CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.2. Quan sát cấu tạo giải phẫu
3.2.1. Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời
Để quan sát cơ cấu ở những cơ quan thực vật hay các bào quan bên trong tế bào, có nhiều cách thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời. Trong phòng thí nghiệm thực vật - Bộ môn Sinh - Khoa Sư phạm- Trường Đại học Cần Thơ, phương pháp cắt lát mỏng bằng tay và nhuộm hai màu với các cơ quan được cắt ra thành từng khoanh mỏng (phẫu thức) trước khi quan sát.
a. Cắt lát mỏng bằng tay: Quy trình thực hiện theo trình tự các bước sau:
- Cắt khoanh khoai lang/ cà rốt thành khoanh dày khoảng 2cm dùng để làm thớt. Nhưng hiện nay chúng tôi thấy sử dụng gôm 8x4x2 (cm) (dài x rộng x cao) cũng rất tiện lợi cho việc dùng làm thớt cắt lát mỏng mẫu vật.
- Đặt cơ quan (thân, lá) lên “thớt”, giữ chặt cơ quan trên thớt giữa ngón tay trái và ngón trỏ của bàn tay trái hay ngược lại.
- Tay phải cầm lưỡi lam mới đặt thẳng góc sát vào cơ quan, cắt xuống thành từng lát mỏng bằng cách kéo về phía mình từ trái sang phải.
- Đối với lá:
+ Bước 1: cắt bỏ bớt phần đầu lá và phần đuôi lá.
Lá trước khi cắt Lá sau khi cắt
Hình 4: Lá được cắt bỏ phần đầu và đuôi trước khi giải phẫu + Bước 2: cắt dọc lá Tràm theo gân giữa, phân lá thành 2 phần bằng nhau.
A B
Hình 5: Lá được cắt dọc theo gân chính A. Nửa lá bên trái B. Nửa lá bên phải
+ Bước 3: lấy nữa lá Tràm, tiếp tục cắt dọc theo gân lá chia nữa lá Tràm thành: rìa lá và giữa lá có dạng nhỏ hẹp tương đối đều.
Hình 6: Giữa lá và rìa lá + Bước 4: Tiến hành cắt lát bằng tay.
- Đối với cành và rễ:
Cắt cành (hoặc rễ) thành từng lát mỏng bằng tay.
Chú ý:
- Cơ quan trước khi cắt nên đặt trong nước để tránh bị khô héo.
- Lát cắt càng mỏng càng tốt, khi cắt phải kéo lưỡi lam theo một chiều nhất định, tránh kéo lưỡi lam qua lại nhiều lần và phải cắt nhiều lát để dễ lựa chọn.
- Lát cắt phải luôn thẳng góc với trục cơ quan, vì thế khi cắt được vài lát phải kiểm tra lại mặt cắt, nếu thấy xéo phải cắt bỏ phần xéo rồi mới tiếp tục cắt
- Lát cắt phải cho ngay vào dung dịch thích hợp (nước, hoặc nước javel…) bằng cách dùng kim mũi giáo gỡ nhẹ các lát cắt dính trên thớt hoặc trên lưỡi lam và cho vào đĩa đồng hồ đã để sẵn dung dịch.
b. Cách nhuộm hai màu
- Nguyên tắc của phương pháp nhuộm hai màu: khi vi mẫu được nhuộm bằng dung dịch phẩm nhuộm hai màu son phèn – lục iod (Carmin alone – vert d’iod), son phèn đã nhuộm màu hồng vách tế bào bằng cellulose và lục iod nhuộm xanh vách tế bào tẩm mộc tố.
- Cách thực hiện: Mẫu vật sau khi được cắt thành lát mỏng sẽ lần lượt ngâm vào các dung dịch sau:
+ Bước 1: Ngâm mẫu vật sau khi cắt vào nước javel 15 phút để loại nội dung tế bào.
+ Bước 2: Rửa javel bằng nước (ít nhất 3 lần).
+ Bước 4: Ngâm mẫu vào acid acetic 5 phút để tiếp tục loại nội dung tế bào và làm sạch nước javel còn sót lại.
+ Bước 5: Rửa nước ít nhất 5 lần cho đến khi không còn mùi acid acetic.
+ Bước 6: Nhuộm bằng phẩm nhuộm son phèn- lục iod 3 phút.
+ Bước 7: Rửa nước cho sạch phẩm nhuộm và giữ phẫu thức trong nước hoặc glycerin.
Chú ý: Luôn luôn để phẫu thức trong dĩa kính đồng hồ, chỉ dùng ống nhỏ giọt để rửa và thay đổi nước hay dung dịch trong dĩa. Tuyệt đối không dùng kim nhọn đụng vào phẫu thức vì khi các phẫu thức bể sẽ khó quan sát.
3.2.2. Lên mẫu, đếm số lượng túi tinh dầu và chụp hình a. Lên mẫu
- Phiến kính mang vật và phiến kính đậy vật phải thật sạch và khô.
- Nhỏ lên giữa phiến kính mang vật một giọt glycerin (nước hay phẩm nhuộm nào đó tùy theo yêu cầu) làm môi trường quan sát.
- Dùng kim mũi giáo vớt 5 phẩu thức mỏng (ước lượng bằng mắt), đẹp, không bị xéo đặt vào giữa giọt glycerin.
- Dùng ngón tay trỏ và ngón tay cái cầm lấy hai cạnh của lemelle, đặt cạnh dưới của lamelle tiếp xúc với giọt chất lỏng và đồng thời nghiêng miếng lamelle một góc 45o cho đụng với giọt chất lỏng, sau đó dùng kim mũi giáo đở nhẹ lamelle và vừa hạ xuống từ từ cho sát trên lame vừa rút kim mũi giáo ra (nhằm tránh có bọt khí và dập phẫu thức).
Chú ý: Tránh dùng glycerin quá nhiều, vì sẽ làm trôi phiến kính đậy vật, làm dơ bàn kính và làm mờ thị trường. Trái lại nếu quá ít, glycerin sẽ bao quanh mẫu vật, ảnh sẽ khó quan sát và không giống ảnh thực.
Chiều di chuyển của kim mũi giáo
Kim mũi giáo
Phẫu thức lame
lamelle
Cách đặt phẫu thức lên lame
b. Đếm số lượng túi tinh dầu và chụp hình - Đếm tất cả túi tinh dầu trong lát cắt.
- Đưa mẫu lên kính hiển vi có gắn camera để chụp hình ghi nhận lại.
- Chụp mẫu ở vật kính 4X để quan sát tổng quan, chụp mẫu ở vật kính 10X để quan sát cấu tạo giải phẫu.
Quy ước:
Đếm tất cả các túi tiết có trong phức mẫu.
Độ dày mỗi lát cắt là 70μm