actin
Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR thì thao tác sai (không cho mẫu vào) và ly trích hay trữ mẫu kém chất lượng là những vấn đề không thể tránh khỏi. Từ đó có thể dẫn đến trường hợp âm tính giả của sản phẩm PCR. Và gen - actin là gen nội sinh của tôm, có mặt khắp nơi trong cơ thể tôm (Zhu et al., 2005) có thể giúp kiểm soát được trường hợp âm tính giả khi thực hiện khuếch đại đồng thời với tác nhân gây bệnh.
Trên cơ sở qui trình RT-PCR phát hiện YHV (Cowley, 2002) và qui trình phát hiện gen -actin (Oanh, 2007), qui trình mRT-PCR kết hợp hai qui trình trên được thực hiện để phát hiện đồng thời YHV và -actin nhằm kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong quá trình phát hiện YHV cũng như kiểm soát trường hợp âm tính giả trong xét nghiệm.
Bảng 4.2: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình phát hiện YHV và gen -actin ở tôm
Điều kiện phản ứng
950C trong 1 phút
Sau đó 950C trong 30 giây 580C trong 30 giây
720C trong 45 giây
Lặp lại chu kì trên 35 lần 720C trong 7 phút Giữ 200C Hoá chất/Dung dịch Thể tích Dung dịch đệm 10X MgCl2 (25 mM) dNTP (10 mM)
Taq DNA polymerase 5UI/l Nước Mồi YH31 F/R (10 M) Mồi -actin F (10 M) Mồi -actin R (10 M) cDNA Tổng 2.5 l 5 l 0.5 l 0.25 l 10 l 0.25 l 1.25 l 1.25 l 4 l 25 l
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hình 4.3: Kết quả chạy PCR phát hiện YHV và -actin trên tôm theo qui trình mRT-PCR
Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm Giếng 1: mẫu phát hiện YHV
Giếng 2: mẫu phát hiện YHV và -actin Giếng 3: mẫu phát hiện -actin
Kết quả điện di khi thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời YHV và
-actin cho thấy hiện hai vạch ở vị trí 750 bp (YHV) và 216 bp (-actin) (Giếng 2). So với phương pháp lúc đầu thể tích ADN khuôn sử dụng là 1 µl thì thể tích ADN khuôn sử dụng sau khi chuẩn hóa là 4 µl. Việc sử dụng mạch khuôn tăng so với ban đầu là do khi sử dụng 4 µl thì kết quả điện di rõ hơn. Từ đó cho thấy hàm lượng ADN khuôn có ảnh hưởng đến kết quả thực hiện PCR. Kết quả trên cho thấy có thể ứng dụng qui trình sử dụng cDNA để phát hiện YHV và gen -actin của tôm, đồng thời có thể kiểm soát được trường hợp âm tính giả và chất lượng ARN của tôm trong quá trình phát hiện YHV thông qua gen nội sinh -actin của tôm.
1000 bp 500 bp 100 bp M (-) 1 2 3 750 bp 216 bp
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu