Góp phần khảo sát thành phần flavonoid trong cây cỏ lào chromolaena odorata l , họ cúc asteraceae

- Năm 2000, Nguyễn Thị Ngọc Tú và Lê Thị Hải Yến Viện Hóa Học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, đã có công trình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số thành phần

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

ThS Ngô Quốc Luân Đặng Minh Khiêm

Lớp: Sư phạm Hóa Học K33

Mã số sinh viên: 2071987

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, khi chưa có các dược phẩm tổng hợp, con người đã biết sử dụng các loại thảo mộc có nguồn gốc từ thiên nhiên để chữa các bệnh từ đơn giản đến những căn bệnh nan y Điều trị theo cách này tuy mang lại những hiệu quả nhưng cũng tồn tại những mặt hạn chế

Hầu hết mọi cây cỏ đều chứa từ hàng nghìn đến hàng vạn hợp chất khác nhau Có những hợp chất mang lại lợi ích cho sức khỏe con người, cũng có những hợp chất không

có tác dụng gì và cả những chất là chất độc Cây cỏ có nhiều loài nhìn rất giống nhau nhưng thuộc những họ khác nhau Nếu cùng họ thì tính chất mỗi cây lại khác Có cây được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, nhưng cũng có cây chứa nhiều độc tính Trong cùng một loại cây, để chữa một loại bệnh có thể có sự tương tác giữa các chất với nhau Điều

đó thúc đẩy các nhà khoa học phải tìm mọi cách để cô lập những hợp chất riêng biệt trong cây

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của hóa học, đặc biệt là tổng hợp hữu cơ, kéo theo sự phát triển của ngành dược Các loại dược phẩm tổng hợp ngày càng đa dạng

và đã có những đóng góp hết sức to lớn trong việc bảo vệ sức khỏe con người Tuy nhiên, dược phẩm được tổng hợp bằng con đường hóa học thường rất đắt và thường bị hạn chế

về phương pháp tổng hợp chưa kể những tác dụng phụ không mong muốn

Con người lại có xu hướng trở về với những dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên Do đó việc khảo sát thành phần hóa học của các cây cỏ thiên nhiên là việc làm hết sức cần thiết Một mặt, nó khác phục những nhược điểm mà phương pháp điều trị thời xưa mắc phải, mặt khác, việc tìm ra những hợp chất thiên nhiên mới mang lại hy vọng to lớn cho những căn bệnh nan y Con người càng tin tưởng vào tương lai có thể chiến thắng mọi bệnh tật

Với tinh thần đó, đề tài “Góp phần khảo sát thành phần flavonoid trong cây cỏ

lào - Chromolaena odorata L., họ Cúc Asteraceae” mong muốn góp một phần nhỏ vào

việc nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên từ loài cây quen thuộc này

I TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ LÀO [1], [10], [12]

I.1 Hình thái

Cây cỏ lào còn có tên là yên bạch, cỏ hôi, cỏ Việt Minh, cây Cộng sản (herbe communiste), cây lốp bốp, cây ba bớp, cây bù xích, cỏ tàu bay, cỏ làm, cỏ kali, cây phân xanh, cây chùm hôi, cỏ nhật, nhã nhật (Tày), muồng mung phia (Dao), hay tên tiếng Anh

là fragrant thoroughwort, bitter bush, jack in the bush, siam weed, triffid weed và tên

tiếng Pháp là langue de chat, eupatoire odorante… Tên khoa học: Chromolaena odorata

L hay Eupatorium odoratum L (King & Robinson), chi Eupatorium L., thuộc họ Cúc (Compositae hay Asteraceae)

Thân cây nhỏ, cao 1-2 m, mọc thành bụi, phân nhiều cành ngang Thân tròn, hình

trụ thẳng, màu nhạt có rãnh và lông nhỏ mịn

Lá mọc đối, lúc non gần như hình tam giác, khi cây trưởng thành lá biến dạng

thành hình quả trám lệch Dài 6-8 cm, rộng 2-4 cm, gốc thuôn vát, đầu nhọn, có ba đường gân chính, mép có răng cưa to, hai mặt trên xanh đậm hơn hai mặt dưới Lá non có màu nâu tím, hai mặt lá đều có lông mịn nên chạm vào da có cảm giác ngứa, cuống lá dài 1-2

cm Vò lá và cành non có mùi thơm hắc

Hoa mọc thành cụm ở đầu cành thành ngù kép, gồm nhiều hoa có mùi thơm, tụ

hợp thành hình đầu dài khoảng 1 cm Hoa màu trắng khi còn non, có ánh tím nhạt khi đã

nở rộng Mỗi cụm hoa có lá bắc xếp thành 3-4 hàng, có lông, mào lông có sợi đều Tràng hoa loe dần từ gốc, bao phấn không có tai Mùa hoa từ tháng 11-12 dương lịch

Quả bế, hình thoi, có năm cạnh và cũng có lông Khi khô có thể bay xa theo gió,

nhờ vậy mà cỏ lào có khả năng phát triển lan rộng nhanh Mùa hoa quả tùy vào khí hậu từng vùng

Rễ cọc dạng chùm không đều nhau, màu trắng ngà Chung quanh gốc mọc nhiều

tua rễ, mỗi tua gồm một cọng chính, chung quanh cọng chính mọc nhiều rễ phụ phân nhánh

Cỏ lào khi còn là cây con nhìn rất giống cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.),

khi lớn thì phân biệt rõ ràng Tuổi thọ của cây khoảng từ 1-2,5 năm

Hình 1: Cây cỏ lào Hình 2: Lá cỏ lào

Hình 6: Quả cỏ lào khô Hình 5: Rễ cỏ lào

I.2 Phân bố-sinh thái

Eupatorium L là một chi lớn trong họ Asteraceae Trên thế giới có khoảng 400

loài, đa số là cây bụi, cây bụi nhỏ hoặc cây thân thảo Là loài cây ưa sáng, chịu được khí hậu hanh khô Phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi, châu Á Vùng ôn đới ấm ở châu Âu chỉ có một số ít loài

Ở Việt Nam chi này có khoảng 10 loài Trong đó, cỏ lào là loài cây bụi sống lưu niên quen thuộc nhất, thích hợp với vùng khí hậu chí tuyến Nằm trong diện quan trọng của thảm thực vật Cỏ lào có nguồn gốc từ đảo Antilles, sau đó phát tán sang nhiều nước Nam Mỹ, Tây - Nam Phi, quanh vùng Địa Trung Hải, đặc biệt là các nước vùng Đông Nam Á

Các nước trên thế giới có nhiều cỏ lào như: Brazil, Colombia, Australia, Congo, Nigieria, Ivory Coast, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam…

Ở Việt Nam, cỏ lào thường gặp ở nhiều nơi từ các tỉnh đồng bằng đến các tỉnh miền trung du và đồi núi thấp Cỏ lào là cây ưa sáng, chịu hạn và có thể sống được trên mọi loại đất, mọc tương đối tập trung trên những diện tích lớn ở đồi, nhất là nương rẫy đã bỏ hoang, thảo nguyên, bìa rừng Do đó, có thể xem cỏ lào là loại cây tiên phong số một trong quá trình diễn thế thứ sinh trên đất sau canh tác

Cỏ lào ra hoa và kết quả nhiều hàng năm Với số lượng hạt giống nhiều, lại phát tán nhờ gió nên cỏ lào có khả năng chiếm lĩnh và mở rộng vùng phân bố cực nhanh Cây phát tán hoang dại, mọc rất khỏe, phát triển tốt vào mùa mưa

Cây có thể sinh sản vô tính rất mạnh Ngọn non, cành già bẻ trụi lá, cắm xuống đất chỉ một tuần sau là mọc rễ trắng Chặt cây sát gốc càng đâm chồi mạnh Mãi đến năm

1935, các nhà thực vật học mới ghi nhận cây cỏ lào ở Việt Nam Mặt khác, cỏ lào có những vai trò rất quan trọng đối với phong trào cộng sản Việt Nam trong những năm 1935-1945 Cỏ lào tươi có thể dùng làm thực phẩm, cầm máu vết thương, ngụy trang cho quân đội Vì vậy, nó còn có tên là cỏ Nhật, cỏ Việt Minh, cây Cộng sản

I.3 Tác dụng dƣợc lý

I.3.1 Trong dân gian

- Về công dụng trong y học, từ lâu dân gian đã biết dùng cỏ lào để cầm máu, kháng viêm, chữa lành các vết thương phần mềm, vết bỏng và trị một số bệnh do nhiễm

khuẩn về đường ruột như tiêu chảy, lỵ cấp tính, viêm đại tràng, ung nhọt, ghẻ lở, đau nhức xương, cảm cúm, phòng và trị đỉa cắn

- Ở Campuchia và Haiti, nước sắc lá cỏ lào uống chữa ho, cảm lạnh, cảm cúm Người Dominica dùng lá cỏ lào đắp chữa mụn nhọt và vết loét lâu liền

- Ở Bờ Biển Ngà và Nepal, lá cỏ lào giã nát hoặc ép lấy dịch đắp trị vết đứt, vết thương chảy máu và làm liền sẹo

- Ở Nigieria, nước sắc cỏ lào chữa sốt, cúm và cảm lạnh Cao lá cỏ lào được dùng làm thuốc cầm máu vết thương Dịch ép lá là một loại thuốc sát trùng tốt dùng băng bó vết thương và trị nhiễm khuẩn Cao toàn cây là thuốc chống loét

Một số bài thuốc dân gian từ cây cỏ lào: Theo Đông y cỏ lào có vị đắng, ấm Có

sách nói mùi thơm, có sách cho là hôi nên còn có nơi gọi cỏ hôi

+ Chữa vết thương phần mềm: Do tai nạn giao thông, ngã, bị đòn đánh Lá và ngọn

cỏ lào tươi 1 nắm to (150g) rửa sạch, giã nát, đắp vào vết thương, băng chặt

+ Chữa lỵ trực khuẩn: Lá và ngọn cỏ lào tươi 1 nắm to (150g) rửa sạch, cắt nhỏ,

hãm với nước nóng 80oC (nước sôi để 5 phút trời lạnh, 10 phút trời nóng) trong 2 giờ với 500ml nước, giữ ấm bên ngoài đảm bảo 80o

C hoặc sau 15 phút lại đun 2 phút Rút nước, vắt kiệt nước trong bã, lọc lấy nước thuốc rồi cô còn 150ml Thêm 30 - 50g đường, đun sôi cho tan Người lớn uống mỗi lần 50 ml x 3 lần/ngày liên tục đến khi khỏi Nếu đi lỏng mất nước cần cho uống nước cháo loãng (gạo + khoai lang 1 củ nhỏ) pha muối (tốt hơn oresol vì phân sẽ mau thành khuôn) mỗi ngày 500-600ml nước cháo loãng

+ Chữa vết thương mắt do xước hoặc loét giác mạc (Người bệnh có thể bị mù do

trực khuẩn mủ xanh hoặc bệnh sẽ nặng nếu dùng thuốc nhỏ mắt có cocticoid): Ngọn cỏ lào và lá non 50g rửa thật sạch, giã nát trong cối chày sạch Dùng 2 miếng gạc sạch chia thuốc gói thành 2 gói Đặt vào bát sạch, cho vào nồi áp suất hấp (15 phút kể từ lúc thấy xì hơi) Nếu không có nồi áp suất có thể hấp cách thủy 30 phút (kể từ lúc nước sôi đến lúc ngừng đun) Mắt nạn nhân rửa sạch bằng nước muối 2% đun sôi để nguội, đắp gói thuốc rồi băng lại, để nạn nhân nằm ngửa 12 giờ thay thuốc một lần Nếu bệnh nhẹ thì 24 giờ

là khỏi

+ Tiêu chảy - kiết lỵ: Quả na điếc 20 g đốt tồn tính, cỏ lào ngọn non 50g, gạo tẻ

(rang thật vàng) 30g Tất cả sắc với 400 ml nước còn 100 ml, uống làm 2-3 lần trong ngày

+ Chữa sai khớp và bong gân: Cây cỏ lào dùng lá non và cành rửa sạch, sao nóng

đắp vào vết thương rồi băng chặt

+ Phòng đỉa cắn: Giã lá cỏ lào xoa khắp chân đùi trước khi lội xuống nước

+ Chữa đỉa cắn, chảy máu không ngừng: Vò lá cỏ lào xát vào chỗ đỉa cắn, máu sẽ

cầm ngay

I.3.2 Trong hóa y - dược học [10]

Cao chiết với cồn của cả cây cỏ lào (trừ phần rễ) có tác dụng chống co thắt cơ trơn gây bởi histamine và acetylcholine trên hồi tràng cô lập chuột lang Đã có nghiên cứu xác minh tác dụng cầm máu và làm mau liền sẹo của cỏ lào

Đã có nghiên cứu sử dụng cao lá cỏ lào để điều trị tại chỗ vết thương phần mềm nhiễm khuẩn và sẹo phần mềm lâu liền, với nồng độ thuốc 3,3:1 trên 86 bệnh nhân (trong

đó có 82 bệnh nhân đã phẫu thuật: mở rộng cắt tổ chức dập nát và hoại tử, loại bỏ dị vật, cắt cụt chi cấp cứu, để hở hoàn toàn vết thương), và đã chứng minh cỏ lào có những tác dụng sau:

- Làm giảm tiết dịch, giảm mùi hôi, hoại tử nhanh hơn nhóm đối chứng Tuy nhiên khi điều trị vết thương tại chỗ trong 3-5 phút đầu, thuốc gây cảm giác đau xót tại vết thương ở mức độ chịu đựng được

- Làm rút ngắn thời gian điều trị vết thương và thúc đẩy nhanh quá trình loại bỏ hoại tử, tân tạo mô liên kết và làm liền sẹo Sẹo hình thành mềm, mịn, không có sẹo co kéo, sẹo lồi Màu sắc sẹo hồng hoặc nâu nhạt, không thấy sẹo bạc màu

- Ức chế sự sinh trưởng in vitro và in vivo đối với các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn vết thương và tụ cầu khuẩn vàng, Escherichia coli, Proteus, trực khuẩn mủ xanh

Những chủng này được phân lập từ các bệnh phẩm lâm sàng đều phản tác dụng đối với các loại kháng sinh thông thường

- Những nghiên cứu về nồng độ hydroxyprolin và các hình ảnh siêu cấu trúc cho thấy tại các vết thương điều trị bằng cỏ lào, quá trình tổng hợp collagen phát triển tốt, tốc

độ tổng hợp collagen tăng nhanh, đặc biệt tăng cao nhất trong 7 ngày đầu

Ngày 28/06/2006, Viện Bỏng Lê Hữu Trác (Viện Bỏng Quốc gia - Hà Nội) đã công bố kết quả nghiên cứu và quy trình sản xuất thuốc mỡ Eupolin dùng để điều trị bỏng Nguyên liệu sản xuất thuốc này có nguồn gốc từ cây cỏ lào, loại thảo dược mọc nhiều ở miền đồi núi, trung du Việt Nam Tuy giá thành thấp nhưng thuốc này có chất lượng vượt trội Nghiên cứu trên bệnh nhân bỏng cho thấy, thuốc mỡ Eupolin sản xuất từ cây cỏ lào có hiệu quả ức chế vi khuẩn mạnh, kích thích biểu mô phát triển, làm nhanh liền vết thương và giảm sưng viêm

Th.S Mai Mạnh Tuấn, Khoa Nghiên cứu Đông y Thực nghiệm bệnh, Viện Y học

Cổ truyền Trung ương cho biết: Dịch chiết từ lá cây cỏ lào, ở những nồng độ nhất định có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của tế bào gốc dây cuống rốn Đây sẽ là cơ sở để tiến hành nghiên cứu các chế phẩm điều trị bệnh nan y Ngoài ra còn có tác dụng chữa vết thương ở mắt do xước hoặc loét giác mạc

- Làm thuốc trừ hay xua đuổi sâu mọt

- Bón trực tiếp cỏ lào tươi trong đất có thể làm giảm tuyến trùng có hại cho cây trồng

II.1 Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam

- Năm 1989, công trình nghiên cứu cho luận án phó tiến sỹ khoa học y dược của Trương Minh Kháng (Học Viện Quân Y Hà Nội), đã nghiên cứu tách chiết cao toàn phần của cỏ lào và các dạng bào chế của nó như cao lỏng, cao đặc, thuốc mỡ (SH-91) để điều trị vết thương, vết bỏng

- Phát triển từ công trình này, Viện Bỏng Quốc Gia đã trực tiếp nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất thuốc mỡ Eupolin có nguồn gốc nguyên liệu từ cây cỏ lào

để điều trị bỏng Kết quả này được công bố từ ngày 28/06/2006

- Năm 1993, Nguyễn Thị Diễm Trang, Lê Viết Ngọc Phương (Đại học Quốc gia

Hà Nội) và Nguyễn Xuân Dũng (Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký Việt Nam) có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cỏ lào Kết quả cô lập và xác định được cấu trúc của hai hợp chất thuộc nhóm chalcone là odoratin và 4,2’-dihydroxy-4’,5’,6’-trimethoxychalcone

- Năm 2000, Nguyễn Thị Ngọc Tú và Lê Thị Hải Yến (Viện Hóa Học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), đã có công trình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số thành phần trong cao cỏ lào Theo kết quả nghiên cứu này thì có hai tinh chất có hoạt tính kháng tốt đối với một số vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn gram âm,

vi khuẩn gram dương, nấm mốc và nấm men Tuy nhiên, các tác giả chưa công bố cấu trúc hóa học của các chất có hoạt tính sinh học nói trên

- Năm 2001, Nguyễn Kim Phi Phụng và Nguyễn Ngọc Sương (Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh) có công trình nghiên cứu về tách chiết và cô lập các hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học từ cây cỏ lào Kết quả cho thấy đã cô lập và xác định được cấu trúc của 6 chất gồm: ceryl alcohol, β-amyrine, β-sitosterol, odoratin, 2’-hydroxy-3,4,4’,5’,6’-pentamethoxychalcone và 4,2’-dihydroxy-4’,5’,6’-trimethoxychalcone

- Năm 2004, Lê Văn Hạc, Nguyễn Thị Thanh Hoài (Đại học Vinh) và Nguyễn Xuân Dũng (Đại học Quốc gia Hà Nội) có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu cây cỏ lào ở Nghệ An và Hà Tĩnh Kết quả cho thấy trong thành phần hóa học của tinh dầu cỏ lào có trên 60 chất, trong đó có khoảng 37 chất đã được nhận danh với thành phần chính gồm: geijerene (20,7%; 15,5%), gecmacren-D (20,5%; 16,8%), α-pinene (11%; 11,1%) và β-caryophyllene (9,1%; 7,3%)

- 2005, Nguyễn Đức Cường, Nguyễn Minh Chính (Học viện Quân y) đã thực hiện

đề tài: Bước đầu đánh giá độ ổn định và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở thuốc mỡ Eupolin từ cao lá cỏ lào Kết quả đã điều chế thuốc mỡ Eupolin với độ ổn định khá cao (khoảng 25 tháng), đáp ứng yêu cầu sản xuất đại trà

- 2006, Ngô Quốc Luân (Trường Đại học Cần Thơ), Nguyễn Ngọc Hạnh (Viện Công nghệ Hóa học) đã ly trích tinh dầu và khảo sát thành phần hóa học cây cỏ lào Kết quả đã thu được tinh dầu cỏ lào và các flavonoid như: odoratin, ombuin, 5,7-dihydroxy-4-methoxyflavanone, 3,5,7-trihydroxy-4-methoxyflavone, 4,2’-dihydroxy-4’,5’,6’-

trimethoxychalcone Tinh dầu và các flavonoid này đều được thử nghiệm hoạt tính sinh học, kháng oxi hóa, kết quả có khả năng kháng một số loại vi khuẩn gram âm, gram dương, nấm men, nấm mốc

- 2010, Đào Thị Vân Trang, Đào Hùng Cường (Trường Đại học Sư phạm, Đại học

Đà Nẵng) đã khảo sát quá trình chiết flavonoid từ lá cây cỏ lào Kết quả đã xác định được điều kiện chiết thích hợp: tỉ lệ H2O:EtOH = 1:1, tỉ lệ nguyên liệu rắn:dung môi = 1:25, nhiệt độ: 85oC, thời gian là 3 giờ

II.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới

- 1967-1969, Ahmad M., Nabi MN đã khảo sát thành phần hóa học của lá cỏ lào Kết quả thu được một số alcol béo sterol và flavonoid từ cao EtOH và PE

- 1974, Talapatra S.K và các cộng sự đã có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cỏ lào Kết quả thu được một số flavonoid và tritecpen từ cao PE

- 1978, Baruah RN và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu thành phần hóa học và đi sâu về hợp chất flavonoid trong cây cỏ lào mọc ở Ấn Độ Kết quả cho thấy đã xác định được cấu trúc của bảy hợp chất thuộc ba nhóm: flavone, flavonone, chalcone

- 1993, Dieneba Bamba và các cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của tinh dầu cỏ lào ở Bờ Biển Ngà Kết quả cho thấy thành phần tinh dầu cỏ lào có khoảng 38 hợp chất, trong đó có 26 hợp chất đã được xác định Tinh dầu cỏ lào ở đây có có tác dụng kháng tốt các chủng vi khuẩn gram âm

- 1997, Irobi O.N (Đại học Waterloo, Nigieria) công bố kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng sinh của cao cỏ lào chiết với EtOH bằng phương pháp đục lổ trên đĩa thạch trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy loại cao này có tác dụng kháng khá

nhiều chủng vi khuẩn như: B Thuringiensis, S Aureus, E Coli, Pseudomonas sp., Streptococcus faecalis và Klebsiella sp

- 1998-2000, Phan Toàn Thắng (Đại học Quốc gia Singapore) và các cộng sự đã công bố nhiều kết quả xung quanh việc nghiên cứu điều chế thuốc mỡ Eupolin từ cao chiết nước lá cỏ lào và ứng dụng vào việc điều trị vết thương, vết bỏng

- 2000, Taiwo Oludare B (Đại học Ibadan, Nigieria) và các cộng sự công bố kết quả thử tính kháng viêm, hạ sốt và chống co thắt cơ trơn của cao chiết MeOH lá cỏ lào trên loài chuột Kết quả cho thấy ở liều lượng từ 50-200 mg/kg thì có tác dụng

- 2001, Bouda H (Đại học Dschang, Cameroun) và các cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của tinh dầu từ lá cỏ cứt lợn, cây trâm ổi, cỏ lào trên tỷ lệ chết của mọt thóc Theo báo cáo thì LD50 của tinh dầu lá cỏ lào đối với mọt thóc là 6,78%

- 2002, Zhang Maoxin (Đại học Nông nghiệp Nam Trung Quốc) có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính kháng nấm và côn trùng của tinh dầu cỏ lào

Kết quả cho thấy tinh dầu có ảnh hưởng đến các chủng nấm như: Pyricularia grisea (61,4%), Phytophthora nicotianae (29,27%), Fusarium axysporum (14,44%) Thành

phần chính của tinh dầu cỏ lào: trans-caryophyllene (16,2%), δ-cadinen (15,5%), α- copaene (11,3%), caryophyllene oxyde (9,4%), germacrene (4,9%) và α-humulene (4,2%)

- 2004, Apichart Suksamrarn (Đại học Ramkhamhaeng, Thái Lan) và cộng sự đã

công bố công trình nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh lao phổi (mycobacterium)

và độc tính tế bào của các hợp chất flavonoid từ hoa cỏ lào Kết quả cho thấy đã cô lập và nhận danh được 8 hợp chất thuộc 3 phân nhóm: flavanone, chalcone và flavone

- 2005, Nisit Pisutthanan (Đại học Chiang Mai, Đại học Naresuan, Thái Lan) đã công bố công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cỏ lào mọc ở Thái Lan Kết quả cho thấy cao chiết DMC/H2O phần trên mặt đất của cỏ lào có hoạt tính kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh cho người và kháng viêm khá tốt Đã cô lập và xác định được 15 hợp chất flavonoid trong đó có một hợp chất hoàn toàn mới, trong số 14 flavonoid còn lại có 6 hợp chất lần đầu tiên được cô lập từ loại cây này

- 2005, Owoyele VB, Adediji JO và Soladoye AO (Đại học Ilorin, Nigieria) đã có công trình khảo sát hoạt tính kháng viêm của cao chiết nước lá cỏ lào trên chuột Kết quả cho thấy với liều lượng 200mg/kg thì có hiệu quả đến 80,5%

- 2006, A Ngono Ngane (Đại học Douala, Cameroun) đã công bố kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của cao chiết nước và EtOH của lá cỏ lào Theo báo cáo thì cao

này có thể kháng được các loại nấm như: Cryptococcus neoformans, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes và Trichophyton rubrum với nồng độ thấp

- 2006, Nisit Pisutthanan (Đại học Chiang Mai, Đại học Naresuan, Thái Lan) tiếp tục công bố kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu các bộ phận trên mặt đất

của cỏ lào mọc tại Thái Lan Thành phần chính tinh dầu cỏ lào gồm: pregeijerence (17,6%), germacrene-D (11,1%), α-pinene (8,4%), β-caryophyllene (7,3%), vestitenone (6,5%), β- pinene (5,6%), δ-cadinene (4,9%), geijerene (3,1%), bulnesol (2,9%) và trans-ocimene (92,2%)

I DỤNG CỤ - HÓA CHẤT

I.1 Dụng cụ

Bảng 1: Các dụng cụ cần thiết

1 Becher các loại 10 Phễu thủy tinh 19 Cột sắc ký (d = 5cm)

2 Erlen các loại 11 Pipette Pasteur 20 Cân kỹ thuật

3 Ống đong các loại 12 Pipette nhựa 21 Cân phân tích

4 Lọ thủy tinh 50ml 13 Giá ống nghiệm 22 Tủ sấy

5 Đũa thủy tinh 14 Giấy lọc 23 Máy cô quay chân không

6 Phễu chiết 15 Nồi đun cách thủy 24 Máy sấy

7 Vi quản 16 Bếp điện 25 Túi vải

8 Ống nghiệm 17 Lưới amiang 26 Tủ hút

9 Bình sắc ký 18 Muỗng nhựa, inox 27 Bản mỏng sắc ký

II NGUYÊN LIỆU

II.1 Thu hái nguyên liệu

Nguyên liệu là lá cây cỏ lào, được thu hái tại Khu II – Trường Đại học Cần Thơ

Cỏ lào được thu hái vào 08/2010, thời điểm này đang vào mùa mưa nên cây trong giai đoạn phát triển xanh tốt, chưa có hoa

II.2 Xử lý nguyên liệu

Cỏ lào tươi chứa hàm lượng nước khá cao, lá cỏ lào nhẹ hơn nhiều so với các bộ phận khác, chẳng hạn như thân (nhiều xenlulose) nên cùng lượng cân thì hàm lượng các chất tập trung nhiều ở lá Vì vậy, lá là nguyên liệu được dùng chủ yếu

Lá sau khi thu hái đem về loại bỏ những lá sâu, úa, rửa sạch, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Sau đó đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50-60oC đến khối lượng không đổi, vò nát thành bột

Hình 8: Nguyên liệu khô Hình 7: Nguyên liệu tươi

Hình 10: Máy cô quay chân không Hình 9: Ngâm dầm

III XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM NGUYÊN LIỆU

Cân 100g lá cỏ lào tươi, làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 100-105oC đến khối lượng không đổi Cân lại và tính hàm lượng nước theo công thức sau:

Trong đó: A là độ ẩm (%)

mt là lượng cân mẫu tươi (g)

mk là lượng cân mẫu khô (g)

Kết quả tính độ ẩm là cơ sở lựa chọn phương pháp ly trích, chiết tách, lập và tính hiệu suất các quá trình

Sau 3 lần thực hiện, kết quả được trình bày ở bảng sau:

m





IV QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

Sơ đồ 1: Quy trình thực nghiệm

Sấy ở 50-60 o

C, vò nát

Dịch chiết sệt

- Ngâm dầm với EtOH (3 lần)

- Cô đặc dưới áp suất kém

- Phân tán trong nước nóng

- Lắc chiết với EtOAc

- Cô đặc dưới áp suất kém

V ĐỊNH TÍNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CỎ LÀO [4], [6], [7], [11]

V.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid

* Cân 1g bột khô, cho vào 20ml CHCl3 và ngâm trong 2 giờ Sau đó lọc lấy dịch trong là mẫu thử

- Thuốc thử Salkowsky: Nếu dung dịch có màu đỏ đến nâu đỏ là dương tính

- Thuốc thử Libermann-Burchard: Nếu thấy xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá là dương tính

V.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid

* Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50ml EtOH 95% trong 30 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

* Thuốc thử: HClđđ + Mgbột + alcol isoamylic, dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa, dung dịch FeCl3 1%

* Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch mẫu, thêm vài giọt HClđđ, sau đó cho một ít bột Mg vào và lắc Thêm từ từ từng giọt alcol isoamylic, để yên quan sát nếu thấy xuất hiện vòng màu hồng hay dung dịch có màu tím thì có flavonoid trong mẫu

Dung dịch mẫu tạo kết tủa màu xanh lục đen với dung dịch FeCl3 1%, kết tủa trắng với dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa

V.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid

* Cân 5g bột lá khô ngâm với 80ml HCl 1% trong 4-6 giờ Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

* Thuốc thử:

- Wasicky: p-dimethyl amino benzaldehyde (20g), H2SO4đđ (60g), H2O (10ml)

- Bouchardat: I2 (2,5g), KI (5g), H2O (10ml)

* Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1ml các thuốc thử theo thành ống nghiệm, lắc đều, để yên, quan sát

- Thuốc thử Wasicky: Có kết tủa hình bông sao là dương tính

- Thuốc thử Bouchardat: Cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm là dương tính

V.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin

V.4.1 Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin

* Cơ sở của phương pháp: Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định

* Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi trong 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5,…, 10ml dịch lọc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10ml Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây Mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút Sau đó đo chiều cao các cột bọt

* Chỉ số bọt được tính theo công thức:

Trong đó: CSB: Chỉ số tạo bọt

i: ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1cm

* Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi thư không có saponin

V.4.2 Dựa vào các phản ứng đặc trưng

* Cân 5g bột khô, thêm vào 50ml EtOH 70o và đun cách thủy sôi trong 5 phút rồi lọc Cô cạn dưới áp suất kém đến cặn khô Cặn khô này dùng làm mẫu thử

* Thuốc thử: Liebermann-Burchard: (CH3CO)2O, H2SO4đđ

* Tiến hành: Hòa mẫu bằng 1ml (CH3CO)2O, thêm từ từ 0,3-0,5ml H2SO4đđ Nếu xuất hiện vòng ngăn cách:

- Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpenoid

- Có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

10 100.

CSB

i



V.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin

* Cân 5g bột khô, thêm vào 100ml nước cất, đun sôi trong 10 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

* Thuốc thử:

- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Pha đến bão hòa trong nước

- Dung dịch FeCl3: Pha nồng độ 1% trong nước

* Tiến hành: Lấy 2ml dung dịch lọc, thêm 2-4 giọt dung dịch thuốc thử

- Dung dịch (CH3COO)2Pb: Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt là dấu hiệu dương tính

- Dung dịch FeCl3: Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh đen hoặc lục đen (do tạo phức) là dấu hiệu dương tính

V.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycosyde

* Lấy 10g bột khô loại các chất không phân cực bằng PE Tiếp theo chiết với EtOH 50% Dịch lọc được loại tạp chất bằng (CH3COO)2Pb cho đến khi không còn trầm hiện Sau đó loại (CH3COO)2Pb dư bằng Na2SO4 bão hòa Cô cạn dịch lọc được cao glycosyde thô Hòa tan cao này bằng EtOH 95% và lấy dung dịch này làm mẫu thử

* Thuốc thử:

- Tollens: dung dịch AgNO3 10% (1ml) + dung dịch NaOH 10% (1ml) + dung dịch

NH4OH 25% từ từng giọt

- Fehling:

+ Dung dịch A: CuSO4.5H2O (40g) + H2O, định mức vừa đủ 1lít

+ Dung dịch B: KNaC4H4O6.4H2O (200g) + NaOH (150g) + H2O, định mức vừa

đủ 1lít

Khi sử dụng thì trộn hai dung dịch lại với nhau

* Tiến hành: Lấy 1ml mẫu thử, cho vào từng giọt cho đến hết 1ml các thuốc thử

- Thuốc thử Tollens: Nếu thấy xuất hiện kết tủa Ag màu đen là dấu hiệu dương tính

- Thuốc thử Fehling: Đun sôi ống nghiệm trên đèn cồn trong 1 phút Nếu thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ là dương tính

V.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất coumarine

* Đun hoàn lưu 5g bột mẫu trong 50ml EtOH 95% trong 30 phút Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử

* Thuốc thử: dung dịch NaOH 10% (0,5ml), HClđđ (vài giọt), H2O (12ml), dung dịch Na2CO3 10% (2ml)

- Phản ứng diazo hóa: Lấy 2ml mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch Na2CO310% và 4ml H2O Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm là dương tính

FeCl3 Dung dịch màu đen ++

Các thành phần khác như: acid hữu cơ, carotenoid… vẫn chưa được khảo sát Phần hình ảnh định tính được trình bày ở phụ lục 12 (trang PL12, PL13)

VI.1 Điều chế cao EtOAc

Lá cỏ lào tươi 5kg sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi ở 50-60oC được vò nát thành bột, thu được 1,2kg bột khô Cân khoảng 1kg bột khô cho vào túi vải sạch, đem ngâm dầm với 4 lít EtOH 95% trong 3 ngày thu được 4 lít dịch chiết Thực hiện trong 3 lần để chiết kiệt các chất có trong cỏ lào Sau đó đem cô đặc bằng máy cô quay chân không thu được 96g cao thô EtOH Phân tán cao này trong nước nóng thành dịch, sau đó lắc chiết với 1 lít EtOAc thu được 1 lít dịch chiết EtOAc Cô đặc bằng máy cô quay chân không thu được 32,3g cao EtOAc

VI.2 Cô lập và tinh chế hợp chất từ cao EtOAc

Sắc ký bản mỏng là công cụ đắc lực để kiểm tra sơ bộ các chất có trong cao EtOAc, dò tìm hệ dung môi thích hợp cho sắc ký cột, gom các lọ giống nhau, cũng như

dự đoán độ tinh sạch của chất

Bản mỏng được dùng là bản nhôm silicagel 60F254 tráng sẵn, kích thước 20x20

cm, độ dày lớp hấp phụ 2,2mm của hãng Merck, Germany Khi dùng cắt thành những bản nhỏ có độ cao 5cm, chiều rộng tùy theo số vết cần chấm

Silicagel sắc ký cột có kích thước 230-400 mesh, dùng cho sắc ký cột cổ điển của hãng Himedia, India

Cột sắc ký nhanh bằng thủy tinh cao 80cm, đường kính 6cm, sản xuất tại Việt Nam Các loại dung môi có xuất xứ từ Trung Quốc (PE, EtOAc) và Việt Nam (MeOH, EtOH)

Khối lượng silicagel nhồi cột là 250g Khối lượng cao EtOAc là 30g được trộn với 30g silicagel, sau đó xay nhuyễn thành bột đồng nhất, sấy khô Đổ 500ml PE vào cột (khoảng 1/4 cột) Sau đó hòa 250g silicagel vào PE tạo thành hỗn hợp sệt rồi đưa lên cột,

xả cột liên tục Sau khi nhồi cột xong, để qua một đêm cho cột cân bằng Đưa cao EtOAc lên cột, rót PE lên đầu cột, bắt đầu sắc ký PE là dung môi khởi đầu Hệ dung môi giải ly

là PE:EtOAc có độ phân cực tăng dần Dung môi giải ly TLC cũng là PE:EtOAc với tỷ lệ được giữ cố định là 1:1 Thuốc hiện màu là H2SO4 20% trong EtOH

Hình 12: Cột sắc ký

flash Hình 11: Sắc ký bản mỏng LA8 Hình 13: Tinh thể chất LA8

Kết quả thu được 18 phân đoạn: LA1, LA2,LA3,…, LA18 theo bảng 5

Bảng 5: Kết quả quá trình sắc ký cột cổ điển cao EtOAc

Phân

đoạn Số lọ Hệ dung môi

Thể tích (ml)

TLC (PE:EtOAc = 1:1)

Trọng lượng (g)

LA1 1 - 30 PE = 100% 1500 Không thấy vết <0,01 LA2 31 - 39 PE:EtOAc = 9:1 400 Vệt kéo dài 2,48 LA3 40 - 49 PE:EtOAc = 9:1 450 Nhiều vết 0,90 LA4 50 - 58 PE:EtOAc = 9:1 400 Vệt mờ 0,30 LA5 59 - 71 PE:EtOAc = 8:2 600 Nhiều vết 1,66 LA6 72 - 80 PE:EtOAc = 8:2 400 Vệt kéo dài 0,85 LA7 81 - 86 PE:EtOAc = 8:2 250 Vệt mờ 1,32

LA8 87 - 95 PE:EtOAc = 7:3 400 Vết đậm kéo dài 0,10

LA9 96 - 107 PE:EtOAc = 7:3 450 Nhiều vết 1,94 LA10 108 - 116 PE:EtOAc = 7:3 400 Nhiều vết 2,55 LA11 117 - 123 PE:EtOAc = 7:3 300 Vệt kéo dài 1,79 LA12 124 - 131 PE:EtOAc = 6:4 350 Nhiều vết 1,33 LA13 132 - 139 PE:EtOAc = 6:4 350 Nhiều vết 1,50 LA14 140 - 155 PE:EtOAc = 6:4 750 Vệt kéo dài 2,37 LA15 156 - 167 PE:EtOAc = 5:5 650 Vệt mờ 0,67 LA16 168 - 177 PE:EtOAc = 5:5 450 Nhiều vết 2,20 LA17 178 - 190 PE:EtOAc = 5:5 600 Nhiều vết 1,72 LA18 190 - 211 EtOAc = 100% 1050 Không thấy vết 2,69

Ghi chú:

PE: Petroleum ether EtOAc: Ethyl acetate

Hiệu suất thu hồi cột sắc ký: 26,37.100 87,9%

30

Tại phân đoạn LA8 (PE:EtOAc = 7:3) thu được kết tủa màu vàng Có Rf = 0,37 (PE:EtOAc = 1:1) Tinh chế bằng cách rửa kết tủa với PE, kết hợp kết tinh lại nhiều lần trong EtOAc thu được tinh thể dạng tấm màu vàng, ký hiệu là LA8 (27mg)

LA8 là chất rắn, kết tinh trong EtOAc cho tinh thể dạng tấm, màu vàng, tan tốt trong MeOH, EtOH, DMSO, mp = 220-222oC (EtOAc)

Rf = 0,37 (PE:EtOAc = 1:1)

* Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm) cho mười mũi tín hiệu proton:

 2 mũi đơn trong khoảng 3,84-3,85: 6 proton của hai nhóm -OCH3 gắn vào vòng thơm

 5 mũi trong khoảng 6,33-7,72 là tín hiệu của các proton loại C-H kề nối đôi, trong đó: 1 mũi đôi đôi (dd): 1 proton (7,68)

4 mũi đôi (dd): 4 proton (6,33; 6,68; 7,08; 7,72)

 3 mũi đơn ở 9,29; 9,52 và 12,43: 3 proton của 3 nhóm -OH

Vậy LA8 có tất cả 14 proton

* Các phổ 13C-NMR (CDCl3, δ ppm), kết hợp với DEPT90, DEPT135 cho thấy chất LA8 có 17 mũi tín hiệu carbon:

 Phổ DEPT90 cho 5 mũi dương trong khoảng 91,9-119,8 gồm các carbon loại C-H kề nối đôi

 Phổ DEPT135 cho 7 mũi dương nằm trong khoảng 55,6-119,8, ngoài 5 mũi dương đã xuất hiện trong phổ DEPT90 còn xuất hiện thêm 2 mũi dương nằm trong khoảng 55,6-56:

2 carbon của hai nhóm -OCH3 gắn vào vòng thơm (55,6; 56) Không xuất hiện mũi âm chứng tỏ LA8 không có carbon loại -CH2-

 10 mũi còn lại không xuất hiện trên phổ DEPT nên có thể kết luận chúng là những carbon bậc 4 (không gắn trực tiếp với proton):

9 mũi trong khoảng 104-164,9: 9 carbon bậc bốn (104; 123,5; 136,5; 146,4; 147;

149,6; 156,2; 160,5 và 165,1)

1 mũi ở 176: carbon của nhóm C=O đặc trưng của hợp chất flavone

Vậy LA8 có tất cả 17 nguyên tử carbon

So sánh các dữ liệu các phổ NMR của LA8 với LA5-14 trong Luận văn Cao học

“Nghiên cứu thành phần tinh dầu và flavonoid trong cây cỏ lào” của tác giả Ngô Quốc

Luân, Nguyễn Ngọc Hạnh, thấy có sự tương đồng

Bảng 6: So sánh dữ liệu phổ NMR của LA8 với LA5-14

Vị trí C/H

1 H-NMR (DMSO, δ ppm) 13 C-NMR (CDCl 3 , δ ppm)

Bảng 7: So sánh dữ liệu phổ NMR của LA8 với ombuin[2]

Vị trí C/H

1 H-NMR (DMSO, δ ppm) 13 C-NMR (CDCl 3 , δ ppm)

Nên dự đoán LA8 chính là LA5-14

Như vậy, LA8 có công thức phân tử là C17H14O7, phân tử khối là 330 đvC So

sánh với LA5-14 có nhiệt độ nóng chảy là 224-225o

C (EtOAc), Rf = 0,37 (PE:EtOAc = 1:1) [4]

* Phổ hai chiều HMBC (DMSO, δ ppm) cho thấy sự tương tác giữa H với C tại các vị trí C mà H có thể tương tác: H6C5, C7, C8, C10; H8C7, C9, C6, C10; H2’C6’, C2, C4’;

H5’C1’, C3’, C4’; H6’C2’, C4’; 4’-OCH3C4’; 7-OCH3C7; 3’-OHC2’, C4’; OHC2; 5-OHC6, C10, C5

3-Tóm lại, dựa vào tất cả các thông tin trên, có thể nhận danh LA8 là ombuin (3,5,3’-trihydroxy-7,4’-dimethoxyflavone) Tên IUPAC: 3,5-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-7-methoxychromen-4-one

Hình 14: Ombuin

Ombuin đã được thử hoạt tính sinh học, kết quả có khả năng kháng vi sinh vật bao

gồm các chủng: vi khuẩn gram âm, nấm mốc Nồng độ ức chế tối thiểu: 50 μg/ml [4]

(Vi khuẩn gram âm là vi khuẩn khi được nhuộm màu sẽ hiện màu xanh)

OH

12

345

67

C17H14O7 (M = 330)

C = 61,82%; H = 4,27%; O = 33,91%

13 C-NMR

δ ppm

Loại Carbon

HMBC 1

I CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Từ nguyên liệu ban đầu là cây cỏ lào mọc hoang tại khu II – Đại học Cần Thơ, qua quá trình nghiên cứu đã đạt được một số kết quả như sau:

- Đã khảo sát định tính sơ bộ thành phần hóa học cây cỏ lào Kết quả cho thấy, cây cỏ lào có chứa các hợp chất như: alcaloid, flavonoid, steroid, glycosyde, saponin, tanin, coumarine

- Từ cao EtOAc, đã cô lập và nhận danh 1 flavonoid thuộc nhóm flavonol là ombuin (3,5,3’-trihydroxy-7,4’-dimethoxyflavone), và đã thử hoạt tính sinh học

II KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học cây cỏ lào trên các loại cao khác như: PE, BuOH,…và các nhóm hợp chất khác để phân lập được nhiều hơn những hợp chất trong cây cỏ lào

- Ly trích tinh dầu cỏ lào ở khu II, Đại học Cần Thơ, tiến hành chạy phổ GC/MS, và thử hoạt tính sinh học, so sánh thành phần hóa học của tinh dầu cỏ lào ở đây với các vùng khác trên cả nước và thế giới