phát triển qui trình mrtpcr phát hiện yhv (yellow head virus), gav (gillassociated virus) và gen βactin trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LÊ HỮU THÔI PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH mRT-PCR PHÁT HIỆN YHV (Yellow Head virus), virus) VÀ GEN β-ACTIN Trung tâm HọcGAV liệu (Gill-associated ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LÊ HỮU THÔI PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH mRT-PCR PHÁT HIỆN YHV (Yellow Head virus), GAV (Gill-associated virus) VÀ GEN β-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH TRẦN VIỆT TIÊN 2008 LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Đặng Thị Hoàng Oanh chị Trần Việt Tiên tận tình bảo giúp đỡ suốt trình thực đề tài luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô, anh chị Bộ môn Sinh Học Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp Chân thành cám ơn bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản Nuôi Trồng Thủy Sản K30 gắn bó, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian học tập thực đề tài Cuối lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập trường thực đề tài Sinh viên thực LÊ HỮU THÔI Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu i TÓM TẮT Đề tài thực nhằm phát triển qui trình mRT-PCR để phát đồng thời YHV, GAV -actin xác định khả ứng dụng qui trình nghiên cứu YHV GAV tôm sú Sau thực qui trình RT-PCR Cowley et al (2002) với mẫu dương tính với YHV cho kết vị trí 750 bp qui trình RT-PCR Cowley et al (2000) với mẫu dương tính với GAV cho kết vị trí 317 bp Sau tiếp tục phát triển hai qui trình RT-PCR phát đồng thời YHV, gen β-actin cho kết đồng thời hai vạch vị trí 750 bp (YHV) 216 bp (β-actin) GAV, gen β-actin cho kết đồng thời hai vạch 317 bp (GAV) 216 bp (β-actin) Trên sở kết đạt được, kết hợp qui trình RT-PCR phát YHV Cowley et al (2002), qui trình RT-PCR phát GAV Cowley et al (2000) qui trình mRT-PCR phát -actin đồng thời YHV, GAV gen -actin Kết bước phát YHV (750 bp) β-actin (216 bp) bước phát GAV (317 bp) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu ii MỤC LỤC Trung LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH viii Chương I: GIỚI THIỆU Chương II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình nuôi tôm 2.1.1 Trên giới 2.1.2 Việt Nam 2.2 Tổng quan tình hình dịch bệnh tôm 2.2.1 Trên giới 2.2.2 Việt Nam 2.3 Sơ lược virus gây bệnh đầu vàng (YHV) bệnh liên quan đến mang (GAV) 2.3.1 Tác nhân gây bệnh 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 2.3.3 Phân bố lan truyền bệnh 10 tâm Học liệu Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 2.3.4 GiaiĐH đoạnCần cảm nhiễm 10 2.3.5 Phòng xử lý bệnh 11 2.4 Sơ lược gen nội sinh -actin tôm .11 2.5 Phương pháp PCR 12 2.5.1 Nguyên tắc 12 2.5.2 Phương pháp RT-PCR .13 2.5.2.1 Phương pháp tách chiết RNA .13 2.5.2.2 Phương pháp RT-PCR 13 2.5.2.3 Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp RT-PCR .14 2.5.2.4 Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp mRT-PCR 15 2.5.3 Đối chứng 17 2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng 17 2.5.5 Hạn chế .18 2.5.6 Ứng dụng phương pháp PCR thuỷ sản 18 Chương III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .20 3.2 Dụng cụ hóa chất 20 3.2.1 Dụng cụ .20 3.2.2 Hóa chất 20 iii Trung 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu .22 3.3.2 Ly trích RNA 22 3.3.3 Phương pháp đo hàm lượng ARN 22 3.3.4 Tạo cDNA 23 3.3.5 Phương pháp RT-PCR phát YHV .24 3.3.5.1 Khuếch đại ADN 24 3.3.5.2 Chạy điện di 25 3.3.5.3 Đọc kết 25 3.3.6 Phương pháp mRT-PCR phát YHV gen -actin tôm 26 3.3.6.1 Khuếch đại ADN 26 3.3.6.2 Chạy điện di 26 3.3.6.3 Đọc kết 26 3.3.7 Phương pháp RT-PCR phát GAV 27 3.3.7.1 Khuếch đại ADN 27 3.3.7.2 Chạy điện di 28 3.3.7.3 Đọc kết 28 3.3.8 Phương pháp mRT-PCR phát GAV gen -actin tôm 29 3.3.8.1 Khuếch đại ADN 29 ChạyCần điện diThơ 30 tâm Học3.3.8.2 liệu ĐH @ Tài liệu học tập nghiên 3.3.8.3 Đọc kết 30 3.3.9 Phương pháp mRT-PCR phát YHV, GAV gen -actin tôm .31 3.3.9.1 Khuếch đại ADN 31 3.3.9.2 Chạy điện di 31 3.3.9.3 Đọc kết 31 Chương IV:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Thực qui trình RT-PCR phát YHV 33 4.2 Phát gen -actin theo qui trình phát YHV 33 4.3 Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV gen -actin 35 4.4 Thực qui trình RT-PCR phát GAV 37 4.5 Thực qui trình phát gen -actin theo qui trình phát GAV 37 4.6 Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV gen -actin 39 4.7 Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV, GAV gen -actin .40 iv cứu 4.8 Ứng dụng 43 4.8.1 Ứng dụng qui trình mRT-PCR phát YHV tôm giống 43 4.8.1 Ứng dụng qui trình mRT-PCR phát GAV tôm giống 44 Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề xuất .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .48 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu v DANH SÁCH BẢNG Trung Bảng 2.1 Diện tích (ha) sản lượng (tấn) tôm sú nuôi Việt Nam (Bộ Thuỷ sản, 2004) Bảng 2.2 Diện tích (ha) sản lượng (tấn) tôm sú nuôi ĐBSCL năm 2006 2007 (Lê Xuân Sinh, 2007) Bảng 3.1: Trình tự đoạn mồi bước sử dụng qui trình RT-PCR phát GAV (Cowley et al., 2000) 21 Bảng 3.2: Trình tự đoạn mồi bước sử dụng qui trình RT-PCR phát GAV (Cowley et al., 2000) 21 Bảng 3.3: Trình tự đoạn mồi sử dụng qui trình RT-PCR phát gen -actin (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007) 21 Bảng 3.4: Trình tự đoạn mồi sử dụng qui trình RT-PCR phát YHV (Cowley et al., 2002) 21 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất tham gia vào trình trộn hỗn hợp A tạo cDNA 23 Bảng 3.6: Thành phần hóa chất tham gia vào trình trộn hỗn hợp B tạo cDNA 23 3.7:liệu Thành hóa Thơ chất tham gia vào phản ứngtập khuếch qui cứu tâmBảng Học ĐHphần Cần @ Tài liệu học vàđại nghiên trình phát YHV Cowley (2002) .24 Bảng 3.8: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát YHV gen -actin tôm 26 Bảng 3.9: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước qui trình phát GAV Cowley et al (2000) .27 Bảng 3.10: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước qui trình phát GAV Cowley et al (2000) 27 Bảng 3.11: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước qui trình phát GAV gen -actin 29 Bảng 3.12: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước qui trình phát GAV gen β-actin 30 Bảng 3.13: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát đồng thời YHV, GAV (bước 1) gen -actin tôm 31 Bảng 4.1: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát gen -actin tôm 34 Bảng 4.2: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát YHV gen -actin tôm 35 vi Bảng 4.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát gen -actin tôm 38 Bảng 4.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát đồng thời YHV, GAV (bước 1) gen -actin tôm 41 Bảng 4.5: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát đồng thời YHV, GAV (bước 2) gen -actin tôm 42 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu vii DANH SÁCH HÌNH Trung Hình 2.1: Tôm sú bị bệnh đầu vàng (Bùi Quang Tề, 2006) 17 Hình 2.2: Kết RT-PCR cho thấy khả ức chế tái YHV (Yodmuang et al., 2006) 12 Hình 2.3: Nguyên lý kỹ thuật PCR (Nguyễn Viết Khuê, 2006)…………… 21 Hình 2.4: Kết mRT-PCR phát đồng thời WSSV TSV (Tsai et al 2002) 16 Hình 3.1: Kết chạy PCR phát GAV theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) 28 Hình 4.1: Kết chạy PCR phát YHV theo qui trình RT-PCR 33 Hình 4.3: Kết chạy PCR phát YHV -actin tôm