Đang tải... (xem toàn văn)
Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae), là một dược liệu được dân gian sử dụng phổ biến để chữa bệnh viêm xoang. Trong số các thành phần hóa học đã được công bố của Cỏ cứt lợn, nhóm hoạt chất flavonoid là nhóm thể hiện hoạt tính kháng viêm đáng kể. Đề tài được tiến hành nhằm mục đích cung cấp cơ sở hóa thực vật cho việc sử dụng Cỏ cứt lợn trong điều trị viêm xoang mũi.
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 60 Khảo sát thành phần flavonoid Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides L Asteraceae) Nguyễn Thị Kim Liên Đại học Nguyễn Tất Thành ntklien@ntt.edu.vn Từ khóa Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae), là dược liệu được dân gian sử dụng phổ biến để chữa bệnh viêm xoang Trong số thành phần hóa học đã được cơng bố Cỏ cứt lợn, nhóm hoạt chất flavonoid nhóm thể hoạt tính kháng viêm đáng kể Đề tài được tiến hành nhằm mục đích cung cấp sở hóa thực vật cho việc sử dụng Cỏ cứt lợn điều trị viêm xoang mũi Bột dược liệu được ngấm kiệt với ethanol 96% Dịch chiết ethanol toàn phần được phân chia thành ba phân đoạn cách lắc phân bố với ether dầu hỏa 30 – 60oC (PE), dicloromethan (DCM) và ethyl aceat (EA) Các phân đoạn được định tính thuốc thử flavonoid phân tích sắc ký cột để tìm flavonoid tinh khiết Các chất được nhận dạng sơ TLC phân tích phổ UV-Vis MS Kết cho thấy flavonoid tồn ba phân đoạn, phân đoạn PE DCM chứa flavonoid đã methoxy hóa; phân lập được bốn flavonoid AC1, AC2, AC7 và AC8, sơ xác định được AC7 trimethoxyflavon AC8 tetramethoxyflavon ® 2018 Journal of Science and Technology - NTTU Đặt vấn đề Viêm xoang mũi là bệnh phổ biến và là thách thức lớn việc chăm sóc sức khỏe nhiều quốc gia Theo số liệu nghiên cứu đây, nước Bắc Mỹ và Châu Âu, bệnh viêm mũi xoang chiếm từ 4,5 đến 12% dân số trưởng thành Khơng kể đến chi phí y tế, tính riêng chi phí tổn thất gián tiếp vì giảm suất lao động mắc bệnh viêm mũi xoang Mỹ là 12,8 tỷ USD năm 2016 [1] Ở Việt Nam chưa có thống kê rõ ràng bệnh này với đà tăng trưởng kinh tế và cường độ làm việc căng thẳng nay, nguy mắc bệnh viêm mũi xoang ngày càng gia tăng Cỏ cứt lợn (CCL) Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae, là dược liệu được sử dụng phổ biến từ lâu để chữa nhiều bệnh, đặc biệt là viêm xoang, loại bệnh mạn tính khó điều trị dứt điểm phương pháp Tây y Loài này có nguồn gốc Trung Mỹ và vùng Caribbean, phân bố từ vùng đông nam Bắc Mỹ đến Trung Mỹ Ở châu Á, mọc phổ biến vùng nam Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Ấn Độ và số nơi khác Ở Việt Nam, CCL được xem là loài cỏ dại quen thuộc, phân bố khắp nơi từ vùng núi cao 1500 m đến tỉnh vùng trung du và đồng Đại học Nguyễn Tất Thành Nhận Được duyệt Cơng bố 20.01.2018 04.06.2018 19.06.2018 Từ khóa Ageratum conyzoides, cỏ cứt lợn, flavonoid, viêm xoang Trữ lượng CCL Việt Nam vơ phong phú, ước tính khai thác hàng ngàn năm [2,3,4] Trong số thành phần hóa học đã được cơng bố Cỏ cứt lợn, nhóm hoạt chất flavonoid là nhóm thể hoạt tính kháng viêm đáng kể Tác dụng chống viêm rõ rệt giai đoạn cấp tính và bán cấp tính phản ứng viêm thực nghiệm CCL có tác dụng giảm phù nề thực nghiệm chân chuột, giảm rỉ dịch màng phổi và giảm u hạt thực nghiệm chuột cống trắng[5] Ngồi ra, flavonoid có tác dụng khác chống oxy hóa, cải thiện tuần hoàn, giải độc gan, kháng khuẩn, hạ đường huyết…[6] CCL giàu flavonoid đã methoxy hóa, có khoảng 21 flavonoid loại này đã được cơng bố, ví dụ: ageconyflavon A (5,6,7-trimethoxy3′,4′-methylenedioxyflavon), ageconyflavon B (5,6,7,3′tetramethoxy-4′-hydroxyflavon), ageconyflavon C (5,6,7,3′,5′-pentamethoxy-4′-hydroxyflavon) Ngoài có flavonoid khác như: 5′-methoxynobiletin, linderoflavon B, hexamethoxyflavon, eupalestin, nobiletin… Các polyhydroxyflavon: scutellarein-5, 6, 7, 4′tetrahydroxyflavon, quercetin, quercetin-3rhamanopiranosid, kaempferol, kaempferol-3rhamnopiranosid kaempferol-3,7-diglucopiranosid[5] Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 61 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu CCL tươi được thu hái Đức Hòa, Long An (10-2016) Mẫu được xác định Tiến sĩ Bùi Mỹ Linh – Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược Tp.HCM Mẫu tươi được loại bỏ rễ, phơi âm can đến khô, cắt khúc khoảng 5cm, xay thành bột thô dùng để nghiên cứu hóa học (thử tinh khiết, phân tích sơ thành phần hóa thực vật, chiết xuất, phân lập hợp chất) Ethanol 96% công nghiệp, ether dầu hỏa (30-60°C), dichloromethan, ethyl acetat, n-hexan, ether ethylic, methanol, aceton, loại AR Trung Quốc sản xuất Các thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích Trang thiết bị nghiên cứu gồm có bình ngấm kiệt, máy quay Rotavapor R-210 (Buchii) kèm sinh hàn tự động RW-2025G, tủ sấy, bếp cách thủy (Memmert), cân phân tích BP 221S, cân xác định độ ẩm MA 45 (Sartorius), đèn UV bước sóng 254nm, 365 nm (Vilber Lourmat CN – 15 – LC); mỏng silica gel F254 tráng sẵn nhôm (Merck), silica gel cỡ hạt vừa Ф 0,03-0,063mm và cỡ hạt mịn Ф 0,0150,04mm Merck, phễu lọc thủy tinh xốp, bình sắc ký, cột sắc ký thủy tinh dụng cụ thông dụng khác phòng thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật Chiết tách nguyên liệu thành phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với dung môi: ether ethylic, ethanol và nước Thực 15g dược liệu, chiết phân đoạn thu được 50ml dịch ether, 50ml dịch chiết ethanol, 50ml dịch chiết nước Xác định nhóm hoạt chất dịch chiết phản ứng hóa học đặc trưng 2.2.2 Chiết xuất và tách phân đoạn Chiết xuất dược liệu phương pháp ngấm kiệt với dung môi là cồn 96% Dịch chiết được xác định sơ thành phần sắc ký lớp mỏng (TLC), xác định tạp, loại tạp và lắc phân đoạn với dung mơi có độ phân cực tăng dần để chia thành phân đoạn chất có thành phần đơn giản phục vụ cho trình khảo sát thành phần hóa học Theo dõi trình chiết tách phân đoạn phản ứng sắc ký lớp mỏng, tìm phân đoạn giàu flavonoid 2.2.3 Phân tích phân đoạn Dựa tính chất hấp phụ khác cấu tử hỗn hợp cần tách với chất hấp phụ (pha tĩnh), dùng dung mơi thích hợp (pha động) chạy qua pha tĩnh để giải hấp phụ, từ tách phần cấu tử hỗn hợp Sắc ký lớp mỏng được sử dùng để dò tìm hệ dung mơi