actin
Trên cơ sở qui trình RT-PCR phát hiện GAV (Cowley et al., 2000) và qui trình phát hiện gen -actin (Oanh, 2007), qui trình mRT-PCR kết hợp hai qui trình trên được thực hiện để phát hiện đồng thời GAV và -actin nhằm kiểm soát chất lượng ARN của tôm trong quá trình phát hiện GAV cũng như kiểm soát trường hợp âm tính giả GAV.
Qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và -actin đã được thực hiện bởi Trần Việt Tiên (2007). Kết quả đã phát hiện được GAV ở vị trí 317 bp và
-actin ở vị trí 216 bp. Tuy nhiên sản phẩm điện di chưa rõ và hai vạch vẫn chưa tách rời nhau.
Qui trình tiếp tục được thực hiện nhằm chuẩn hóa qui trình đã thực hiện để có thể phát hiện rõ hơn và kiểm tra lại tính ổn định của qui trình.
Trong quá trình chuẩn hóa thì thành phần hóa chất so với qui trình đã thực hiện thì không có sự thay đổi. Tuy nhiên, thì có một số thay đổi ở chu kì nhiệt.
Điều kiện phản ứng
Trước khi chuẩn hóa
940C trong 1 phút
Sau đó 940C trong 30 giây 580C trong 30 giây
720C trong 45 giây
Lặp lại chu kì trên 35 lần 720C trong 7 phút
200C trong 10 phút
Sau khi chuẩn hóa
940C trong 1 phút
Sau đó 940C trong 25 giây 580C trong 30 giây
720C trong 30 giây
Lặp lại chu kì trên 30 lần 720C trong 7 phút
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hình 4.6: Kết quả chạy PCR phát hiện GAV và -actin trên tôm theo qui trình mRT-PCR
Giếng M: thang đo Giếng (-): đối chứng âm Giếng (+): đối chứng dương
Kết quả điện di cho thấy khi thực hiện qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và -actin thì sẽ hiện hai vạch tương ở vị trí 317 bp (GAV) và 216 bp (-actin).
Kết quả tối ưu qui trình tương đối tốt hơn qui trình đã thực hiện, có thể phân biệt rõ ràng hai vạch 317 bp (GAV) và 216 bp (-actin). Ngoài ra, so với qui trình trước thì qui trình sau khi chuẩn hóa thời gian thực hiện phản ứng được rút ngắn hơn. Kết quả cho thấy chu kì nhiệt có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình và sản phẩm khuếch đại.