theo qui trình mRT-PCR .36 Hình 4.4: Kết chạy PCR phát GAV theo qui trình RT-PCR 37 Hình 4.5: Kết chạy PCR phát gen -actin theo qui trình phát GAV .38 Hình 4.6: Kết chạy PCR phát GAV -actin tôm theo qui trình mRT-PCR .40 tâmHình Học ĐHchạy Cần Thơ liệu học tập nghiên 4.7:liệu Kết PCR phát @ hiệnTài YHV, GAV (bước 1) và -actin cứu tôm theo qui trình mRT-PCR 41 Hình 4.8: Kết chạy PCR phát YHV, GAV (bước 2) -actin tôm theo qui trình mRT-PCR 42 Hình 4.9: Kết chạy PCR phát YHV 18 mẫu tôm giống theo qui trình mRT-PCR .43 Hình 4.10: Kết chạy PCR phát GAV 18 mẫu tôm giống theo qui trình mRT-PCR .45 viii 4.4 Thực qui trình RT-PCR phát GAV (Cowley et al., 2000) M (-) (+) 1000 bp 500 bp 317 bp 100 bp Hình 4.4: Kết chạy PCR phát GAV theo qui trình RT-PCR Giếng M: thang đo Trung tâmGiếng Học(-):liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu đối chứng âm Giếng (+): đối chứng dương Kết điện di cho thấy phát GAV vị trí 317 bp (Hình 4.4), kết hoàn toàn phù hợp với kết Cowley et al (2000) 4.5 Thực qui trình phát gen -actin theo qui trình phát GAV Cowley et al (2000) Sau thực qui trình phát GAV, qui trình phát gen -actin tôm theo qui trình phát GAV thực nhằm thực qui trình phát đồng thời GAV gen -actin 37 Bảng 4.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát gen -actin tôm Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25 mM) dNTP (10 mM) Taq DNA polymerase 5UI/l Nước Mồi -actin F (10 M) Mồi -actin R (10 M) cDNA Tổng 2.5 l l 0.5 l 0.25 l 14.25 l 1.25 l 1.25 l l 25 l M (-) (+) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 1000 bp 500 bp 216 bp 100 bp Hình 4.5: Kết chạy PCR phát gen -actin theo qui trình phát GAV Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm Giếng (+): đối chứng dương Kết điện di cho thấy phát gen -actin vị trí 216 bp (Hình 4.5) Từ kết ta thực tiếp qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV gen -actin tôm để ứng dụng kiểm soát chất lượng ARN tôm trường hợp âm tính giả xét nghiệm GAV tôm 38 4.6 Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV gen actin Trên sở qui trình RT-PCR phát GAV (Cowley et al., 2000) qui trình phát gen -actin (Oanh, 2007), qui trình mRT-PCR kết hợp hai qui trình thực để phát đồng thời GAV -actin nhằm kiểm soát chất lượng ARN tôm trình phát GAV kiểm soát trường hợp âm tính giả GAV Qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV -actin thực Trần Việt Tiên (2007) Kết phát GAV vị trí 317 bp -actin vị trí 216 bp Tuy nhiên sản phẩm điện di chưa rõ hai vạch chưa tách rời Qui trình tiếp tục thực nhằm chuẩn hóa qui trình thực để phát rõ kiểm tra lại tính ổn định qui trình Trong trình chuẩn hóa thành phần hóa chất so với qui trình thực thay đổi Tuy nhiên, có số thay đổi chu kì nhiệt Điều kiện phản ứng Trung tâmTrước Họckhiliệu ĐH học hóa tập nghiên cứu chuẩn hóa Cần Thơ @ Tài Sauliệu chuẩn 940C phút 940C phút Sau 940C 30 giây Sau 940C 25 giây 580C 30 giây 580C 30 giây 720C 45 giây 720C 30 giây Lặp lại chu kì 35 lần Lặp lại chu kì 30 lần 720C phút 720C phút 200C 10 phút 200C 20 phút 39 M (-) (+) 1000 bp 500 bp 317 bp 216 bp 100 bp Hình 4.6: Kết chạy PCR phát GAV -actin tôm theo qui trình mRT-PCR Trung Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm tâmGiếng Học(+):liệu ĐH Cần đối chứng dươngThơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Kết điện di cho thấy thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV -actin hai vạch tương vị trí 317 bp (GAV) 216 bp (-actin) Kết tối ưu qui trình tương đối tốt qui trình thực hiện, phân biệt rõ ràng hai vạch 317 bp (GAV) 216 bp (-actin) Ngoài ra, so với qui trình trước qui trình sau chuẩn hóa thời gian thực phản ứng rút ngắn Kết cho thấy chu kì nhiệt có ảnh hưởng lớn đến trình sản phẩm khuếch đại Từ kết ứng dụng qui trình để phát GAV gen -actin tôm, đồng thời kiểm soát trường hợp âm tính giả chất lượng ARN tôm trình phát GAV thông qua gen nội sinh actin tôm 4.7 Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV, GAV gen -actin Từ kết đạt từ qui trình qui trình mRT-PCR thực nhằm phát đồng thời YHV, GAV -actin 40 Bảng 4.