cho sắc ký cột và kiểm tra phân đoạn chất tinh khiết, vết được phát ánh sáng thường, UV 365nm, UV 254nm, thuốc thử Vanilin – sulfuric (V-S) sấy màu 110°C Sắc ký cột được dùng để tách hỗn hợp phức tạp thành phần đơn giản phục vụ cho tinh chế chất tinh khiết Các chất tinh khiết được đo phổ UV để tìm chất cho phổ đặc trưng flavonoid và phân tích khối phổ (MS) để sơ xác định cấu trúc flavonoid đã phân lập Kết và bàn luận 3.1 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật Phân tích sơ thành phần hóa học cho thấy dược liệu Herba Agerati chứa nhiều nhóm hợp chất: tinh dầu, flavonoid, coumarin, triterpenoid, alkaloid, tannin, saponin, chất khử và hợp chất polyuronic Flavonoid có mặt dịch chiết ether và dịch chiết cồn, không tìm thấy dịch chiết nước Trên sở đó, cồn 96% được lựa chọn làm dung môi chiết xuất flavonoid từ dược liệu CCL Bảng Kết phân tích sơ thành phần hóa học cỏ cứt lợn Nhóm hợp chất Chất béo Th́c thử (TT) Cách thực Nhỏ dung dịch lên giấy, Vết mờ hơ nóng Kết định tính chung _ Không TT Carr-Price Xanh chuyển sang đỏ ̶ Không H2SO4 Xanh lục ngả sang xanh dương ̶ Không Bốc tới cắn Có mùi thơm +++ Có Đỏ nâu - tím, lớp có màu lục ++ Có Carotenoid Tinh dầu Phản ứng dương tính Kết định tính dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết Dịch chiết ether cồn nước Triterpenoid tự Liebermann-Burchard Alkaloid Các TT chung Kết tủa ++ ++ Coumarin Phát quang kiềm Phát quang mạnh ++ ++ Anthraglycosid KOH 10% Dd kiềm có màu đỏ ± + Có Có ± Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 62 + Tím ̶ ̶ TT đường 2-desoxy Đỏ mận ̶ ̶ Anthocyanosid HCl / KOH Đỏ / Xanh ± ̶ ± Proanthocyanin HCl/to Đỏ ± ± ± Dd FeCl3 Xanh rêu /xanh (Polyphenol) + ++ Dd gelatin muối Tủa bơng trắng (Tannin) + _ Có vòng tím nâu + Bọt bền ̶ ̶ + ̶ Có +++ ++ Có ++ Có Flavonoid Glycosid tim Mg/HClđđ Dd có màu hồng tới đỏ TT vòng lacton Tanin Saponin TT LiebermannBurchard Lắc mạnh dung dịch nước ++ đen Có Khơng Có Có Acid hữu Na2CO3 Sủi bọt Chất khử TT Fehling Tủa đỏ gạch Hợp chất polyuronic Pha loãng với cồn 90% Tủa trắng – vàng nâu Ghi chú: ( ̶ ) : khơng có ( ++ ) : có ( ± ) : khơng rõ ( +++) : có nhiều (+) : có ( ++++ ) : có nhiều Có thể có phản ứng khơng thực Khơng có mặt nhóm hợp chất dịch chiết 3.2 Chiết xuất và tách phân đoạn 3.2.1 Chiết xuất Cân 2,5 kg dược liệu đã xay thành bột thô, tiến hành ngấm kiệt thu được 25 lít dịch chiết màu xanh đậm, mùi thơm Tỷ lệ dịch chiết và dược liệu là 10:1 Khảo sát sơ thành phần dịch chiết TLC cho thấy dịch chiết chứa nhiều diệp lục, là chất khơng có tác dụng kháng viêm mà đề tài hướng tới nên tiến hành loại tạp diệp lục khỏi dịch chiết cách sử dụng 450g than hoạt Dịch chiết được cô thu hồi dung môi thu được 700g cao và tách được 13 g tinh thể muối vô 3.2.2 Tách phân đoạn Khảo sát tìm phân đoạn chứa flavonoid từ cao cồn thu được cách lắc phân bố lỏng-lỏng cao cồn với dung mơi có độ phân cực tăng dần: ether dầu hỏa (30-60°C), dichloromethan, ethyl acetat Các phân đoạn được cô quay thu hồi dung môi thu được 2,5g cao A (hiệu suất 0,1%), 30g cao B (hiệu suất 1,2%) và 25g cao C (hiệu suất 1,0%) Các cao thu được cho phản ứng dương tính với thuốc thử định tính flavonoid, phần dịch cồn sau chiết khơng cho phản ứng này Đại học Nguyễn Tất Thành Dịch cồn Lắc phân bố với ether dầu hỏa (30 – 60 °C) Dịch cồn Lắc phân bố với dichloromethan Dịch cồn Lắc phân bố với ethyl acetat Dịch EP Dịch DCM Thu hồi dung môi Cao A 2,5 g Thu hồi dung môi Cao B 30 g Dịch EA Dịch cồn Thu hồi dung môi Cao C 25 g Sơ đồ Sơ đồ tách phân đoạn cao cồn với dung mơi có độ phân cực tăng dần 3.2.3 Phân tích phân đoạn Tiến hành sắc ký cột cổ điển (CC) cao A với pha động là DCM – EA; step gradient với tỷ lệ EA tăng dần thu được 19 phân đoạn (PĐ), tinh chế phân đoạn thu được Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 63 tinh thể AC1, AC2, AC3, AC4, AC5 với khối lượng lần lượt là 2, 5, 2, 1, 12 mg, AC2 có màu vàng nhạt, tinh thể khác màu trắng Cao B được sắc ký cột với điều kiện tương tự cho 17 phân đoạn, tinh chế phân đoạn thu được tinh thể gồm AC6 màu vàng nâu và AC7, AC8 có màu trắng với khối lượng lần lượt là 2, 12, 15 mg Quét phổ UV-Vis tinh thể thu được (AC1 đến AC8) cho thấy phổ hấp thu AC1, AC2, AC7, AC8 có dạng điển hình flavonoid[7], từ sơ kết luận AC1, AC2, AC7, AC8 là flavonoid Tiến hành phân tích khối phổ (MS) hai tinh thể có khối lượng lớn là AC7 và AC8 cho thấy phân tử khối lần lượt là 312 đvC và 342 đvC, dự đoán AC7 là trimethoxyflavon (C18H16O5) và AC8 là tetramethoxy flavon C19H18O6 Cao C cho phản ứng rõ với thuốc thử FeCl¬3¬, dự đốn cao C có chứa nhiều thành phần flavonoid chưa bị methoxy hóa nên phân cực cao A cao B Riêng cao C chưa tìm được hệ dung môi cho khả tách tốt để tiến hành sắc ký cột nên chưa tiến hành phân tích Tuy nhiên kết phân tích cao C sắc ký lớp mỏng với thuốc thử FeCl3 cho nhiều vết đậm màu chứng tỏ cao C có chứa nhiều flavonoid dạng chưa methoxy hóa Hình Sắc ký đồ chất phân lập từ cao A DCM-EA (9:1) EA-MeOH (9:1) Hình Sắc ký đồ chất phân lập từ cao B (a) (b) (c) (d) Hình Các tinh thể AC1 (a), AC2 (b), AC7 (c) AC8 (d) (a) (b) (c) (d) Hình Phổ UV-Vis AC1 (a), AC2 (b), AC7 (c), AC8 (d) Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 64 (a) (b) Hình Phổ MS AC7 (a) AC8 (b) Kết luận và đề xuất Phân tích sơ thành phần hóa học CCL thu hái tỉnh Long An (Việt Nam) cho thấy có chứa nhiều nhóm hoạt chất flavonoid, anthocyanosid, proanthocyanidin, coumarin, tinh dầu, triterpenoid tự do, alkaloid, tanin… Các chứng hóa học và quang phổ đã chứng minh được sự tồn nhóm hoạt chất flavonoid cao PE, DCM và cao EA Hơn nữa, thông qua phân tích khối phổ (MS) dự đốn AC7 là trimethoxyflavon và AC8 là tetramethoxyflavon Như kết luận CCL là dược liệu chứa flavonoid với hàm lượng tương đối cao và tồn nhiều dạng, mà đặc biệt là dạng đã được polymethoxy hóa Điều này hoàn toàn phù hợp với tài liệu đã công bố Việt Nam và giới Nguồn CCL này Đại học Nguyễn Tất Thành xem là nguồn cung cấp nguyên liệu phù hợp cho việc sản xuất chế phẩm từ CCL Việt Nam Đề tài chưa phân tích được thành phần flavonoid cao C chưa tìm được dung môi thực sự phù hợp để tiến hành sắc ký cột Do đó, hướng nghiên cứu là tiếp tục tìm phương pháp để phân tích cao C Bên cạnh đó, tiến hành đo phổ NMR AC7 và AC8 nhằm xác định xác cơng thức cấu tạo hai chất này, qua có sở để tiến hành định tính, định lượng và tiêu chuẩn hóa dược liệu Lời cảm ơn Tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Bùi Mỹ Linh và Th.S Nguyễn Thành Triết – ĐH Y dược Tp.HCM tập thể Khoa Dược – ĐH Nguyễn Tất Thành đã hỗ trợ thực đề tài Tạp chí Khoa học & Công nghệ Số 65 Tài liệu tham khảo DeConde AS, Soler ZM, Chronic rhinosinusitis: Epidemiology and burden of disease Am J Rhinol Allergy 30(2) (2016) 134 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 2000, tr.43, 495 Đỗ Huy Bích và cs., Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam - tập 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003, tr.375 – 377 Ming L.C (1999), Ageratum conyzoides: A tropical source of medicinal and agricultural products In: J Janick (ed.), Perspectives on new crops and new uses ASHS Press, Alexandria, 1999, 469 Adewole L Okunade, Ageratum conyzoides L (Asteraceae), Fitoterapia, 73 (2002) Ngô Vân Thu, Trần Hùng, Dược liệu - tập 1, NXB Giáo dục, Tp.HCM, 2010, tr 353 K.R Markham, Techniques of flavonoid identification, Academic Press, New York, 1982 Flavonoid in goat weed (Ageratum conyzoides L Asteraceae) Nguyễn Thị Kim Liên ĐH Nguyễn Tất Thành ntklien@ntt.edu.vn Abstract Goat weed (Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae), a popular folk medicine used to treat sinusitis Among the published chemical constituents of the goat weed, the flavonoid group is a group that exhibits significant anti-inflammatory activity The study was conducted to provide chemical evidences for the use of goat weed in the treatment of sinusitis Dry plant powder was extracted with ethanol 96% The total ethanol extract was divided into three fractions by shaking with petroleum ether 30-60 oC (PE), dichloromethane (DCM) and ethyl aceat (EA) Segments were characterized by flavonoid reagents and analyzed by column chromatography for pure flavonoids The substances were preliminarily identified on TLC and analyzed by UV-Vis and MS spectra Results showed that flavonoids exist in all three segments, where PE and DCM segments contain methoxyflavones; The four flavonoids AC1, AC2, AC7 and AC8 were isolated, preliminarily determining that AC7 is a trimethoxyflavone and AC8 is a tetramethoxyflavone Keywords Ageratum conyzoides, goat weed, flavonoid, sinusitis Đại học Nguyễn Tất Thành ... New York, 1982 Flavonoid in goat weed (Ageratum conyzoides L Asteraceae) Nguyễn Thị Kim Liên ĐH Nguyễn Tất Thành ntklien@ntt.edu.vn Abstract Goat weed (Ageratum conyzoides (L.) Asteraceae), a... sơ thành phần sắc ký lớp mỏng (TLC), xác định tạp, loại tạp và lắc phân đoạn với dung mơi có độ phân cực tăng dần để chia thành phân đoạn chất có thành phần đơn giản phục vụ cho trình khảo. .. kg dược liệu đã xay thành bột thô, tiến hành ngấm kiệt thu được 25 lít dịch chiết màu xanh đậm, mùi thơm Tỷ lệ dịch chiết và dược liệu là 10:1 Khảo sát sơ thành phần dịch chiết TLC cho