tiềm tàng suốt thời gian sống heo bị nhiễm bệnh khỏi Sự lây lan bệnh trực tiếp tiếp xúc heo khỏe heo bệnh mang trùng, qua khơng khí, lây lan gián tiếp qua chất độn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, người chăm sóc… • Dây thần kinh sinh (trigeminal ganglia), bầu khứu giác (olfactory bulbs), hành tủy (medulla), cuống não (brain stem), 8 phổi (lungs), hạch bạch huyết (lymph nodes), tủy sống (spinal cord) loại mô chứa virus • Vào thời điểm stress sinh đẻ, virus hoạt động trở lại lây lan Những heo có biểu bệnh tích nhẹ • Khi ADV diện đàn, tiềm tàng hoạt động trở lại cuả virus quan trọng nghiên cứu lan truyền virus nơng trại nhóm heo với • Sự lan truyền ADV xảy nhiều đường khác nhau, bao gồm: AJD dễ lây, chủ yếu lây lan qua đường hô hấp Sự lây nhiễm đàn nhanh chậm đàn Chất tiết từ đường miệng đường mũi, nước tiểu nguồn bệnh tiềm tàng virus tiếp xúc trực tiếp đàn lợn nhiễm không bị nhiễm đường truyền bệnh quan trọng Qua chất tiết từ tinh dịch hay âm đạo giao hợp Qua sữa hay sữa non thú mẹ truyền qua thú con, ngồi virus xâm nhập qua thai, truyền dọc từ hệ sang hệ khác Qua vật dụng dùng thú y bị nhiễm (ví dụ kim tiêm, ống tiêm) 9 Virus tồn thịt heo đến tuần Những chó ăn thịt heo nhiễm bị nhiễm chết Tỷ lệ nhiễm đường ăn thịt heo bị nhiễm cao đường hơ hấp Lan truyền nhờ gió từ nơng trại đến nơng trại khác xảy điều kiện thích hợp (báo cáo Anh tới km) Virus tồn nhiều tuần vũng nước đọng, cỏ, ổ rơm Vì thế, mơi trường truyền nhiễm từ bầy đàn sang bầy đàn khác cần phải quản lý, đặc biệt nơi rác thải không thu gom xử lý Vai trị trùng điều tra, lồi gặm nhấm đóng vai trò nguồn nhiễm Vai trò lợn hoang dã khu vực Thái Bình Dương nguồn nhiễm thật bùng nổ (a, http://spc.int/rahs/manual/Multiple_Species/AUJESZKYSE.HTM) f) Triêu chứng lâm sàng Ở heo, ADV thường lan nhanh bầy đàn nhiễm Triệu chứng lâm sàng lợn thường biểu khác tùy theo lưa tuổi • Heo nhỏ tuần tuổi: diễn biến lâm sàng tiến triển nhanh, tỷ lệ chết cao có tới 100% Sốt cao 41oC, ủ rũ, 10 lơng dựng đứng, da tím tái, lợn gầy sút nhanh, có triệu chứng thần kinh, run rẩy, lảo đảo, vịng quanh, sau xuất co giật, đạp chân khơng khí động tác đặc trưng bệnh, kiệt sức, tử vong vài Có thể thấy heo nơn mữa, chảy nhiều dãi, đơi có lỏng • Những heo lớn có biểu hiện: sốt, suy nhược, trầm cảm, nơn, khó thở, xuất bệnh tích từ hệ thần kinh trung ương, dáng theo kiểu ngỗng, thờ thẫn, co cơ, mắt giật , tê liệt Tỉ lệ chết 20-100% • Heo cai sữa có biểu giống với triệu chứng đường hô hấp (ho, xì, thở nặng nhọc, viêm kết mạc) dễ thấy Tỷ lệ tử vong 5-10% • Những heo nái heo đực giống: thường không quan sát thấy triệu chứng thần kinh, vật ủ rũ, sốt cao, ho, thở khó kéo dài 5-10 ngày, lợn bị gầy sút nhanh chóng, tỷ lệ chết thấp Ở nái mang thai có biểu rối loạn sinh sản sẩy thai, thai yếu, thai chết lưu bụng phần lớn thai chết, thai sẩy có bệnh tích điển hình tượng hoại tử gan, lách, tuyến thượng thận, hạch lâm ba ruột Neurological disorders in piglets 11 (Photos Copyright FAO 1997) Ở bò chủ yếu biểu thể: • Thể kích thích: đặc trưng ngứa nhiều vùng hay nhiều vùng vùng da đầu, ngực, đùi • Thể bại liệt: vật suy nhược, chướng bụng, táo bón, bại liệt, chảy nhiều dãi, có trường hợp bị liệt bụng Ở chó mèo: • Ở mèo, triệu chứng rối loạn vận động, vật bồn chồn, kêu nhiều, tiếng kêu khan khan, sau run rẩy, liệt tồn thân chết nhanh • Ở chó biểu ngứa nhiều mõm, liệt họng • Ở lồi khác thường vùng bị thương bị phù,sung huyết tủy sống (a,http://spc.int/rahs/manual/Multiple_Species/AUJESZKYSE HTM) g) Bệnh tích White to yellow necrotic foci on spleen (pig) (Photos Copyright FAO 1997) Bệnh giả dại có bệnh tích đặc trưng • Có điểm hoại tử trắng gan, lách • Phổi xung huyết, phù 12 • Thùy tim thùy đỉnh có vết viêm màu đỏ sẫm • Hiện tượng phù nề vách ngăn thùy phổ biến (a, http://spc.int/rahs/manual/Multiple_Species/AUJESZKYSE.HT M) 2) Phân lập virus môi trường tế bào Cách xác định vấy nhiễm PRV thường dựa phân lập virus môi trường tế bào với xác định kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Quy trình thực vòng từ 2-5 ngày, dựa thời gian xuất cytopathic effects (bệnh tích tế bào-CPE) PRV nuôi cấy phổ rộng loại tế bào tế bào phổi thỏ (rabbit lung-ZP), tế bào thận thỏ (rabbit kidneyRK13), tế bào thận chuột Hamster (Hamster kidney-BHK21), tế bào thận heo (porcine kidney-PK15), tế bào thận khỉ xanh (green monkey kidney-GMK), tế bào phổi chồn Vizon (mink lung-MK), tế bào thận chồn furo (ferret kidney-FK), tế bào phôi bào thai cừu (ovine fetal lung-OFL), (bovine turbinate-BT), tế bào thận phổi gà tây (turkey embryo kidney-TEK7,13,17,21) Tuy nhiên dòng tế bào BT, PK15 sử dụng rộng rãi để phân lập chẩn đoán PRV (b) a) Chuẩn bị mẫu Những mẫu vật sử dụng để chẩn đoán ADV bao gồm tủy sống, phổi, lách, gan, thận, hạch bạch huyết, niêm mạc họng, amidam lấy từ 13 heo nghi ngờ nhiễm ADV Lấy mẫu thí nghiệm heo • Mẫu máu: lấy tĩnh mạch cổ hay tĩnh mạch tai xylanh tự động • Dịch mũi: vật có biểu rối loạn hơ hấp (khó thở, khị khè…) lấy tăm bơng ngốy vào hốc mũi Thời gian lấy mẫu • Khi vật biểu triệu chứng lâm sàng, lấy mẫu lỗ tự nhiên • Khi vật chết (mới chết vịng giờ) mổ ra, biều bệnh tích đâu lấy mẫu (đường hơ hấp, tiêu hóa, thần kinh) Những điều cần lưu ý lấy mẫu: • Lấy máu tĩnh mạch cổ cần lượng máu nhiều • Lấy máu tĩnh mạch tai khơng cần nhiều máu • Đối với nái mang thai nên lấy giai đoạn heo sinh 2-3 ngày • Khi lấy mẫu cần có dụng cụ cố định vật, đeo găng tay • Khi lấy mẫu tăm để tăm ống nghiệm vô trùng cho vào lọ chứa dung dịch chuyên chở bẻ đoạn que nơi tay cầm 14 • Khi lấy mẫu máu ta nên cho chất kháng đơng vào Có loại chất kháng đơng: EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate), Heparin, Sodium Citrate, EDTA thường sử dụng gây ảnh hưởng đến tế bào máu • Cách lấy mẫu mơ: lấy nửa phần mơ có bệnh tích, nửa phần giáp bệnh tích Cách bảo quản mẫu: • Mẫu để bình, túi • Dùng bình đá mẫu chuyển phịng thí nghiệm khoảng cách gần • Dùng đá khô bảo quản tối đa ngày đá khơ chảy nước ảnh hưởng đến bệnh phẩm Mẫu giữ -70oC glycerol 50% Cách xử lý mẫu: lấy mẫu cho tạo huyễn dịch 10-20% • Lấy tỷ lệ mẫu HBSS (Hanks’ balanced salt solution) phần mẫu, phần HBSS, mẫu đồng HBSS thành huyễn dịch 10% máy Laboratory Tissue Pulverizer Sau ly tâm 1000 vòng/phút 4oC 30 phút để loại bỏ mãnh vỡ mô Dịch bên gạn dự trữ 70oC Hoặc ta nghiền tay • Mẫu mơ để góc cối gần chỗ miệng lấy Nếu mẫu mềm nghiền trực tiếp Nếu mẫu cứng nghền thủy tinh nhuyễn để tách tế bào đơn 15 • Lấy phần HBSS cho vào nghiền tiếp, nghiền xong cho vào ống nghiệm • Sau cho mẫu vào tủ lạnh đem thực 1-2 lần để tế bào vỡ ta thu hoạch virus • Sau lọc lấy nước (ly tâm) cho vào lọ khác có nắp, cho kháng sinh vào (penicillin, streptomicine) để 30’-1h, sau lọc qua màng lọc 0.2 um đưa vào môi trường tế bào • Mẫu huyết cho qua lọc 0.2 um đưa vào môi trường tế bào b) Chuẩn bị môi trường tế bào Cả hai loại tế bào PK-15 BT phát triển môi trường tối thiểu Eagle với muối, 8% huyết thai bò, penicillin (100 đơn vị/ml), streptomicine sulfate (100 ug/ml), fungizone (1 ml), gentmicine (50 ug/ml) Mỗi giếng đĩa 24 giếng cho vào ml dịch huyền phù tế bào chứa 1.5x105 tế bào phủ đường kính 12 mm đặt vào shell vials (1-dram ca 3.7 ml shell vials) sau cho vào 1ml dịch huyền phù tế bào chứa 1.0x105 tế bào Để dễ thao tác, shell vials đặt vào giếng đĩa 24 giếng rỗng sau phủ lên đĩa 24 giếng khác Đem ủ 37oC có 5% CO2 thường ngày (b) c) Chẩn đoán ADV Shell Vial Assay (SVA) Các shell vial chứa tế bào BT hay PK15 cho vào 0.2 ml mẫu chuẩn bị Sau đem ly tâm với tốc độ 700 vòng/ phút 60 phút nhiệt độ 30oC Sau shell vial rửa với HBSS thêm vào 0.5 ml MEM chứa 4% huyết thai ngựa (fetal horse serum-FHS) Thêm vào 16 vial chứa mẫu không nhiễm (mock-infect cell) vào để làm đối chứng âm Các shell vial sau ủ 37oC khơng khí có 5% CO2 quan sát bệnh tích đặc trưng khoảng cách thời gian đồng hồ Sau xuất CPE, tế bào lớp shell vial trộn trực tiếp với kháng thể nhuộm huỳnh quang Sau phủ nhẹ nhàng loại cách sử dụng kẹp Các phủ hơ khơ, để rìa slide kính, kiểm tra huỳnh quang (b) d) Chẩn đoán ADV 24-Well Plate Cell Culture Assay Các giếng chứa tế bào lớp PK15 hay BT cho vào 0.5 ml mẫu ủ 37oC để virus hấp thụ Sau rửa với HBSS, 1.5 ml môi trường tối thiểu chứa 4% huyết ngựa chữa cho vào đem ủ 37oC khơng khí có 5% CO2 Thêm vào vial chứa mẫu không nhiễm (mock-infect cell) vào để làm đối chứng âm Đĩa dược quan sát dựa tiêu xuất bệnh tích tế bào ngày ngày Những giếng có xuất bệnh tích xử lý với kháng thể gắn huỳnh quang Môi trường nuôi cấy loại bỏ tế bào lớp bị nhiễm rửa với phosphate buffer saline (PBS), pH 7.2 Tế bào vét với vài giọt PBS pipet chuyển, huyền phù tế bào cho vào giếng có vịng đen (black-ringed well) đường kính mm slide kính nhiều giếng (multiwell glass slide) Slide kính sấy khơ hồn tồn sau trộn với acetone 10 phút 17 giọt dung dịch pha loãng 80 lần kháng thể IgG đánh dấu huỳnh quang ADV cho vào giếng, slide kính đem ủ 37oC 30 phút hộp ẩm (moist champer) Sau rửa với PBS (pH 8.5) phút, tế bào nhuộm thêm với dung dịch Evan’s blue phút rửa giọt nước, sấy khô Một phủ đưa vào slide kính sau cho vào giọt dung dịch gồm 50% glycerin 50% PBS, pH 7.2 vào giếng Slide kính quan sát kính hiển vi huỳng quang (b) PRV infected cells-CPE (h) e) Thử nghiệm Rafique A Tahir, Sagar M Goyal ông thử nghiệm với 244 mẫu phịng thí nghiệm chẩn đốn thú y Minnesota cung cấp Mẫu lấy từ heo nghi ngờ nhiễm bao gồm não, amidant, phổi Thử nghiệm thực phương pháp SVA 24-well plate cell culture Kết đạt được: • Trong 244 mẫu xác định, 118 (48.4%) mẫu xác định dương tính với phương pháp 24-well plate cell culture, 121 (49.2%) xác định dương tính với SVA • Trong 118 mẫu dương tính với phương pháp 24-well plate cell culture có 113 (95,8%) mẫu dương tính dịng tế bào BT, 117 (99,2%) mẫu dương tính dịng tế bào PK15 18 • Trong 121 mẫu dương tính với SVA có 113 (93,4%) mẫu dương tính dịng tế bào BT, 121 (100%) mẫu dương tính dịng tế bào PK15 • 24 sau cấy mẫu vào, 91 (75.2%) mẫu có bệnh tích dương tính SVA, trái lại có 15 (12.7%) mẫu dương tính phương pháp 24-well plate cell culture (b) III Kết luận Từ kết thí nghiệm Rafique A Tahir, Sagar M Goyal ta thấy phương pháp SVA nhạy nhanh so với phương pháp 24-well plate cell culture Cũng tế bào PK15 nhạy tế bào BT việc phát ADV (b) IV Tài liệu tham khảo 1) Tiếng việt (a) Tủ sách khuyến nông phục vụ người lao động-NXB lao động: Những điều cần biết số bệnh virus, trang 14-18 2) Tiếng anh (b) Rafique A Tahir, Sagar M Goyal: 1995, Rapid detection of pseudorabies virus by the shell vial technique J Vet Diagn Invest 7: 173-176 19 (c) United States Deparment of Agriculture Animal and Plant Health Inspection Service Veterinary Services- Center for Epidemiology and Animal HealthNational Surveillance Unit Fort Collins, CO: National Pseudorabies Surveillance Plan Final Draft (d) United States Department of Agriculter- Animal and Plant Health Inspection Service Technical Bulletin No 1923: Pseudorabies (Aujeszky’s Disease) and its Eradication (e) Carlos H Romero, Paul N.Meade ctv- Journal of Wildlife Disease, 37 (2), 2001, pp 289-296: Venereal Transmission of Pseudorabies Viruses Indigenous to Feral Swine (f) Hans Nauwynck, Sarah Glrieux ctv, 2006- review article: Cell biological and molecular characteristics of Pseudorabies virus infections in cell cultures and in pigs with emphasis on the respiratory tract, page 230-234 (g) OIE Terrestrial manual 2008- chapter 2-1-2- Aujeszky’s disease, page 145 (h) A Tatsanakit, A Rungsipipat ctv: In vitro efficacy of an organic disinfectant citrex on selected swine viruses (i) Harald Granzow, Frank Weiland ctv- Journal of virology, Mar 1997, page 2072-2082: Ultrastructural analysis of the replication cycle of Pseudorabies virus in cell culture 3) Trang web http://spc.int/rahs/manual/Multiple_Species/AUJESZKYSE.HTM ... (bệnh tích tế bào- CPE) PRV ni cấy phổ rộng loại tế bào tế bào phổi thỏ (rabbit lung-ZP), tế bào thận thỏ (rabbit kidneyRK13), tế bào thận chuột Hamster (Hamster kidney-BHK21), tế bào thận heo... heo (porcine kidney-PK15), tế bào thận khỉ xanh (green monkey kidney-GMK), tế bào phổi chồn Vizon (mink lung-MK), tế bào thận chồn furo (ferret kidney-FK), tế bào phôi bào thai cừu (ovine fetal... II.2 Phân lập ADV môi trường tế bào 11 II.2.a Chuẩn bị mẫu 12 II.2.b Chuẩn bị môi trường tế bào 14 II.2.c Chẩn đoán ADV Shell Vial Assay 15 II.2.d Chẩn đoán ADV 24-Well Plate Cell