Wongteerasupaya et al. (1998) đã phát triển một phương pháp để phát hiện đồng thời cả ARN và ADNcủa hai loại virus khác nhau trên tôm là YHV và WSSV, chúng hiện là nguyên nhân gây thiệt hại nghiêm trọng và phổ biến trong nuôi tôm công nghiệp ở Thái Lan và Châu Á. Phương pháp cho phép chẩn đoán nhanh bằng cách thực hiện một bước ly trích cả ARN và ADN sử dụng TrizolTM. Acid nucleic sau khi ly trích sẽ được khuếch đại bằng mRT- PCR dùng qui trình RT-PCR một bước với mồi 10F-144R cho YHV và WSV4.2F-WSV4.2R3 cho WSSV.
Tsai et al. (2002) thực hiện thí nghiệm dùng cùng một tube và phương pháp mRT-PCR một bước để phát hiện đồng thời WSSV và TSV. Ba cặp mồi 9195 F/9992 R, 94 F2/R2 và ITS F/28S R được trộn với tỷ lệ 3:1:1 để khuếch đại đặc hiệu những mẫu TSV, WSSV và gen của tôm trong phản ứng RT-PCR. Qua thực nghiệm những mẫu tôm bị nhiễm WSSV và TSV thì những sản
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
phẩm khuếch đại acid nucleic ly trích từ chân bơi đã cho ra 4 kết quả. Với mẫu không nhiễm virus thì một mẫu 892 bp được khuếch đại từ rARN bởi cặp mồi ITS F/28S R như là một đối chứng Trong những mẫu chỉ nhiễm WSSV hoặc TSV, 2 mẫu cho thấy một trong hai mẫu là WSSV 530 bp với đối chứng hoặc TSV 231 bp cộng với đối chứng. Trong trường hợp nhiễm cả hai loại virus , cả 3 sản phẩm khuếch đại được phát hiện đồng thời.
Hình 2.4: Kết quả mRT-PCR phát hiện đồng thời WSSV và TSV (Tsai et al. 2002)
Xie et al. (2007) đã phát triển phương pháp mRT-PCR để phát hiện đồng thời 3 tác nhân gây bệnh virus trên tôm . Ba cặp mồi đặc hiệu cho TSV, WSSV và IHHNV được sử dung trong thí nghiệm. Sản phẩm ADN của mRT-PCR bao gồm những băng 231 bp của TSV, 593 bp của WSSV và 356 bp của IHHNV. Những băng không đặc hiệu có độ lớn tương tự được khuếch đại từ những tác nhân gây bệnh virus khác hoặc vi khuẩn. Với lượng 10 pg ARN của TSV, 100 pg ADN WSSV và IHHNV sẽ được phát hiện khi sử dụng bản gel điện di. Khawsak et al. (2008) trong nghiên cứu gần đây đã phát triển phương pháp mRT-PCR để phát hiện đồng thời 6 loại virus chính là YHV, WSSV, TSV, HPV, IHHNV và MBV. Sáu cặp mồi khuếch đại các acid nucleic cho kết quả là các sản phẩm với các kích thước khác nhau. Những cặp mồi đặc hiệu cao và không gắn vào những acid nucleic của tôm và virus khác. Độ nhạy của phương pháp mRT-PCR là 0.15 pg IHHNV, 0.15 pg TSV, 1 pg HPV, 1.5 pg MBV, 5 pg WSSV và 10 pg YHV. Ứng dụng của phương pháp này, 42 mẫu bao gồm tất cả mô của tôm post và gan tụy của tôm sú đã chọn từ những ao ở trung tâm và vùng phía Nam Thái Lan từ 2002-2005 được kiểm tra bằng phương pháp mRT-PCR. Kết quả cho thấy rằng ảnh hưởng đơn lẻ là chủ yếu và WSSV là phổ biến nhất tại thời điểm đó.
WSSV ADN tôm
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu