Khảo sát cấu tạo giải phẫu và sự phân bố túi tinh dầu của cây tràm (melaleuca cajuputii powell) ở giai đoạn trưởng thành

KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SƯ PHẠM SINH HỌC KHẢO SÁT CẤU TẠO GIẢI PHẪU VÀ SỰ PHÂN BỐ TÚI TINH DẦU CỦA CÂY TRÀM Melaleuca cajuputii Powell Ở GIAI ĐOẠN TRƯỞNG THÀNH TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU Đ

KHOA SƯ PHẠM

BỘ MÔN SƯ PHẠM SINH HỌC

KHẢO SÁT CẤU TẠO GIẢI PHẪU VÀ SỰ PHÂN BỐ TÚI

TINH DẦU CỦA CÂY TRÀM (Melaleuca cajuputii Powell)

Ở GIAI ĐOẠN TRƯỞNG THÀNH TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG SINH HỌC HÒA AN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành SƯ PHẠM SINH – KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP

Lớp: Sư phạm Sinh – KTNN 33

MSSV:3072347 NGUYỄN THỊ YẾN NHI

NĂM 2011

CẢM TẠ

Lời đầu tiên chúng em xin chân thành cảm ơn cô Phùng Thị Hằng, người đã

trực tiếp hướng dẫn chúng em hoàn thành luận văn này Cô đã giúp đỡ tận tình chúng em, chỉ bảo cho chúng em không chỉ là kiến thức mà còn là kĩ năng giao tiếp

và cách làm việc khoa học

Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Bích Thủy, thầy Nguyễn

Trọng Hồng Phúc, thầy Nguyễn Thanh Tùng và các thầy cô trong bộ môn Sư phạm

sinh học – Khoa Sư phạm đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ cho chúng em trong suốt thời gian chúng em thực hiện luận văn

Chúng em xin chân thành cảm ơn thầy Ngô Thanh Bình va anh Huỳnh Văn

Nghiêm ở Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm đa dạng sinh học Hòa An đã tạo điều

kiện thuận lợi cho chúng em thực nghiệm và thu mẫu tại trung tâm

Và cuối cùng, chúng tôi xin gởi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè, những người đã

hỗ trợ chúng tôi trong quá trình chúng tôi hoàn thiện luận văn này

Sau 8 tháng thực hiện đề tài, chúng tôi đã khảo sát được cấu tạo giải phẫu của cành, lá, rễ của cây Tràm, xác định được vị trí, sự phân bố và mật độ của tinh dầu Tràm Mật độ túi tinh dầu nhiều nhất ở lá non, tiếp đó là lá bánh tẻ và ít nhất

ở lá già Mật độ túi tinh dầu có sự biến động theo mùa

MỤC LỤC

CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH SƠ ĐỒ vii

TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

1 Sơ lược về cây Tràm và tinh dầu Tràm 3

1.1 Cây Tràm 3

1.1.1 Tên gọi 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây Tràm 3

1.2 Tinh dầu Tràm 4

1.2.1 Công dụng của tinh dầu Tràm 4

1.2.2 Những vấn đề nghiên cứu về tinh dầu Tràm 5

2 Đặc điểm vùng nghiên cứu 7

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 10

1 Đối tượng, địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 10

1.1 Đối tượng 10

1.2 Địa điểm 10

1.3 Thời gian thực hiện đề tài 12

2 Phương tiện 12

2.1 Vật tư và thiết bị 12

2.2 Hóa chất 12

3 Phương pháp 13

3.1 Thu mẫu và xử lí mẫu 13

3.1.1 Thời gian thu mẫu 13

3.1.2 Phương pháp thu mẫu 13

3.1.3 Phương pháp xử lí mẫu 14

3.2 Quan sát cấu tạo giải phẫu 15

3.2.1 Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời 15

3.2.2 Lên mẫu, đếm số lượng túi tinh dầu và chụp hình 18

3.3 Phương pháp xác định mật độ 19

3.4 Phương pháp ly trích, xác định hàm lượng tinh dầu 20

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

1 Đặc điểm giải phẫu 21

1.1 Cấu tạo giải phẫu của lá 21

1.1.1 Cấu tạo giải phẫu của cuống lá 21

1.1.2 Cấu tạo giải phẫu của phiến lá 22

1.2 Cấu tạo giải phẫu của cành 23

1.3 Cấu tạo giải phẫu của rễ 24

2 Vị trí túi tinh dầu ở các cơ quan sinh dưỡng của cây Tràm 25

3 Sự phân bố túi tinh dầu 27

4 Mật độ túi tinh dầu 31

5 Đặc điểm tích lũy tinh dầu ở cây Tràm 36

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

1 Kết luận 38

2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC I

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thống kê các độ tuổi của cây Tràm đã được giải phẫu 21

Bảng 2: Số túi tinh dầu trung bình của một lát cắt ở rìa phiến lá 29

Bảng 3: Số túi tinh dầu trung bình của một lát cắt ở giữa phiến lá 29

Bảng 4 Số túi tinh dầu trung bình của một lát cắt ở hai bên lá Tràm 30

Bảng 5 Mật độ túi tinh dầu (cái/cm2) ở lá Tràm trong tháng 11/2010 31

Bảng 6 Mật độ túi tinh dầu (cái/cm2) ở lá Tràm trong tháng 03/2011 32 Bảng 7 Hàm lượng tinh dầu (% theo trọng lượng tươi) của các loại lá Tràm36

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Trung tâm nghiên cứu – Thực nghiệm – Đa dạng sinh học Hòa An 9

Hình 2 Sơ đồ thu mẫu 11

Hình 3 Các loại lá Tràm 15

Hình 4: Lá được cắt bỏ phần đầu và đuôi trước khi giải phẫu 16

Hình 5: Lá được cắt dọc theo gân chính 16

Hình 6: Giữa lá và rìa lá 17

Hình 7: Cấu tạo cuống lá Tràm (4X) 22

Hình 8 Lát cắt ngang lá cây Tràm (10X) 22

Hình 9 Lát cắt ngang cành (10X) 23

Hình 10 Lát cắt ngang của rễ (4x) 24

Hình 11 Túi tinh dầu ở cành (4X) 25

Hình 12 Túi tinh dầu ở phiến lá (10X) 26

Hình 13 Túi tinh dầu ở cuống lá (4X) 26

Hình 14 Lát cắt ngang ở cành (4X) 28

Hình 15: Tinh dầu Tràm 37

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1 Mật độ túi tinh dầu (cái/cm2) ở các độ tuổi khác nhau của cây Tràm

ở tháng 11/2010 32

Sơ đồ 2 Mật độ túi tinh dầu (cái/cm2) ở các độ tuổi khác nhau của cây Tràm ở tháng 03/2011 33

Sơ đồ 3 Mật độ túi tinh dầu ở lá non ở mùa mưa và mùa khô 34

Sơ đồ 4 Mật độ túi tinh dầu trong lá già ở mùa mưa và mùa khô .35

Sơ đồ 5 Mật độ túi tinh dầu trong lá bánh tẻ ở mùa mưa và mùa khô 35

Sơ đồ 6 Hàm lượng tinh dầu tháng 01/2010 37

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

1 Đặt vấn đề

Cây Tràm (Melaleuca cajuputi Powell) thuộc họ Sim (Myrtaceae) phân bố tự

nhiên ở Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, New Zealand, Brazil, Nigeria và đảo Hải

Nam (Trung Quốc) Ở Việt Nam cây Tràm (Melaleuca cajuputii Powell) phân bố

tự nhiên chủ yếu ở các tỉnh phía Nam từ Huế vào đến tận các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Đặc biệt ở đồng bằng sông Cửu Long, cây Tràm phân bố tự nhiên, tạo thành rừng trên diện tích rộng lớn gần 200.000 ha, là loài cây đặc trưng được trồng trên vùng đất phèn, ngập nước theo mùa của Đồng bằng sông Cửu Long Từ lâu Tràm được coi là loại lâm sản có giá trị kinh tế được sử dụng làm vật liệu xây dựng, chất đốt, sản xuất giấy nhưng chủ yếu Tràm dùng để làm cừ Tuy nhiên, những năm gần đây khi xây dựng người ta không chuộng cừ Tràm mà chuyển sang sử dụng cừ sạn, cừ bê tông, cọc nhựa, đồng thời chất lượng của cừ Tràm cũng thấp nên thị trường tiêu thụ cây Tràm bị thu hẹp, giá cả xuống thấp Cuộc sống của người dân trồng Tràm gặp rất nhiều khó khăn Hậu quả là diện tích rừng Tràm đang dần bị thu hẹp

Nhưng xét về mặt sinh thái thì cây Tràm đóng vai trò cực kỳ quan trọng đối với môi trường: Tràm giúp điều hòa khí hậu, ngăn tình trạng oxy hóa đất phèn, đồng thời chống chịu gió bão, lũ lụt, xói lở vùng đầu nguồn… Ngoài ra, rừng Tràm còn là nơi trú ngụ của những loài chim và những động vật khác Vì vậy cần tìm hướng đi mới để giữ lại cây Tràm là vấn đề cấp bách của Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay

Qua nghiên cứu người ta đã tìm thấy nhiều công dụng của tinh dầu được chiết xuất từ cây Tràm ứng dụng trong y học, mỹ phẩm, hương liệu… Trên thị trường hiện nay loại tinh dầu này ngày càng được ưa chuộng trong và ngoài nước Đây là một tiềm năng kinh tế chưa được đẩy mạnh khai thác, vì thế nó cần được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn

Ở Đồng bằng sông Cửu Long đã nghiên cứu rất nhiều về cây Tràm, về kĩ thuật trồng, khai thác, tiềm năng kinh tế và giá trị sinh thái của cây Tràm, tuy nhiên vấn đề nghiên cứu về tinh dầu Tràm ở đây vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, chúng tôi

chọn thực hiện đề tài: ”Khảo sát cấu tạo giải phẩu và sự phân bố túi tinh dầu

của cây Tràm (Melaleuca cajuputii Powell) ở giai đoạn trưởng thành tại trung

tâm thực nghiệm đa dạng sinh học ở Hòa An”

2 Mục tiêu

- Xác định cấu tạo giải phẫu, vị trí và sự phân bố túi tinh dầu của cây Tràm ở giai đoạn trưởng thành, bổ sung thông tin nghiên cứu về tinh dầu Tràm ở Hòa An nói riêng cũng như cây Tràm ở ĐBSCL nói chung

- Xác định rõ hơn mật độ của các túi tinh dầu, tìm hiểu sự biến động mật độ túi tinh dầu trong lá và cành ở các độ tuổi của cây Tràm Từ đó, có thể khuyến cáo việc khai thác cây Tràm một cách hiệu quả, nâng cao giá trị của nó, khôi phục diện tích trồng Tràm

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1 Sơ lược về cây Tràm và tinh dầu Tràm

1993 đều định danh khoa học cây Tràm mọc tự nhiên ở nước ta là Melaleuca

leucadendron Đến năm 1991, trong tập “Cây cỏ Việt Nam” Giáo sư Phạm Hoàng

Hộ sử dụng tên khoa học Melaleuca cajuputi Powell cho loài Tràm mọc phổ biến ở

Việt Nam Năm 1995 trong luận án Phó tiến sĩ, Đào Trọng Hưng sử dụng tên khoa

học “Melaleuca cajuputi Powell” để gọi tên cây Tràm Và năm 2004, Hoàng Chương một lần nữa cũng định danh cây Tràm là Melaleuca cajuputi Powell

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây Tràm

Theo Cao Thúy Chung, Nguyễn Bộ Quỳnh (1978): Tràm là cây gỗ cao tới 20- 25m, thân tròn thẳng, vỏ trắng xám, xốp, có thể bóc thành nhiều lớp mỏng, theo Phạm Hoàng Hộ (1992), Lâm Bỉnh Lợi & Nguyễn Văn Thôn (1972) Tràm là loài cây gỗ lớn, lá có tinh dầu thơm, phiến thon, thường trổ hoa vào tháng 5 và kết trái vào tháng 11

Ngoài ra, theo Dương Văn Ni và ctv mô tả thân Tràm thẳng, cành nhỏ nhưng

gỗ thường uốn vặn (nên khó xẻ ván) Gỗ có màu trắng pha hồng, gỗ dác và gỗ lõi khó phân biệt Lá nguyên tròn dài, có 5 gân cong bằng nhau, mọc xen kẽ ở đầu ngọn Lá màu trắng xanh, có lông khi còn non, dần dần dày, trơn và có màu xanh lá cây nhạt Hoa màu trắng, không có cuống và mọc dày đặc thành gié quanh ngọn

cành Trái hơi tròn (dạng ê-líp) với đường kính khoảng 3 – 5mm, khi khô khai thành 3 lỗ ở trên 3 buồng, mỗi trái chứa 60 – 100 hạt (Dương Văn Ni, 1998)

1.2 Tinh dầu Tràm

Tinh dầu Tràm là chất lỏng màu vàng, trong suốt nhẹ hơn nước, không tan trong nước, có thể tan trong một thể tích cồn 800 Tỷ trọng ở 2000 C là 0,910 – 0,930 Tinh dầu Tràm là hỗn hợp Tecpenoit cấu trúc gồm nhiều đơn vị isopren

Có thể phân loại các tecpen dựa trên số đơn vị isopren hình thành Các monotecpenoic C10 và sesquitecpenoic C15 là thành phần chủ yếu của tinh dầu Tràm Công thức phân tử của hidrocacbon-tecpenoit là (C5H8)n Thành phần chính của tinh dầu Tràm là 1,8- cineol (Nguyễn Thị Lan và ctv, 2008)

1.2.1.Công dụng của tinh dầu Tràm

Theo số liệu phân tích của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật thì trong lá tươi dạng Tràm gió chứa trung bình 0.5 – 0.8% tinh dầu và hàm lượng 1.8-cineol trong loại tinh dầu này đạt 46.9 – 72.0%, các hợp chất còn lại đáng quan tâm là alpha-pinen, limonen, p-cymen, linalool và alpha-terpineol (Hoàng Chương, 2004) Dầu Tràm có chất Cajeputol có tính sát trùng nên được sử dụng làm thuốc trị bệnh đường hô hấp Không những được sử dụng trong việc làm thuốc sát trùng mà còn được sử dụng trong công nghệ chế tạo dầu thơm (Đào Trọng Hưng, 1995)

Theo Đào Trọng Hưng, sản phẩm có giá trị cao của cây Tràm là tinh dầu, được chưng cất từ lá và cành nhỏ Tinh dầu Tràm được sử dụng như một loại thuốc truyền thống của nhân dân dùng để xoa bóp, chống cảm cúm, say nắng, sát trùng vết thương, sưng khớp, đau xương, diệt khuẩn Hiện nay với sự phát triển của công

ty dược và bào chế, nước ta đã sản xuất được 16 loại sản phẩm từ tinh dầu Tràm

Đó là các loại thuốc thông thường như các loại cao xoa, các loại dầu, các loại thuốc

mỡ Najatox, Cobratox, Metylsalicilat, các loại kẹo và xi rô, … ; tinh dầu Tràm được kết hợp với các loại kháng sinh để điều chế nhiều dạng thuốc nang, thuốc viên, thuốc đạn dùng tiêm và uống điều trị các bệnh viêm phế quản, nhiễm trùng đường hô hấp, giảm đau hạ nhiệt, sát trùng, trị giun Tinh dầu Tràm với hợp chất đa dạng được sử dụng trong mỹ phẩm làm chất điều hương, sát trùng trong các loại kem đánh răng, kem dưỡng da Với nhiều công dụng như vậy nên tinh dầu Tràm

không chỉ có nhu cầu sử dụng trong nước mà còn có giá trị xuất khẩu cao (Đào Trọng Hưng, 1995)

Về dược tính, lá Tràm vị đắng tính ấm, vỏ Tràm tính bình vị nhạt, đều có mùi thơm nhẹ, có tác dụng an thần trấn tỉnh, tán phong giảm đau Tinh dầu có tính sát trùng, chữa phong thấp đau xương, đau dây thần kinh viêm ruột tiêu chảy, chữa cảm cúm, chữa hen suyễn đang lên cơn Tinh dầu Tràm pha với 10% dầu nhờn dung xoa mũi chống ngoại cảm, phòng dịch, xoa bóp chổ đau nhứt và bôi lên các vết thương với tác dụng sát trùng, giảm đau Lá Tràm khô sắc uống loãng thay nước trà có tác dụng phòng bệnh phong thấp, sốt rét và tăng cướng tiêu hóa Lá Tràm tươi nấu với nước chữa ghẻ ngứa nổi mẩn và chữa viêm loét, vết thương chống lành (Lê Trần Đức, 1997)

Từ tinh dầu Tràm, sau khi tách cineol để xuất khẩu, phần còn lại gọi là dầu nặng hay cặn tinh dầu Tràm Thứ nguyên liệu này một phần nhỏ được bào chế phối hợp với tá dược có sẵn trong nước thành thuốc trừ nấm da có tên là trasali, phần lớn còn lại được sử dụng làm thuốc đuổi muỗi (Mai Viết Sanh và ctv, 1997)

Kết quả đề tài "Nghiên cứu khả năng sử dụng cặn tinh dầu Tràm làm thuốc trừ sâu gốc thực vật" của Mai Viết Sanh và cộng tác viên (1997) chỉ ra rằng thuốc trừ sâu cặn tinh dầu Tràm có nồng độ 1% có tác dụng mạnh trên sâu xanh da láng

và sâu ăn tạp

1.2.2 Những vấn đề nghiên cứu về tinh dầu Tràm

Từ lâu, lá Tràm đã được người dân ở Java và Malaysia đun lấy nước xức lên tóc do lá Tràm có chứa tinh dầu có mùi thơm Và thổ dân vùng Amboine, Mollucca

là những người đầu tiên chưng cất tinh dầu từ lá Tràm Ngoài đặc tính thơm của tinh dầu Tràm, từ lâu loại tinh dầu này đã được người dân Trung Hoa sử dụng như một loại dược liệu quý hiếm trong việc phòng trừ cảm mạo, chữa bệnh đường hô hấp,…Và hiện nay tinh dầu Tràm được sử dụng phổ biến hơn trong nhiều lĩnh vực như: y học (dầu xoa bóp, thuốc sát trùng, làm thuốc chữa bệnh về đường hô hấp và các vết thương về phần mềm ), mỹ phẩm (kem dưỡng da, liền sẹo), làm hương liệu (sản xuất bánh, kẹo,…)

Những năm đầu của thế kỉ XIX, Morice đã chưng cất tinh dầu Tràm ở Đông Dương Năm 1950, trong chuyên khảo của Guenther đã trình bày một số đặc trưng

cơ bản về tính chất lý hóa học và hàm lượng tinh dầu Tràm (Cajeut oil) Đồng thời trong thế kỷ XIX, thì tinh dầu Tràm đã được người dân Châu Âu bày bán trên các quầy hàng hương phẩm và dược phẩm Và khi phân tích thành phần tinh dầu Tràm mọc ở Malaysia, Ramanoelina và Bianchin (1972) đã xác định được 47 chất khác nhau (Đào Trọng Hưng, 1995)

Vào khoảng năm 1940 trở đi, thì Việt Nam mới chưng cất tinh dầu với mục đích thương mại nhưng với quy mô còn nhỏ lẻ Từ 1976-1985, Viện dược liệu đã tiến hành phân tích hàm lượng tinh dầu, nghiên cứu động thái tích lũy tinh dầu cũng như kĩ thuật tinh chế và kiểm nghiệm chất lượng của tinh dầu Tràm Năm

1984, Phạm Trương Thị Thọ và nhóm cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu tinh dầu Tràm ở Long An và đưa ra kết luận là: tỷ lệ tinh dầu trong lá non cao hơn lá già và dao động trong khoảng 2 – 6 % trọng lượng khô tuyệt đối Còn hàm lượng cineol thì trong tinh dầu lá già cao hơn trong lá non Hàm lượng tinh dầu và hàm lượng cineol còn thay đổi theo mùa và theo các điểm thu mẫu khác nhau (Phạm Trương Thị Thọ và ctv, 1984)

Riêng ở Đồng bằng sông Cửu Long, vào năm 1988, Todorova và cộng sự đã xác định được trong tinh dầu Tràm Long An có 34 thành phần hóa học khác nhau Cũng trên đối tượng cây Tràm ở Long An nhóm nghiên cứu: Nguyễn Duy Cương, Trịnh Kim Ảnh, Trương Thị Xuyến và khoa học gia người Tiệp đã nghiên cứu về tính kháng khuẩn của tinh đầu Tràm Gió đưa đến sự thành lập xí nghiệp tinh dầu Tràm ở Mộc Hóa… Đồng thời trong năm này, Trung tâm nghiên cứu và bảo tồn dược liệu Đồng Tháp Mười đã bắt đầu nghiên cứu chế tạo thiết bị chưng cất và tinh chế tinh dầu Tràm

Trong đề tài “Sơ bộ thăm dò thành phần hóa học một số cây thuộc họ Myrtaceae” của Võ Văn Lẹo, Bùi Thị Quỳnh Tiên và Giáo sư Ngô Văn Thụ Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu mẫu và mô tả dược liệu, đặc biệt quan tâm đến cây Tràm cừ và Tràm gió và đưa ra kết luận đây là hai dạng sinh trưởng của một loài

duy nhất có tên khoa học là Melaleuca leucadendron L Các tác giả cho rằng có thể

dựa vào sự khác nhau về tinh dầu để phân biệt Tràm gió và Tràm cừ

Năm 1997, Mai Viết Sanh và nhóm nghiên cứu thuộc khoa Hóa – Sinh, Đại học Cần Thơ đã tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng cặn tinh dầu Tràm làm thuốc trừ sâu gốc thực vật và đã đưa ra kết luận: xác định được thành phần cơ bản

và tỉ lệ thích hợp để điều chế thuốc trừ sâu Đồng thời kết quả bước đầu trong phòng thí nghiệm chỉ ra rằng thuốc trừ sâu cặn tinh dầu Tràm có nồng độ 1% có tác dụng mạnh trên sâu da láng và sâu ăn tạp

Tại hội nghị báo cáo khoa học sinh học quốc gia năm 2000 nhóm tác giả: Đào Trọng Hưng, Nguyễn Quyết Chiến và Nguyễn Xuân Dũng đã tham gia với đề tài:

“Đặc điểm sinh học và tinh dầu của cây Tràm trong các điều kiện sinh thái khác nhau ở Bình Trị Thiên” đã xác định tên khoa học của cây Tràm ở vùng Bình Trị Thiên, quá trình tích lũy tinh dầu phụ thuộc vào các điều kiện sinh thái khác nhau, cũng như đã xác định được thành phần hóa học của tinh dầu Tràm

Năm 2008, Nguyễn Thị Lan và cộng tác viên đã nghiên cứu về quy trình chiết xuất tinh dầu Tràm và tận dụng bã Tràm làm than hoạt tính Đáng chú ý là nghiên cứu của OPODIS pharma (tại viện Pasteur TP.HCM năm 2008) cho thấy tinh dầu Tràm có tác dụng ức chế virus cúm H5N1…

2 Đặc điểm vùng nghiên cứu

Trung tâm Nghiên cứu – Thực nghiệm – Đa dạng Sinh học Hòa An (gọi tắt là Trung tâm Hòa An), số 554, trên quốc lộ 61 hướng từ thành phố Cần Thơ đến thị

xã Vị Thanh - tỉnh Hậu Giang Trung tâm thuộc ấp Hòa Đức, xã Hòa An, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang Tổng diện tích là 112.31ha, hướng Đông giáp Kênh Bào Môn - ấp Hòa Đức, hướng Tây giáp Kênh Nông Trường - ấp Hòa Đức, hướng Bắc giáp Kênh 83 - ấp Xẻo Trâm và hướng Nam giáp quốc lộ 61

Ngày 25 tháng 6 năm 2004 Trường Đại học Cần Thơ đã có quyết định số: 487/QĐ-ĐHCT.TCCB thành lập Trung tâm Nghiên cứu – Thực nghiệm – Đa dạng Sinh học Hòa An (Trung tâm Hòa An), đơn vị trực thuộc Trường và trên cơ sở Trại Hòa An tách ra từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Hệ thống Canh tác (nay đổi tên là Viện Nghiên cứu và Phát triển Đồng bằng Sông Cửu Long)

Theo quy hoạch của Trường Đại học Cần Thơ, hiện tại Trung tâm Hòa An gồm các khu chức năng sau:

- Khu điều hành gồm: văn phòng, ký túc xá, hội trường và căn tin

- Khu thực nghiệm lúa có diện tích: 5,39ha được đưa vào sử dụng từ năm

2003, với các mục đích cụ thể:

+ Thử nghiệm các giống lúa triển vọng có năng suất cao và phẩm chất ngon + Thí nghiệm so sánh năng suất nhóm giống lúa A1, A2

+ Thí nghiệm trắc nghiệm hậu kỳ A1, A2

+ Thử nghiệm bộ giống cho vng đất khó khăn: phèn, mặn,

- Khu da dạng sinh học: Có tổng diện tích là 64.100m2 (6.4ha), được phục hồi

từ khu thí nghiệm đất phèn của chương trình VH.10 Có khả năng quản lí nước ở

03 chế độ: ngập sâu (1m); ngập trung bình(0.5m); ngập theo mùa (0.3m)

- Khu thực nghiệm chăn nuôi: Diện tích: 7,81 ha Đã đưa vào sử dụng trong năm 2007

- Khu đất phèn tự nhiên có diện tích: 70.511 m2, được giữ nguyên trạng thái

từ năm 1980 Đây là khu vực bảo tồn đa dạng sinh học thuộc hệ sinh thái đồng cỏ ngập nước theo mùa

- Khu thực nghiệm lâm nghiệp đang trồng và thử nghiệm so sánh năng suất

của giống Tràm Úc (Melaleuca leucadendron) với Tràm Cừ (Melaleuca cajuputi)

- Khu thực nghiệm VAC được xây dựng từ năm 1996 - các mô hình có nhiều

hoạt động như làm phân hữu cơ, trồng rau an toàn, nuôi dê, nuôi cá, ép cá sặc rằn, trồng nấm rơm, làm lúa giống để sinh viên thực hành và học tập

- Khu bảo tồn giống lúa địa phương được xây dựng từ năm 1996 - các

mô hình có nhiều hoạt động như làm phân hữu cơ, trồng rau an toàn, nuôi dê, nuôi

cá, ép cá sặc rằn, trồng nấm rơm, làm lúa giống để sinh viên thực hành và học tập

Hình 1 Trung tâm nghiên cứu – Thực nghiệm – Đa dạng sinh học Hòa An

1 Khu điều hành 2 Khu bảo tồn đa dạng sinh học

3 Khu thực nghiệm lâm nghiệp 4 Khu bảo tồn giống lúa địa phương

5 Khu thí nghiệm lúa 6 Khu đất ngập nước tự nhiên

7 Khu thực nghiệm VAC 8 Khu thực nghiệm chăn nuôi

9 Trại thực nghiệm thủy sản 10 Trại thực tập máy nông nghiệp

11 Khu nhà ở cho cán bộ trung tâm 12 Lung bào và bảo vệ loài hoang dã

13 Khu thực nghiệm, nghiên cứu ứng 14 Khu thực nghiệm môi trường

dụng và chuyển giao công nghệ sinh học 15 Khu thể dục thể thao

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng, địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

1.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu trong đề tài là cây Tràm (Melaleuca cajuputi Powell)

tại Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm đa dạng sinh học Hòa An

Khóa phân loại

độ tuổi:

- Tràm 20 năm tuổi được trồng ở các khu đất ngập nước gồm: khu Bảo tồn tập đoàn lúa địa phương (khu 4), khu 8 và khu vực phía bên trái trước cổng Trung tâm

- Tràm 15 năm tuổi được trồng ở bờ bao khu Bảo tồn tập đoàn cây bản địa (khu 2)

- Tràm 9 năm tuổi được trồng ở khu 8 với diện tích khoảng 3000m2

- Tràm 7 năm tuổi được trồng ở khu 8

- Tràm 6 năm tuổi được trồng ở khu 7

- Tràm 5 năm tuổi được trồng ở khu 4 và khu 8

- Tràm 3 năm tuổi được trồng ở khu 4

Trong đề tài này chúng tôi chỉ sử dụng những cây Tràm được Trung tâm trồng vì những cây Tràm mọc tự nhiên rất khó xác định độ tuổi, mặc khác Tràm trồng sẽ có độ đồng đều cao hơn Tràm tự nhiên Việc xác định tuổi cây dựa trên những ghi nhận của Trung tâm Chúng tôi tiến hành thu mẫu 11 lô thuộc 4 khu có Tràm tại Trung tâm theo sơ đồ thu mẫu sau

Hình 2 Sơ đồ thu mẫu

Địa điểm giải phẫu và chiết xuất tinh dầu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Thực vật học, Bộ môn Sư phạm Sinh và phòng thí nghiệm Hóa vô cơ, Bộ môn Sư phạm Hóa - Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ

1.3 Thời gian thực hiện đề tài

Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 09 năm 2010 đến tháng 05 năm 2011

- Nước cất

- Glycerin 5%

- FAA (5% formol, 10% acid acetic, 35% nước cất, 50% cồn tuyệt đối)

3 Phương pháp

3.1 Thu mẫu và xử lí mẫu

3.1.1.Thời gian thu mẫu

a Đối với mẫu giải phẫu

Mẫu được thu ở 55 cây ở các khu với các độ tuổi khác nhau Chia thành 2 đợt khảo sát:

- Đợt 1: 11/2010

- Đợt 2: 03/2011

Vì lượng mẫu thu về khá lớn nên mỗi đợt thu mẫu kéo dài khoảng 30 ngày, chia thành 2 lần thu mẫu, mỗi lần cách nhau 15 ngày Theo khảo sát khí hậu tại Trung tâm Hòa An mùa mưa được bắt đầu từ tháng 5 và kết thúc vào tháng 11, mùa khô kéo dài từ tháng 12 đến tháng 4 hằng năm Tháng 11 thuộc mùa mưa còn tháng 3 là thời điểm mùa khô, mục đích của việc chia thành 2 đợt thu mẫu khảo sát

để có thể so sánh sự khác biệt về mật độ phân bố tinh dầu ở cây Tràm giữa mùa mưa và mùa khô

b Đối với mẫu chiết xuất tinh dầu

Do hạn chế về thời gian nên chúng tôi chỉ thu mẫu chiết xuất 1 lần vào tháng 01/2011

3.1.2 Phương pháp thu mẫu

a Thu mẫu giải phẫu

- Xác định vị trí các khu Tràm ở Trung tâm Hòa An, phân chia mỗi khu thành nhiều lô theo độ tuổi của Tràm

- Tùy thuộc vào diện tích và hình dạng mỗi lô mà bố trí thí nghiệm theo 2 kiểu: Đối với những lô có diện tích rộng và dạng hình chữ nhật, chúng tôi lấy mẫu

theo kiểu 2 đường chéo, đối với những lô có diện tích nhỏ và hẹp thì lấy mẫu theo hình chữ “Z”

- Tiến hành thu mẫu: Quan sát và chọn những cây tốt, không bị tổn thương do côn trùng cắn phá, không bị héo Ở mỗi lô chọn ra 5 cây, trên mỗi cây lấy ba loại lá: lá non, lá già và lá bánh tẻ

- Dùng kiềm, kéo cắt cây cắt các bộ phận cần dùng cho mẫu vào túi nilong

- Dùng viết chì ghi số thứ tự cây, tên lô, tên khu lên một tờ giấy bóng mờ kích thước 3x6 (cm), cột chung với lá

b Thu mẫu để chiết xuất tinh dầu

- Tương tự như thu mẫu để giải phẫu: thu theo lô, khu

- Thu với số lượng nhiều, thu ngẫu nhiên và rãi đều: chọn những cây có lá nhiều, tươi tốt Dùng kéo cắt cành cắt lấy cành nhỏ có lá ở trên ngọn

a Đối với mẫu giải phẫu

Mẫu thu được cho vào túi nilong cùng với giấy bóng mờ đã ghi chú: ngày thu mẫu, số lô, số khu, số cây, người thu mẫu; buộc chặt miệng túi tránh làm bốc hơi nước dẫn đến héo mẫu

Phân loại lá non, lá già, lá bánh tẻ và thân tương ứng với cách phân loại lá Dùng dây nilon cột riêng các loại lá, thân sau khi phân loại Việc xác định tuổi lá dựa vào hình thái của lá theo mô tả của Đào Trọng Hưng (1995) Việc chọn cành

để giải phẫu cũng chia thành 3 loại: cành non, cành trung bình và cành già ở những

vị trí mang lá tương ứng

Hình 3 Các loại lá Tràm

Mẫu sau khi đem về phòng thí nghiệm có 3 trường hợp xử lí như sau:

+ Giải phẫu ngay trong ngày

+ Giữ mẫu trong vài ngày bằng cách cho túi nilong có chứa mẫu vào trong tủ lạnh hoặc được lấy ra ngâm vào nước (nếu giải phẫu ngày sau đó)

+ Cho mẫu đã phân loại vào hủ nhựa, cho dung dịch FAA vào để giữ mẫu lâu hơn

b Đối với mẫu chiết xuất tinh dầu

- Đối với mẫu chiết xuất tinh dầu chỉ lấy lá không lấy cành

- Phân loại lá non, lá già, lá bánh tẻ

- Mỗi mẫu lá thu khoảng 0.5 kg cho vào túi nilon cột chặt lại

- Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm phân loại và trữ ở nhiệt độ thấp Sau đó gửi mẫu ở phòng thí nghiệm Hóa vô cơ, bộ môn Sư phạm Hóa, Đại học Cần Thơ

để chiết xuất tinh dầu

3.2 Quan sát cấu tạo giải phẫu

3.2.1 Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

Để quan sát cơ cấu ở những cơ quan thực vật hay các bào quan bên trong tế bào, có nhiều cách thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời Trong phòng thí nghiệm thực vật - Bộ môn Sinh - Khoa Sư phạm- Trường Đại học Cần Thơ, phương pháp cắt lát mỏng bằng tay và nhuộm hai màu với các cơ quan được cắt ra thành từng khoanh mỏng (phẫu thức) trước khi quan sát

a Cắt lát mỏng bằng tay: Quy trình thực hiện theo trình tự các bước sau:

- Cắt khoanh khoai lang/ cà rốt thành khoanh dày khoảng 2cm dùng để làm thớt Nhưng hiện nay chúng tôi thấy sử dụng gôm 8x4x2 (cm) (dài x rộng x cao) cũng rất tiện lợi cho việc dùng làm thớt cắt lát mỏng mẫu vật

- Đặt cơ quan (thân, lá) lên “thớt”, giữ chặt cơ quan trên thớt giữa ngón tay trái và ngón trỏ của bàn tay trái hay ngược lại

- Tay phải cầm lưỡi lam mới đặt thẳng góc sát vào cơ quan, cắt xuống thành từng lát mỏng bằng cách kéo về phía mình từ trái sang phải

- Đối với lá:

+ Bước 1: cắt bỏ bớt phần đầu lá và phần đuôi lá

Lá trước khi cắt Lá sau khi cắt

Hình 4: Lá được cắt bỏ phần đầu và đuôi trước khi giải phẫu

+ Bước 2: cắt dọc lá Tràm theo gân giữa, phân lá thành 2 phần bằng nhau

A B

Hình 5: Lá được cắt dọc theo gân chính

A Nửa lá bên trái B Nửa lá bên phải

+ Bước 3: lấy nữa lá Tràm, tiếp tục cắt dọc theo gân lá chia nữa lá Tràm thành: rìa lá và giữa lá có dạng nhỏ hẹp tương đối đều

- Cơ quan trước khi cắt nên đặt trong nước để tránh bị khô héo

- Lát cắt càng mỏng càng tốt, khi cắt phải kéo lưỡi lam theo một chiều nhất định, tránh kéo lưỡi lam qua lại nhiều lần và phải cắt nhiều lát để dễ lựa chọn

- Lát cắt phải luôn thẳng góc với trục cơ quan, vì thế khi cắt được vài lát phải kiểm tra lại mặt cắt, nếu thấy xéo phải cắt bỏ phần xéo rồi mới tiếp tục cắt

- Lát cắt phải cho ngay vào dung dịch thích hợp (nước, hoặc nước javel…) bằng cách dùng kim mũi giáo gỡ nhẹ các lát cắt dính trên thớt hoặc trên lưỡi lam và cho vào đĩa đồng hồ đã để sẵn dung dịch

b Cách nhuộm hai màu

- Nguyên tắc của phương pháp nhuộm hai màu: khi vi mẫu được nhuộm bằng dung dịch phẩm nhuộm hai màu son phèn – lục iod (Carmin alone – vert d’iod), son phèn đã nhuộm màu hồng vách tế bào bằng cellulose và lục iod nhuộm xanh vách tế bào tẩm mộc tố

- Cách thực hiện: Mẫu vật sau khi được cắt thành lát mỏng sẽ lần lượt ngâm vào các dung dịch sau:

+ Bước 1: Ngâm mẫu vật sau khi cắt vào nước javel 15 phút để loại nội dung

tế bào

+ Bước 2: Rửa javel bằng nước (ít nhất 3 lần)

+ Bước 4: Ngâm mẫu vào acid acetic 5 phút để tiếp tục loại nội dung tế bào

và làm sạch nước javel còn sót lại

+ Bước 5: Rửa nước ít nhất 5 lần cho đến khi không còn mùi acid acetic

+ Bước 6: Nhuộm bằng phẩm nhuộm son phèn- lục iod 3 phút

+ Bước 7: Rửa nước cho sạch phẩm nhuộm và giữ phẫu thức trong nước hoặc glycerin

Chú ý: Luôn luôn để phẫu thức trong dĩa kính đồng hồ, chỉ dùng ống nhỏ giọt

để rửa và thay đổi nước hay dung dịch trong dĩa Tuyệt đối không dùng kim nhọn đụng vào phẫu thức vì khi các phẫu thức bể sẽ khó quan sát

3.2.2 Lên mẫu, đếm số lượng túi tinh dầu và chụp hình

a Lên mẫu

- Phiến kính mang vật và phiến kính đậy vật phải thật sạch và khô

- Nhỏ lên giữa phiến kính mang vật một giọt glycerin (nước hay phẩm

nhuộm nào đó tùy theo yêu cầu) làm môi trường quan sát

- Dùng kim mũi giáo vớt 5 phẩu thức mỏng (ước lượng bằng mắt), đẹp,

không bị xéo đặt vào giữa giọt glycerin

- Dùng ngón tay trỏ và ngón tay cái cầm lấy hai cạnh của lemelle, đặt cạnh dưới của lamelle tiếp xúc với giọt chất lỏng và đồng thời nghiêng miếng lamelle một góc 45o cho đụng với giọt chất lỏng, sau đó dùng kim mũi giáo đở nhẹ lamelle

và vừa hạ xuống từ từ cho sát trên lame vừa rút kim mũi giáo ra (nhằm tránh có bọt khí và dập phẫu thức)

Chú ý: Tránh dùng glycerin quá nhiều, vì sẽ làm trôi phiến kính đậy vật, làm

dơ bàn kính và làm mờ thị trường Trái lại nếu quá ít, glycerin sẽ bao quanh mẫu vật, ảnh sẽ khó quan sát và không giống ảnh thực

Chiều di chuyển của kim mũi giáo Kim mũi giáo

Phẫu thức lame

lamelle

Cách đặt phẫu thức lên lame