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát đồng thời YHV, GAV (bước 1) gen -actin tôm Thể tích Hoá chất/Dung dịch Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25 mM) dNTP (10 mM) Taq DNA polymerase 5UI/l Nước Mồi YH31 F/R (10 M) Mồi GAV5/6 (50 M) Mồi -actin F (10 M) Mồi -actin R (10 M) cDNA (YHV) cDNA (GAV) Tổng (+) (-) 2.5 l l 0.5 l 0.25 l 8.5 l 0.25 l 2.5 l 1.25 l 1.25 l l l 25 l M Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 1000 bp 750 bp 500 bp 216 bp 100 bp Hình 4.7: Kết chạy PCR phát YHV, GAV (bước 1) -actin tôm theo qui trình mRT-PCR Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm Giếng (+): đối chứng dương 41 Bảng 4.5: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại qui trình phát đồng thời YHV, GAV (bước 2) gen -actin tôm Thể tích Hoá chất/Dung dịch Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25 mM) dNTP (10 mM) Taq DNA polymerase 5UI/l Nước Mồi YH31 F/R (10 M) Mồi GAV 1/2 (25 M) Mồi -actin F (10 M) Mồi -actin R (10 M) Sản phẩm PCR bước Tổng M 2.5 l l 0.5 l 0.25 l 9.5 l 0.25 l 2.5 l 1.25 l 1.25 l l 25 l (-) (+) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 317 bp Hình 4.8: Kết chạy PCR phát YHV, GAV (bước 2) -actin tôm theo qui trình mRT-PCR Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm Giếng (+): đối chứng dương Kết chạy điện di cho thấy bước phát YHV (750 bp) -actin (216 bp) bước phát GAV (317 bp) Mặt dù qua 42 bước thực phản ứng phát YHV, GAV -actin nhiên chưa phát ba bước khuếch đại Ở bước phát GAV phù hợp với kết thực với qui trình RT-PCR phát GAV không phát YHV -actin Qui trình cần tiếp tục chuẩn hóa tối ưu để phát đồng thời YHV, GAV -actin bước khuếch đại 4.8 Ứng dụng 4.8.1 Ứng dụng qui trình mRT-PCR phát YHV tôm giống Sau thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV (750 bp) -actin (216 bp) Qui trình ứng dụng vào điều kiện thực nghiệm thực xét nghiệm YHV tôm giống 18 mẫu tôm giống ly trích, tạo cDNA thực qui trình mRT-PCR (-) (+) M 10 M 1000 bp Trung tâm750Học bp liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 500 bp 216 bp 100 bp (-) (+) 11 12 13 M 14 15 16 17 18 Hình 4.9: Kết chạy PCR phát YHV 18 mẫu tôm giống theo qui trình mRT-PCR 43 M Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm Giếng (+): đối chứng dương YHV Giếng 1: mẫu H7 Giếng 2: mẫu H8 Giếng 3: mẫu H10 Giếng 4: mẫu H12 Giếng 5: mẫu 5.4 Giếng 6: mẫu 5.5 Giếng 7: mẫu T25H7 Giếng 8: mẫu T25H8 Giếng 9: mẫu T29H18 Giếng 10: mẫu T29H19 Giếng 11: mẫu Giếng 12: mẫu Giếng 13: mẫu Giếng 14: mẫu Giếng 15: mẫu Giếng 16: mẫu Giếng 17: mẫu Giếng 18: mẫu Kết xét nghiệm YHV 18 mẫu tôm giống theo qui trình mRT-PCR cho thấy: đối chứng âm không vạch chứng tỏ trình xét nghiệm mẫu không bị tạp nhiễm; đối chứng dương đồng thời hai vạch tương ứng vị trí 750 bp (YHV) 216 bp (-actin) chứng tỏ phản ứng có mạch khuôn ADN đặc hiệu với mồi; 18 mẫu tôm xét nghiệm vạch vị trí 216 bp (actin) mẫu vạch vị trí 750 bp (YHV) chứng tỏ 18 mẫu âm tính với YHV kết cho thấy qui trình mRT-PCR ứng dụng tốt cho việc phát Trung tâmQua Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu YHV, mẫu tôm âm tính với YHV phát gen actin chứng tỏ mẫu âm tính thật với YHV 4.8.1 Ứng dụng qui trình mRT-PCR phát GAV tôm giống Sau thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV (317 bp) -actin (216 bp) Qui trình ứng dụng vào điều kiện thực nghiệm thực xét nghiệm GAV tôm giống 18 mẫu tôm giống ly trích, tạo cDNA thực qui trình mRT-PCR M (-) (+) (-) (+1) 1000 bp 500 bp 317 bp 216 bp 100 bp B A 44 M (-) (+) 10 (-) (+2) A M (-) 10 M 13 M B (+) 11 12 (-) (+3) 11 12 13 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu A (-) B (+) 14 15 16 17 18 M (-) (+4) 14 15 16 17 A B Hình 4.10: Kết chạy PCR phát GAV 18 mẫu tôm giống theo qui trình mRT-PCR 45 18 A: bước B: bước Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm Giếng (+): đối chứng dương GAV Giếng 1: mẫu H7 Giếng 2: mẫu H8 Giếng 3: mẫu H10 Giếng 4: mẫu H12 Giếng 5: mẫu 5.4 Giếng 6: mẫu 5.5 Giếng 7: mẫu T25H7 Giếng 8: mẫu T25H8 Trung Giếng 9: mẫu T29H18 Giếng 10: mẫu T29H19 Giếng 11: mẫu Giếng 12: mẫu Giếng 13: mẫu Giếng 14: mẫu Giếng 15: mẫu Giếng 16: mẫu Giếng 17: mẫu Giếng 18: mẫu Kết xét nghiệm GAV 18 mẫu tôm giống theo qui trình mRT-PCR cho thấy bước (Hình 4.10B): đối chứng âm không vạch chứng tỏ trình xét nghiệm mẫu không bị tạp nhiễm; đối chứng dương (+1) (+3) đồng thời hai vạch tương ứng vị trí 317 bp (GAV) 216 bp (-actin), đối chứng dương (+2) (+4) vạch 317 bp; giếng 1, 3, 4, 5, 7, tâm10,Học liệu Cần liệu tập 12 vịĐH trí 317 bp làThơ những@ mẫuTài dương tínhhọc với GAV, trongnghiên giếng cứu 3, 12 có thêm vạch vị trí 216 bp; mẫu lại âm tính với GAV có giếng vạch 216 bp Kết cho thấy qui trình mRT-PCR mặt dù khuếch đại phát GAV -actin số mẫu chưa phát -actin, điều cho thấy qui trình chưa ổn định, cần chuẩn hóa lại qui trình ứng dụng nhiều mẫu để ứng dụng qui trình điều kiện phòng thí nghiệm 46 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Thực qui trình RT-PCR phát YHV theo Cowley et al (2002), sản phẩm PCR cho kết 750 bp - Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV -actin, sản phẩm PCR cho kết vị trí 750 bp (YHV) 216 bp (-actin) Kết hợp với kết xét nghiệm tôm giống cho thấy khả ứng dụng tốt qui trình nhằm kiểm soát trường hợp âm tính giả - Thực qui trình RT-PCR phát GAV theo Cowley et al (2000), sản phẩm PCR cho kết 317 bp - Tối ưu qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV -actin, sản phẩm PCR cho kết đồng thời hai vạch GAV (317 bp) -actin (216 bp) - Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV, GAV -actin, sản phẩm PCR cho kết hai vạch 750 bp (YHV) 216 bp (-actin) bước 317 bp (GAV) bước Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 5.2 Đề xuất - Ứng dụng qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV -actin nhiều mẫu để kiểm tra tính ổn định qui trình để ứng dụng qui trình điều kiện phòng thí nghiệm - Cần tối ưu qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV -actin nhằm tăng khả ứng dụng qui trình - Tiếp tục thực chuẩn hóa qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV, GAV -actin 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO BANGKOK POST 2002 2001Year-end Economic Review Available form http://www.bangkokPost.net/yearend 2001/trade.html (ngày truy cập 24/05/2008) Boonyaratpalin, S., K Supamattaya, J Kasornchandra, S Direkbusaracom, U Aekpanithanpong, C Chantanachookin 1993 Non-occluded baculolike virus, the causative agent of yellow-head disease in the black tiger shrimp (Penaeus monodon) Fish Pathol 28: 103-109 Bui Dinh Chung 2001 The Research Institute of Marine Products, Hai Phong Bùi Quang Tề, 2006 Giáo trình Bệnh học thuỷ sản NXB Nông Nghiệp Các tỉnh ĐBSCL: Tôm chết diện rộng, giá giảm mạnh http://www.giacavattu.com.vn/website/chitiet.asp?NewsId=19778 truy cập 24/05/2008) Trung (Ngày Chantanachookin, C., S Boonyaratpalin, J Kasornchandra, D Sataporn, U Aekpanithanpong, Supamattaya, Sriurairatana, T.W.và Flegel 1993 cứu tâm Học liệu ĐH CầnK Thơ @ TàiS liệu học tập nghiên Histology and ultrastructure reveal a new granulosis-like