Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae), là một dược liệu được dân gian sử dụng phổ biến để chữa bệnh viêm xoang. Trong số các thành phần hóa học đã được công bố của Cỏ cứt lợn, nhóm hoạt chất flavonoid là nhóm thể hiện hoạt tính kháng viêm đáng kể. Đề tài được tiến hành nhằm mục đích cung cấp cơ sở hóa thực vật cho việc sử dụng Cỏ cứt lợn trong điều trị viêm xoang mũi.
Trang 1Khảo sát thành phần flavonoid trong cây Cỏ cứt lợn
(Ageratum conyzoides L Asteraceae)
Nguyễn Thị Kim Liên
Đại học Nguyễn Tất Thành
ntklien@ntt.edu.vn
Từ khóa
Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae), là một dược liệu được dân gian sử dụng phổ
biến để chữa bệnh viêm xoang Trong số các thành phần hóa học đã được công bố của Cỏ cứt
lợn, nhóm hoạt chất flavonoid là nhóm thể hiện hoạt tính kháng viêm đáng kể Đề tài được tiến
hành nhằm mục đích cung cấp cơ sở hóa thực vật cho việc sử dụng Cỏ cứt lợn trong điều trị viêm
xoang mũi Bột dược liệu được ngấm kiệt với ethanol 96% Dịch chiết ethanol toàn phần được
phân chia thành ba phân đoạn bằng cách lắc phân bố với ether dầu hỏa 30 – 60oC (PE),
dicloromethan (DCM) và ethyl aceat (EA) Các phân đoạn được định tính bằng thuốc thử
flavonoid và phân tích bằng sắc ký cột để tìm flavonoid tinh khiết Các chất được nhận dạng sơ
bộ trên TLC và phân tích bằng phổ UV-Vis và MS Kết quả cho thấy flavonoid tồn tại trong cả
ba phân đoạn, trong đó phân đoạn PE và DCM chứa các flavonoid đã methoxy hóa; phân lập
được bốn flavonoid AC1, AC2, AC7 và AC8, sơ bộ xác định được AC7 là một trimethoxyflavon
và AC8 là một tetramethoxyflavon
® 2018 Journal of Science and Technology - NTTU
Nhận 20.01.2018 Được duyệt 04.06.2018 Công bố 19.06.2018
Từ khóa Ageratum conyzoides,
cỏ cứt lợn, flavonoid, viêm xoang
1 Đặt vấn đề
Viêm xoang mũi là một bệnh phổ biến và đang là một thách
thức lớn trong việc chăm sóc sức khỏe ở nhiều quốc gia
Theo số liệu nghiên cứu mới đây, ở các nước Bắc Mỹ và
Châu Âu, bệnh viêm mũi xoang chiếm từ 4,5 đến 12% dân
số trưởng thành Không kể đến các chi phí y tế, chỉ tính riêng
chi phí tổn thất gián tiếp vì giảm năng suất lao động do mắc
bệnh viêm mũi xoang ở Mỹ là 12,8 tỷ USD trong năm 2016
[1] Ở Việt Nam chưa có thống kê rõ ràng về bệnh này nhưng
với đà tăng trưởng kinh tế và cường độ làm việc căng thẳng
như hiện nay, nguy cơ mắc bệnh viêm mũi xoang ngày càng
gia tăng
Cỏ cứt lợn (CCL) Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae, là
một dược liệu được sử dụng phổ biến từ lâu để chữa nhiều
bệnh, đặc biệt là viêm xoang, một loại bệnh mạn tính khó
điều trị dứt điểm bằng các phương pháp Tây y Loài này có
nguồn gốc ở Trung Mỹ và vùng Caribbean, phân bố từ vùng
đông nam Bắc Mỹ đến Trung Mỹ Ở châu Á, cây mọc khá
phổ biến ở vùng nam Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái
Lan, Ấn Độ và một số nơi khác Ở Việt Nam, CCL được xem
là loài cỏ dại quen thuộc, phân bố khắp nơi từ vùng núi cao
trên 1500 m đến các tỉnh vùng trung du và cả ở đồng bằng
Trữ lượng CCL ở Việt Nam vô cùng phong phú, ước tính có thể khai thác hàng ngàn tấn một năm [2,3,4]
Trong số các thành phần hóa học đã được công bố của Cỏ cứt lợn, nhóm hoạt chất flavonoid là nhóm thể hiện hoạt tính kháng viêm đáng kể Tác dụng chống viêm rõ rệt đối với giai đoạn cấp tính và bán cấp tính của phản ứng viêm thực nghiệm CCL có tác dụng giảm phù nề thực nghiệm chân chuột, giảm rỉ dịch màng phổi và giảm u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng[5] Ngoài ra, flavonoid còn có các tác dụng khác như chống oxy hóa, cải thiện tuần hoàn, giải độc gan, kháng khuẩn, hạ đường huyết…[6] CCL rất giàu các flavonoid đã methoxy hóa, có khoảng 21 flavonoid loại này đã được công bố, ví dụ: ageconyflavon A (5,6,7-trimethoxy-3′,4′-methylenedioxyflavon), ageconyflavon B (5,6,7,3′-tetramethoxy-4′-hydroxyflavon), ageconyflavon C (5,6,7,3′,5′-pentamethoxy-4′-hydroxyflavon) Ngoài ra còn
có các flavonoid khác như: 5′-methoxynobiletin, linderoflavon B, hexamethoxyflavon, eupalestin, nobiletin… Các polyhydroxyflavon: scutellarein-5, 6, 7, 4′-tetrahydroxyflavon, quercetin, quercetin-3-rhamanopiranosid, kaempferol, kaempferol-3-rhamnopiranosid và kaempferol-3,7-diglucopiranosid[5]
Trang 22 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu
CCL tươi được thu hái ở Đức Hòa, Long An (10-2016) Mẫu
được xác định bởi Tiến sĩ Bùi Mỹ Linh – Bộ môn Dược liệu,
Đại học Y Dược Tp.HCM Mẫu tươi được loại bỏ rễ, phơi
âm can đến khô, cắt khúc khoảng 5cm, xay thành bột thô
dùng để nghiên cứu hóa học (thử tinh khiết, phân tích sơ bộ
thành phần hóa thực vật, chiết xuất, phân lập các hợp chất)
Ethanol 96% công nghiệp, ether dầu hỏa (30-60°C),
dichloromethan, ethyl acetat, n-hexan, ether ethylic,
methanol, aceton, loại AR do Trung Quốc sản xuất Các
thuốc thử đều thuộc loại tinh khiết phân tích
Trang thiết bị nghiên cứu gồm có bình ngấm kiệt, máy cô
quay Rotavapor R-210 (Buchii) kèm bộ sinh hàn tự động
RW-2025G, tủ sấy, bếp cách thủy (Memmert), cân phân tích
BP 221S, cân xác định độ ẩm MA 45 (Sartorius), đèn UV 2
bước sóng 254nm, 365 nm (Vilber Lourmat CN – 15 – LC);
bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck),
silica gel cỡ hạt vừa Ф 0,03-0,063mm và cỡ hạt mịn Ф
0,015-0,04mm của Merck, phễu lọc thủy tinh xốp, bình sắc ký, cột
sắc ký bằng thủy tinh cùng các dụng cụ thông dụng khác
trong phòng thí nghiệm
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Chiết tách nguyên liệu thành các phân đoạn theo độ phân cực
tăng dần với các dung môi: ether ethylic, ethanol và nước
Thực hiện trên 15g dược liệu, chiết phân đoạn thu được 50ml
dịch ether, 50ml dịch chiết ethanol, 50ml dịch chiết nước
Xác định các nhóm hoạt chất trong từng dịch chiết bằng các
phản ứng hóa học đặc trưng
2.2.2 Chiết xuất và tách phân đoạn
Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi là cồn 96% Dịch chiết được xác định sơ bộ thành phần bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), xác định tạp, loại tạp và lắc phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần để chia thành các phân đoạn chất có thành phần đơn giản hơn phục
vụ cho quá trình khảo sát thành phần hóa học Theo dõi quá trình chiết tách phân đoạn bằng phản ứng sắc ký lớp mỏng, tìm phân đoạn giàu flavonoid
2.2.3 Phân tích các phân đoạn Dựa trên tính chất hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách với chất hấp phụ (pha tĩnh), dùng dung môi thích hợp (pha động) chạy qua pha tĩnh để giải hấp phụ, từ
đó tách ra từng phần các cấu tử trong hỗn hợp Sắc ký lớp mỏng được sử dùng để dò tìm hệ dung môi cho sắc ký cột và kiểm tra các phân đoạn cũng như các chất tinh khiết, các vết được phát hiện bằng ánh sáng thường, UV 365nm, UV 254nm, thuốc thử Vanilin – sulfuric (V-S) sấy hiện màu ở 110°C Sắc ký cột được dùng để tách hỗn hợp phức tạp thành các phần đơn giản hơn phục vụ cho tinh chế chất tinh khiết Các chất tinh khiết được đo phổ UV để tìm các chất cho phổ đặc trưng của flavonoid và phân tích khối phổ (MS) để sơ bộ xác định cấu trúc các flavonoid đã phân lập
3 Kết quả và bàn luận
3.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học cho thấy dược liệu Herba
Agerati chứa nhiều nhóm hợp chất: tinh dầu, flavonoid,
coumarin, triterpenoid, alkaloid, tannin, saponin, chất khử và các hợp chất polyuronic Flavonoid có mặt trong dịch chiết ether và dịch chiết cồn, không tìm thấy trong dịch chiết nước Trên cơ sở đó, cồn 96% được lựa chọn làm dung môi chiết xuất flavonoid từ dược liệu CCL
Bảng 1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học cỏ cứt lợn
Nhóm hợp chất Thuốc thử (TT) Cách thực hiện Phản ứng dương tính
Kết quả định tính trên các dịch chiết định tính Kết quả
chung
Dịch chiết ether
Dịch chiết cồn Dịch chiết nước
Carotenoid
H2SO4 Xanh lục ngả sang xanh
Trang 3Flavonoid Mg/HClđđ Dd có màu hồng tới đỏ ++ + Có
Glycosid tim
Không
Tanin
Có
Saponin
TT
Có Lắc mạnh dung dịch
Hợp chất
polyuronic Pha loãng với cồn 90% Tủa bông trắng – vàng
Ghi chú:
( ̶ ) : không có ( ± ) : không rõ ( + ) : có ít
Có thể có phản ứng nhưng không thực hiện Không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết
3.2 Chiết xuất và tách phân đoạn
3.2.1 Chiết xuất
Cân 2,5 kg dược liệu đã xay thành bột thô, tiến hành ngấm
kiệt thu được 25 lít dịch chiết màu xanh đậm, mùi thơm Tỷ
lệ dịch chiết và dược liệu là 10:1 Khảo sát sơ bộ thành phần
dịch chiết bằng TLC cho thấy trong dịch chiết còn chứa rất
nhiều diệp lục, là chất không có tác dụng kháng viêm mà đề
tài hướng tới nên tiến hành loại tạp diệp lục ra khỏi dịch chiết
bằng cách sử dụng 450g than hoạt Dịch chiết được cô thu
hồi dung môi thu được 700g cao và tách được 13 g tinh thể
muối vô cơ
3.2.2 Tách phân đoạn
Khảo sát tìm phân đoạn chứa flavonoid từ cao cồn thu được
ở trên bằng cách lắc phân bố lỏng-lỏng cao cồn với các dung
môi có độ phân cực tăng dần: ether dầu hỏa (30-60°C),
dichloromethan, ethyl acetat Các phân đoạn được cô quay
thu hồi dung môi thu được 2,5g cao A (hiệu suất 0,1%), 30g
cao B (hiệu suất 1,2%) và 25g cao C (hiệu suất 1,0%) Các
cao thu được đều cho phản ứng dương tính với thuốc thử định
tính flavonoid, phần dịch cồn sau chiết không cho các phản
ứng này
Dịch cồn
Lắc phân bố với ether dầu hỏa (30 – 60 °C)
Dịch EP
Dịch cồn
Lắc phân bố với dichloromethan
Dịch DCM
Dịch cồn
Lắc phân bố với ethyl acetat
Cao A 2,5 g
Cao B
30 g
Cao C
25 g
Thu hồi dung môi Thu hồi dung môi Thu hồi dung môi
Sơ đồ 1 Sơ đồ tách phân đoạn cao cồn với các dung môi có độ phân
cực tăng dần 3.2.3 Phân tích các phân đoạn Tiến hành sắc ký cột cổ điển (CC) cao A với pha động là DCM – EA; step gradient với tỷ lệ EA tăng dần thu được
19 phân đoạn (PĐ), tinh chế các phân đoạn thu được các
Trang 4tinh thể AC1, AC2, AC3, AC4, AC5 với khối lượng lần
lượt là 2, 5, 2, 1, 12 mg, trong đó AC2 có màu vàng nhạt, còn
các tinh thể khác đều màu trắng Cao B được sắc ký cột với
điều kiện tương tự cho ra 17 phân đoạn, tinh chế các phân
đoạn thu được các tinh thể gồm AC6 màu vàng nâu và AC7,
AC8 có màu trắng với khối lượng lần lượt là 2, 12, 15 mg
Quét phổ UV-Vis của các tinh thể thu được (AC1 đến AC8)
cho thấy phổ hấp thu của AC1, AC2, AC7, AC8 có dạng điển
hình của flavonoid[7], từ đó sơ bộ kết luận AC1, AC2, AC7,
AC8 là các flavonoid Tiến hành phân tích khối phổ (MS)
của hai tinh thể có khối lượng lớn là AC7 và AC8 cho thấy
phân tử khối lần lượt là 312 đvC và 342 đvC, có thể dự đoán
AC7 là một trimethoxyflavon (C18H16O5) và AC8 là một
tetramethoxy flavon C19H18O6 Cao C cho phản ứng rất rõ
với thuốc thử FeCl¬3¬, dự đoán trong cao C có chứa nhiều
thành phần flavonoid chưa bị methoxy hóa nên phân cực hơn
cao A và cao B
Riêng cao C chưa tìm được hệ dung môi cho khả năng tách
tốt nhất để tiến hành sắc ký cột nên chưa tiến hành phân tích
Tuy nhiên kết quả phân tích cao C bằng sắc ký lớp mỏng với
thuốc thử FeCl3 cho rất nhiều vết đậm màu chứng tỏ trong
cao C có chứa nhiều flavonoid dạng chưa methoxy hóa
Hình 1 Sắc ký đồ các chất phân lập từ cao A
DCM-EA (9:1) EA-MeOH (9:1)
Hình 2 Sắc ký đồ các chất phân lập từ cao B
Hình 3 Các tinh thể của AC1 (a), AC2 (b), AC7 (c) và AC8 (d)
Hình 4 Phổ UV-Vis của AC1 (a), AC2 (b), AC7 (c), AC8 (d)
Trang 5(a)
(b) Hình 5 Phổ MS của AC7 (a) và AC8 (b)
4 Kết luận và đề xuất
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong CCL thu hái ở tỉnh
Long An (Việt Nam) cho thấy trong cây có chứa nhiều nhóm
hoạt chất như flavonoid, anthocyanosid, proanthocyanidin,
coumarin, tinh dầu, triterpenoid tự do, alkaloid, tanin… Các
bằng chứng hóa học và quang phổ đã chứng minh được sự
tồn tại của nhóm hoạt chất flavonoid trong cao PE, DCM và
cao EA Hơn nữa, thông qua phân tích khối phổ (MS) có thể
dự đoán AC7 là một trimethoxyflavon và AC8 là một
tetramethoxyflavon Như vậy có thể kết luận CCL là một
dược liệu chứa flavonoid với hàm lượng tương đối cao và
tồn tại ở nhiều dạng, mà đặc biệt là dạng đã được
polymethoxy hóa Điều này hoàn toàn phù hợp với các tài
liệu đã công bố ở Việt Nam và trên thế giới Nguồn CCL này
có thể xem là nguồn cung cấp nguyên liệu phù hợp cho việc sản xuất các chế phẩm từ CCL ở Việt Nam
Đề tài vẫn chưa phân tích được thành phần flavonoid của cao
C do chưa tìm được dung môi thực sự phù hợp để tiến hành sắc ký cột Do đó, hướng nghiên cứu tiếp theo là tiếp tục tìm phương pháp để phân tích cao C Bên cạnh đó, tiến hành đo phổ NMR của AC7 và AC8 nhằm xác định chính xác công thức cấu tạo của hai chất này, qua đó có cơ sở để tiến hành định tính, định lượng và tiêu chuẩn hóa dược liệu
Lời cảm ơn
Tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Bùi Mỹ Linh và Th.S Nguyễn Thành Triết – ĐH Y dược Tp.HCM cùng tập thể Khoa Dược – ĐH Nguyễn Tất Thành đã hỗ trợ thực hiện đề tài
Trang 6Tài liệu tham khảo
1 DeConde AS, Soler ZM, Chronic rhinosinusitis: Epidemiology and burden of disease Am J Rhinol Allergy 30(2) (2016)
134
2 Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 2000, tr.43, 495
3 Đỗ Huy Bích và cs., Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam - tập 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003,
tr.375 – 377
4 Ming L.C (1999), Ageratum conyzoides: A tropical source of medicinal and agricultural products In: J Janick (ed.),
Perspectives on new crops and new uses ASHS Press, Alexandria, 1999, 469
5 Adewole L Okunade, Ageratum conyzoides L (Asteraceae), Fitoterapia, 73 (2002) 1
6 Ngô Vân Thu, Trần Hùng, Dược liệu - tập 1, NXB Giáo dục, Tp.HCM, 2010, tr 353
7 K.R Markham, Techniques of flavonoid identification, Academic Press, New York, 1982
Flavonoid in goat weed (Ageratum conyzoides L Asteraceae)
Nguyễn Thị Kim Liên
ĐH Nguyễn Tất Thành
ntklien@ntt.edu.vn
Abstract Goat weed (Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae), a popular folk medicine used to treat sinusitis Among the
published chemical constituents of the goat weed, the flavonoid group is a group that exhibits significant anti-inflammatory activity The study was conducted to provide chemical evidences for the use of goat weed in the treatment of sinusitis Dry plant powder was extracted with ethanol 96% The total ethanol extract was divided into three fractions by shaking with petroleum ether 30-60 oC (PE), dichloromethane (DCM) and ethyl aceat (EA) Segments were characterized by flavonoid reagents and analyzed by column chromatography for pure flavonoids The substances were preliminarily identified on TLC and analyzed by UV-Vis and MS spectra Results showed that flavonoids exist in all three segments, where PE and DCM segments contain methoxyflavones; The four flavonoids AC1, AC2, AC7 and AC8 were isolated, preliminarily determining that AC7 is a trimethoxyflavone and AC8 is a tetramethoxyflavone
Keywords Ageratum conyzoides, goat weed, flavonoid, sinusitis