virus in Penaeus monodon affected by yellow-head disease Dis Aquat Org 17: 145-157 Cowley, J.A., C.M Dimmock, C Wongteerasupaya, V Bonsaeng, S Panyim, P.J Walker 1999 Yellow head virus from Thailand and gillassociated virus from Australia are closely related but distinct prawn viruses Dis Aquat Org 36: 153-157 Cowley, J.A., C.M Dimmock, K.M Spann, P.J Walker 2000 Detection of Australian gill-associated virus (GAV) and lymphoid organ virus (LOV) of Penaeus monodon by RT-nested PCR Vol 39:159-167 Cowley, J.A., M.R Hall, L.C Cadogan, K.M Spann, P.J Walker 2002 Vertical transmission of gill-associated virus (GAV) in the black tiger prawn Penaeus monodon Dis Aquat Org 50: 95-104 10 Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007 Giáo trình Nguyên lý Kỹ thuật chẩn đoán bệnh Thuỷ sản 11 ĐBSCL: Tôm chết hàng loạt - thực trạng giải pháp http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&NewsID=23430635 48 (Cập nhật: 24/05/2008) 12 FAO, 2005 Hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật thủy sản châu Á Nhà xuất Nông nghiệp 13 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục 14 Khánh Phương, 2008 Vụ nuôi tôm 2008: Lại đau đầu với chất lượng giống Báo kinh tế nông thôn http://www.kinhtenongthon.com.vn/printContent.aspx?ID=10595 truy cập 24/05/2008) (Ngày 15 Khawsak, P., W Deesukon, P Chaivisuthangkura, W Sukhumsirichart 2008 Multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of six viruses of penaeid shrimp Mol Cell Probes 22(3):177-83 16 Lê Văn Quang, 2005 Đánh giá suy thoái ô nhiễm môi trường (nước, đất bùn đáy) từ hoạt động nuôi thuỷ sản công nghiệp bán công nghiệp vùng ven biển tỉnh Trà Vinh 17 Lê Xuân Sinh; Huỳnh Văn Hiền; Đỗ Minh Chung & Đặng Thị Phượng 2007 Tóm tắt kết nuôi trồng thủy sản tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long 2007 kế hoạch năm 2008 Trung tâm18.Học liệuD.V ĐH1996 Cần Thơ @ofTài liệu học tập procedures nghiên cứu Lightner, A handbook pathology and diagnostic for disease of penaeid shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge 19 Limsuwan, C 1991 Handbook for cultivation of black tiger prawns Tansefakit Co Ltd, Bangkok 20 Mai Phương-Hà Yên, 2003 Báo động đỏ bệnh tôm nuôi http://www.vnn.vn/kinhte/toancanh/2003/39177 (Ngày truy cập 24/05/2008) 21 Nadala, E.C.B., L.M Tapay, S Cao, P.C Loh 1997a Yellow-head virus: a rhabdovirus-like pathogen of penaeid shrimp Dis Aquat Org 31: 141-146 22 Nguyễn Quốc Tuấn, 2006 Nghiên cứu mối quan hệ mức độ đầu tư nông hộ môi trường ao nuôi tôm bán thâm canh xã Long Hoà, huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh 23 Nguyễn Thanh Phương Trần Ngọc Hải, 2004 Kỹ thuật nuôi sản xuất giống thủy sản nước lợ 24 Nguyễn Viết Khuê, 2006 Chẩn đoán bệnh động vật thuỷ sản phương pháp PCR 49 25 Phan Lữ Hoàng Hà, 2002 Đồng sông Cửu Long: Lao đao mùa tôm Báo Sài Gòn Giải Phóng http://www.vietlinh.net.nefirms.com/docbao/2002/020316s4.htm truy cập 24/05/2008) (Ngày 26 Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thùy Dương.2003 Phát virut gây bệnh đầu vàng tôm sú kỹ thuật RT-PCR Tạp chí di truyền ứng dụng Số 27 Spann, K.M., J.E Vickers, R.J.G Lester 1995 Lymphoid organ virus of Penaeus monodon from Australia Dis Aquat Org 23: 127-134 28 Tạp chí Thủy sản, 2004 29 Tấn Đức, 2005 Tôm chết hàng loạt ĐBSCL Báo Thanh Niên http://www.thanhnien.com.vn/kinhte/2005/5/18/110081.tno (Ngày truy cập 24/05/2008) 30 Toshiaki 2003 Disease Problem in Prawn Farming 31 Trần Thị Xô Nguyễn Thị Lan, 2005 Cơ sở di truyền công nghệ gen Nhà xuất khoa học kỹ thuật 32 Trần Thị Tuyết Hoa, 2006 Bài giảng sinh học phân tử Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 33 Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng bệnh virus 34 Trần Việt Tiên, 2007 Ứng dụng kỹ thuật PCR RT-PCR chẩn đoán WSSV (White Spot Syndrom virus) GAV (Gill-associated virus) tôm sú (Penaeus monodon) Đồng Bằng Sông Cửu Long 35 Tsai, J.M., L.J Shiau, H.H.Lee, P.W.Y Chan, C.Y Lin 2002 Simultaneous detection of white spot syndrome virus (WSSV) and Taura Syndrom virus (TSV) by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in Pacific white Shrimp Penaeus vannamei Dis Aquat Org 50: 9-12 36 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học thuỷ sản 37 Vega, E.D.L, B.M Degnan,M.R Hall, J.A Cowley, K.J Wilson 2004 Quantitative real-time RT-PCR demonstrates that handling stress can lead to rapid increases of gill-associated virus (GAV) infection levels in Penaeus monodon Dis Aquat Org 59: 195-203 38 Võ Thị Thương Lan, 2006 Giáo trình sinh học phân tử tế bào ứng dụng Nhà xuất giáo dục 50 39 Walker, P.J., J.A Cowley, K.M Spann, R.A.J Hodgson, M.R Hall, B Withyachumnarnkul 2001 Yellow head complex viruses: transmission cycles and topographical distribution in the Asia-Pacific region The World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, p 227-237 40 Wongteerasupaya, C., S Sriurairatana, J.E Vicker, A Akrajamorn, V Boonsaeng, S Panyim, A Tassanakajon, B Qithyachumnarnjul, T.W Flegel 1995 Yellow-head virus of Penaeus monodon is an RNA virus Dis Aquat Org 22: 45-50 41 Wongteerasupaya, C., W Tongchuea, V Bonsaeng, S Panyim, A Tassanakajon, B Withyachumnarnkul, T.W Flegel 1997 Detection of yellow head virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplifivation Dis Aquat Org 31: 181-186 42 Wongteerasupaya, C., V Boonsaeng, W Tongchuea, N Sitidilokratana, P Kanchanaphum, R Klinputsorn, S Panyim 1998 Multiplex PCR for Detection of Yellow-Head Virus and White Spot Syndrome Virus in Penaeus monodon Trung 43 Xie, Z., Y Pang, X Deng, X Tang, J Liu, Z Lu, M.I Khan 2007 A multiplex RT-PCR for simultaneous differentiation of three viral pathogens tâm Học liệu shrimp ĐH Cần ThơOrg @76:Tài liệu học tập nghiên cứu of penaeid Dis Aquat 77-80 44 Yodmuang, S., W Tirasophon, Y Roshorm, W Chinnirunvong, S Panyim 2006 YHV-protease dsRNA inhibits YHV replication in Penaeua monodon and prevents mortality BBRC 341: 351-356 45 Zhu, X.J., Z.M Dai, J Liu, W.J Yang 2005 Actin gene in prawn, Macrobrachium rosenbergii: Characteristics and differential tissue expression during embryonic development CBP, Part B 140: 599-605 51 [...]... qui trình RT-PCR phát hiện YHV (Cowley, 2000) - Thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện YHV và gen -actin của tôm - Tối ưu qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và gen -actin của tôm - Thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện YHV, GAV và gen -actin của tôm 1 Chương II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về tình hình nuôi tôm 2.1.1 Trên thế giới Vào thế kỉ XV, cá măng và các loài thuỷ sản như tôm biển được nuôi... thể phát hiện sớm, phát hiện đồng thời và chính xác tác nhân gây bệnh Vì thế đề tài Phát triển qui trình mRT-PCR phát hiện YHV, GAV và gen -actin của tôm sú (Penaeus monodon) được thực hiện: Mục tiêu: Xác định khả năng ứng dụng qui trình mRT-PCR trong việc phát hiện đồng thời YHV, GAV và nhằm kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong qui trình thông qua gen nội sinh -actin Nội dung: - Thực hiện qui trình. .. cho nghề nuôi tôm sú năm 1987 và 1988 (Chen và ctv, trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006) Bệnh virus xuất hiện nhiều và gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở Châu Á là bệnh đầu vàng và bệnh đốm trắng Bệnh đầu vàng (YHD) trên tôm sú được báo cáo đầu tiên kết hợp với số lượng lớn tôm chết ở Thái Lan năm 1990 (Limsuwan, 1991) Gill-associated virus – hình que được phát hiện trên tôm sú tại bốn trang... nhiễm YHV có và không có kết hợp với dịch chiết tôm Độ nhạy của qui trình được xác định bằng cách tiến hành phản ứng RT-PCR trên mẫu nhiễm YHV (30 µg/µl) pha loãng nhiều bậc và kết quả cho thấy qui trình có khả năng phát hiện được 6 pg YHV hiện diện trong mẫu 2.5.2.4 Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp mRT-PCR Wongteerasupaya et al (1998) đã phát triển một phương pháp để phát hiện đồng thời cả ARN và. .. tích trình tự vùng gen tương ứng của YHV phân lập từ Thái Lan và GAV phân lập từ Úc Ba vùng được chọn để so sánh nằm trong vùng ORF1b Trước tiên ở vùng gen khoảng bp sửliệu dụngĐH cặp mồi GAV5 và GAV6 để khuếch đại thì nhậnvà thấy YHV và cứu tâm577 Học Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên GAV giống nhau 85,1% trình tự nucleotide và 95,8% trình tự amino acid Khi sử dụng cặp mồi 10F và 144R thì không thể phát. .. nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp) Căn cứ vào thang ADN 1 kb ladder để xác định trọng lượng phân tử Mẫu hiện lên vạch 750 bp là mẫu dương tính với YHV 25 3.3.6 Phương pháp mRT-PCR phát hiện YHV và gen -actin ở tôm 3.3.6.1 Khuếch đại ADN Bảng 3.8: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình phát hiện YHV và gen -actin ở tôm Hoá chất/Dung dịch Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25... pháp này rất cao có thể phát hiện với 1fg ADN (tương đương 240 gen) ở bước 1 và với 1ag (tương đương 0,24 gen) ở bước 2 Với khả năng phát hiện cao phương pháp này rất có ích trong việc kiểm tra để phát hiện sớm virus gây bệnh trên tôm giống và cả trên tôm bố mẹ 14 Cowley et al (2002) đã sử dụng phương pháp kính hiển vi điện tử và RTnested PCR để nghiên cứu sự lan truyền dọc của GAV trên tuyến sinh dục,... Nước cất  Mồi: Bảng 3.1: Trình tự 2 đoạn mồi bước 1 sử dụng trong qui trình RT-PCR phát hiện GAV (Cowley et al., 2000) Tên mồi Trình tự GAV5 (F) 5’ - AAT TTT GCC ATC CTC GTC AC -3’ GAV6 (R) 5’ - TGG ATG TTG TGT GTT CTC AAC -3’ Tm 55,50C 600C Bảng 3.2: Trình tự 2 đoạn mồi bước 2 sử dụng trong qui trình RT-PCR phát hiện GAV (Cowley et al., 2000) Trung tâm Tên mồi Trình tự Tm GAV1 (F) 5’ - ATC CAT ACT... protozoa và hậu ấu trùng 15 của P.monodon Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thì thấy vài virion của GAV trong dịch lỏng của tuyến sinh dục và không phát hiện ra bất kì nucleocapside hay virion của GAV trong tế bào của tuyến sinh dục Nhưng lại phát hiện nucleocapside và virion của GAV trên 100% cơ quan lympho của tôm giống cỡ 1,2g Sử dụng phương pháp RT-PCR và phân tích trình tự từ tôm bố mẹ và trứng... 10F và 144R thì không thể phát hiện được GAV nhưng phân tích ở trình tự vùng gen 135 bp thì giống nhau 83% trình tự nucleotide và 86,7% trình tự amino acid Còn ở vùng khoảng 1068 bp thì thấy giống nhau 80,9% trình tự nucleotide và 86,5% trình tự amino acid Từ kết quả so sánh trình tự trên cùng với dấu hiệu bệnh, mô bệnh học và hình thái học thì có thể kết luận rằng GAV và YHV có mối quan hệ họ hàng gần ... (2002) 4.2 Phát gen -actin theo qui trình phát YHV Sau thực qui trình phát YHV, qui trình phát gen -actin tôm theo qui trình phát YHV thực cách sử dụng mồi actin nhằm thực qui trình mPCR phát đồng... SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN LÊ HỮU THÔI PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH mRT-PCR PHÁT HIỆN YHV (Yellow Head virus), GAV (Gill-associated virus) VÀ GEN β-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Trung tâm... qui trình phát gen -actin theo qui trình phát GAV 37 4.6 Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời GAV gen -actin 39 4.7 Thực qui trình mRT-PCR phát đồng thời YHV, GAV