Đang tải... (xem toàn văn)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 19671968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…
Trờng đại học tổng hợp hà nội - Khoa hoá học Prof.Dr Phạm Luận Cơ sở lý thuyết Săc ký lỏng hiệu cao High Performance liquid Chromatography ( HPLC ) - Hà nội 2000 CHƯƠNG I khái niệm mở đầu HPLC 1.1 Khái niệm kỹ thuật sắc ký Sắc ký kỹ thuật tách phân tích ( xác định ) chất hỗn hợp mẫu dựa theo tính chất hoá học,vật lý hoá lý chất điều kiện định Các tính chất là: y Tính chất hấp phụ chất rắn, y Tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion, y Sự rây phân tử theo kích thớc chúng, y Sự tạo phức liên hợp phân tử, y Sự phân bố chất hai pha không tan vào nhau, Kỹ thuật sắc ký có hai loại dựa theo trạng thái chất mẫu pha động tiến hành tách sắc ký Đó Kỹ thuật phân tích sắc ký khí ( GC ) Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng ( LC ) Trong kỹ thuật sắc ký lỏng lại đợc chia thành hai nhóm, là: + Sắc ký lỏng áp suất thờng LC ( sắc ký cổ điển ), + Sắc ký lỏng hiệu suất cao ( áp suất cao: ( HPLC ) Và ( sau năm 1999 ) có sắc ký lỏng siêu áp, loại làm việc với áp suất cao từ 900-1500 bar ( UHPLC: 900-1500 bar ) Trong sắc ký cột ( có dạng rắn-lỏng hay lỏng-lỏng ), kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất thờng đời đợc ứng dụng từ lâu ( 60 năm ) Nhng hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp tốn nhiều thời gian nh dung môi để chạy sắc ký Ngợc lại kỹ thuật HPLC đời phát triển khoảng chục năm lại đây, nhng đợc phát triển nhanh đợc ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác nghiên cứu khoa học, sản xuất công nghệ, môi trờng, Vì kỹ thuật tách sắc ký HPLC có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao tốn thời gian nh tốn mẫu Nói chung khoảng 15 năm qua, kỹ thuật phân tích HPLC chiếm đến gần 70% tổng số công trình nghiên cứu ứng dụng sắc ký Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: y Sắc ký lớp mỏng áp suất cao ( HPTLC ) y Sắc ký cột lỏng áp suất cao hay sắc ký lỏng hiệu suất cao ( HPLC ) Trong nhóm HPLC, tuỳ theo chất trình sắc ký pha tĩnh ( SP ) xẩy cột tách mà ngời ta chia thành loại sau: Sắc ký phân bố ( PC ) chất tan hai pha không tan ( trộn) vào Sắc ký hấp phụ pha thờng ( NP-HPLC ), Sắc ký hấp phụ pha ngợc hay pha đảo ( RP- HPLC ), Sắc ký trao đổi ion ( IEX-HPLC ) cặp ion ( IP-HPLC ), Sắc ký rây phân tử ( FG-HPLC ) Trong năm loại này, loại thứ để tách chất có phân tử lợng lớn 1000 đv oxy ( cao phân tử ) Một cách tổng quát minh hoạ khái quát phân chia sơ đồ hình 1.1 Hình 1.1 : Sự phân loại HPLC HPLC: Sắc ký lỏng hiệu suất cao HPTLC: Sắc ký lớp mỏng ( phẳng ) hiệu suất cao PC- Phân bố, NP-Pha thờng, RP-Pha ngợc, IEX-Trao đổi ion, FG-Rây phân tử Sự phân chia dựa theo tính chất trình sắc ký, tất nhiên tơng đối Vì nhiều trờng hợp, trình tách sắc ký xẩy cột sắc kí theo tính chất ( chế ) nhất, mà đồng thời có hai hay nhiều chế khác diễn biến cột tách Ví dụ sắc ký cặp ion dùng chất hấp phụ pha ngợc Hypersil ODS để tách nguyên tố đất hiếm, với pha động methanol nớc, môi trờng đệm axêtat (pH=4,6), chất tạo phức -HIBA, tách xẩy theo chế trao đổi ion chế hấp phụ pha ngợc Mặt khác, xem xét trạng thái pha tĩnh, ngời ta lại chia thành: y Sắc ký lỏng- lỏng ( LLC ) Pha tĩnh pha động chất lỏng y Sắc ký lỏng- rắn (LSC ) Pha tĩnh chất rắn, pha động chất lỏng đây, hệ LLC, pha tĩnh chất lỏng, đợc giữ cột tách nh lớp màng nhờ chất mang trơ Chất mang trơ thờng hạt silicagen trơ, ví dụ nh Kiselgure hãng Merck Còn hệ LSC, pha tĩnh chất rắn, hạt xốp, có cỡ hạt từ đến 10 àm ( đờng kính ) Cùng với pha tĩnh, kỹ thuật HPLC, chất lỏng hay hỗn hợp chất lỏng dùng để rửa giải chất phân tích trình sắc ký đợc gọi pha động ( MP ) Pha động dung môi nớc hay dung môi hữu cơ, nh metanol, acêtônitril, butanol; hỗn hợp hai dung môi, nh metanol nớc hay actonitril nớc Hoặc dung môi có thêm chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo phức, Song song với kỹ thuật HPLC, kỹ thuật sắc ký khí đợc phát triển ứng dụng nhiều lĩnh vực Kỹ thuật sắc ký đợc giới thiệu kỹ giáo trình sắc ký khí Dr Nguyễn Xuân Dũng Dr Phạm Hùng Việt số tác giả khác 1.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC Để thực việc tách hỗn hợp chất kỹ thuật phân tích HPLC, phải có hệ thống trang thiết bị kỹ thuật Hệ thống trang thiết bị kỹ thuật HPLC, ( đơn giản đủ để làm việc đợc theo kỹ thuật HPLC ) bao gồm phận sau đây: Bơm cao áp: Để bơm pha động vào cột tách, thực trình sắc ký, rửa giải chất tan khỏi cột sắc ký Bơm phải điều chỉnh đợc áp suất ( - 400 bar ) để tạo đợc tốc độ định pha động qua cột tách phù hợp cho trình sắc ký, phải có tốc độ nằm vùng 0,5 - mL/phút Van bơm mẫu: Để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo lợng mẫu định không đổi trình sắc ký Đó van chiều có chứa vòng mẫu tích xác định ( ví dụ 20, 50 hay 100àL ) Van chiều có vòng mẫu, nhng van 10 chiều có vòng mẫu Cột tách: Là cột chứa pha tĩnh, trái tim trình tách sắc ký, yếu tố định hiệu tách sắc ký hỗn hợp chất mẫu Cột tách có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký ( bảng 1.1 ) Nói chung, cột tách phân tích thờng có kích thớc chiều dài từ 10 - 25 cm; đờng kính từ - mm Trang bị phát chất phân tích Đây thờng loại Detector dựa theo tính chất chất phân tích, ví dụ : - Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV hay UV-VIS, - Detector phổ phát xạ nguyên tử (AES, ICP-AES), - Detector phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), - Detector phổ huỳnh quang phân tử, - Detector điện hoá ( đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lợng ), - Detector chiết suất, - Detector đo độ dẫn nhiệt, - Detecor diode phát quang diode mảng, - Detector phổ khối lợng ( khối phổ: MS, ICP-MS ), v.v Tất nhiên phải tuỳ theo loại chất phân tích mà chọn loại detector cho phù hợp để đạt đợc độ nhạy cao phát chất, nh đo định lợng chúng tốt Trong loại trên, detector hấp phụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS đợc dùng phổ biến Vì thích hợp cho nhiều loại chất, lại không đắt Trang bị thị kết quả: Trang bị thị kết có nhiều loại, nhng đơn giản phổ biến máy tự ghi ( recorder ) để ghi tín hiệu đo dới dạng pic chất, đến tích phân kế ( Intergrator ), sau máy tính kèm theo để xử lý kết may in để in kết tách Đó phận cần thiết tối thiểu phải có hệ thống máy HPLC Hình 1.2 sơ đồ khối hệ thống Tất nhiên hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, đại, ngày có thêm: + Bộ chơng trình gradient dung môi ( pha động ), + Bộ bơm mẫu tự động pha loãng mẫu, + Bộ gia nhiệt ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký, + Máy tính chơng trình ( phần mềm ) điều khiển, kiểm soát toàn hệ thống HPLC xử lý kết tách, lập báo cáo in kết sắc kí Một cách tổng quát mô cấu hình nguyên tắc chúng theo hình 1.2a, 1.2b 1.2c 1.3 Phân loại mức độ tách kỹ thuật HPLC Trong kỹ thuật tách HPLC, ngời ta chia thành ba mức độ trình tách sắc ký, tuỳ thuộc vào mục đích yêu cầu ngời làm HPLC Ba mức độ là: Mức độ tách phân tích ( Analytical Level ) Mức độ bán điều chế ( Semi - Preparative ) Mức độ tách điều chế, sản xuất ( Preparative ) Bảng 1.1 tham số qui định kích thớc chiều dài, đờng kính cột tách, lợng mẫu nạp vào cột tách, cho mức độ sắc ký kỹ thuật tách HPLC Tất nhiên khái niệm phân chia có tính chất tơng đối 1.4 Nguyên tắc trình sắc ký cột Để tiến hành tách sắc ký, pha tĩnh phải đợc nhồi vào cột tách theo kỹ thuật định phù hợp Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký loại sắc ký Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ pha thờng hay pha ngợc ( NP-HPLC hay RP-HPLC ) Nếu pha tĩnh chất trao đổi ion, ta có sắc ký trao đổi ion ( IE-HPLC ) Nếu pha tĩnh chất lỏng có tính phân bố ta có sắc ký chiết hay sắc ký phân bố ( LLC ) Nếu pha tĩnh chất rây phân tử, ta có sắc ký rây phân tử Hình 1.2: Sơ đồ khối kiểu hệ thống HPLC Bảng 1.1: Phân loại mức độ sắc ký HPLC Các tham số Mức độ Phân tích Mức độ Bán điều chế Mức độ Điều chế Đờng kính cột ( mm ) Độ dài cột L ( cm ) Cỡ hạt pha tĩnh ( àm ) Tốc độ MP ( mL/phút) Thể tích mẫu nạp VS ( àL) Lợng mẫu nạp Qi ( mg.) Số đĩa cột tách, N Độ nhạy detector Thời gian lu tRi ( phút ) 2- 5 - 30 -10 0,5 10 50 0,5 < > 3500 Cao 40 < - 10 30 - 50 10 - 30 - 10 50 - 500 - 500 >3500 Trung bình 120 < 10 50 50 150 25 60 10 100 >1000 >500 >3500 Trung bình 250 < Cùng với pha tĩnh, để rửa giải chất phân tích khỏi cột tách phải cần dung môi rửa giải Đó pha động ( mobile phase: MP ) Nh vậy, ta nạp mẫu phân tích gồm chất A, B, C vào cột tách, bơm pha động qua cột tách trình sắc ký chất A, B C xẩy Nghĩa có tách chất A, B, C khỏi nhau, sau qua cột tách Quyết định hiệu tách sắc ký tổng mối tơng tác: Giữa chất phân tích pha tĩnh, với lực F(1), Giữa chất phân tích pha động, với lực F(2), Giữa pha tĩnh pha động, với lực F(3) ChấtPT (A-B-C) F1 Phatĩnh (SP) F2 F3 Phađộng (MP) Hình 1.3: Sự tơng tác cột sắc ký Tổng ba lực tơng tác (hình 1.3) ba tơng tác yếu tố định chất đợc rửa giải khỏi cột tách sắc ký trớc tiên, lực tơng tác lu giữ Ftot nhỏ Còn chất có lực tơng tác lu giữ lớn đợc rửa giải khỏi cột tách sau Ta minh hoạ trình tách mẫu có hai chất A B, theo sơ đồ nh hình 1.4 sau đây: Theo sơ đồ hình 1.3 lực tơng tác lu giữ chất phân tích là: Chất A: FA = FA(1) + FA (2) + FA(3) Chất B: FB = FA(1) + FB (2) + FB (3) Chất C: FC = FA(1) + FC (2) + FC (3) Thời gian lu, ti (phút) t Hình 1.4 Sơ đồ minh hoạ trình tách A B hai chất phân tích MP pha động để rửa giải chất phân tích chất, lu giữ đợc xác định ba lực thành phần là: F(1), F(2) F(3) Trong F(1) F(2) định, F(3) yếu tố ảnh hởng lực F(1) giữ chất phân tích lại cột tách, tức pha tĩnh Khi lực thành phần F(2) lại kéo chất phân tích khỏi cột tách Nh với chất khác thành phần F(1) F(2) khác Còn thành phần F(3) hệ sắc ký mà giữ thành phần pha động điều kiện khác không đổi, F(3) chất hầu nh không khác Vì F(1) F(2) hai yếu tố định lu giữ chất tan hệ pha Nh có nghĩa pha tĩnh pha động hai yếu tố định hiệu suất trình sắc ký kỹ thuật HPLC Sơ đồ hình 1.4 ví dụ đơn giản để minh hoạ tách hai chất A B Theo thời gian, kể từ lúc bắt đầu nạp hỗn hợp mẫu (AB) vào cột tách sắc ký lúc hai chất A B đợc rửa giải khỏi cột Thời gian lu, ti (phút) t Hình 1.5 Ví dụ tách HPLC chất: Butylbenzen (1), Hexylbenzen(2), Pentylbenzen (3), Octylbenzen Nonylbenzen (a)- chất cha tách đợc khỏi nhau, chất chập phần (b)- chất tách đợc khỏi Hay nh ví dụ sắc đồ hình 1.5, thấy hỗn hợp mẫu có chất đợc tách hoàn toàn ứng với chất có pic sắc ký riêng biệt định Điều có nghĩa trình sắc ký, điều kiện tách sắc ký tốt phù hợp, mẫu có chất cần phân tích, phải có nhiêu pic sắc ký tơng ứng Hình 1.6 ví dụ khác trình sắc ký hỗn hợp mẫu, có chất cha tách khỏi đợc ( chất cột tách có pha tĩnh cỡ hạt 10 àm ) Thời gian lu, ti Hình 1.6 Quá trình tách HPLC hỗn hợp có chất ( Chỉ khác cỡ hạt pha tĩnh : 5, 10 àm ) 151 2.2.2 Van bơm mẫu Khi cỡ hạt pha tĩnh nhỏ, cột sắc ký nhỏ ngắn L=50-60 mm), thể tích cột tách nhỏ, nên thể tích lớp chất ( đĩa ) tất nhiên nhỏ theo, Vì lợng mẫu bơm vào cột tách phải nhỏ Theo lý thuyết đợc phép àL hay nhỏ hơn, để đảm bảo không bão hoà cột Do van bơm mẫu phải tiến, để bơm đợc lợng mẫu nhỏ, áp suất cao, có độ lặp lại tốt xác Van bơm mẫu cho UPLC hãng có cung cấp vòng mẫu hay chơng trình nạp mẫu với thể tích cố định ( hay àL) hay biến thiên theo chơng trình tự động Các kỹ thuật trang thiết bị nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho UPLC hay HPCEC, nạp đợc lợng mẫu từ nL ( nanôlit ) trở lên xác lặp lại tốt 2.2.3 Detector phát chất phân tích Cùng với van bơm mẫu, loại detector phaỉ cải tiến Vấn đề là: Bộ phân FlowCel, nhận tín hiệu ( Các Censor ), hệ điện tử Khi cỡ hạt pha tĩnh nhỏ, cột sắc ký nhỏ ngắn, thể tích cột nhỏ, thể tích lớp chất ( đĩa ) tất nhiên nhỏ theo, Vì FlowCel ( buồng đo ) detector phải nhỏ Theo lý thuyết đợc phép àL hay nhỏ hơn, để lấy đợc thể tích phân đoạn ( đĩa, hay lớp chất ) vào buồng đo để phát Hiện FlowCel detector UV/VIS huỳnh quang thờng 0,52,0 àL, hoàn toàn đáp ứng đợc kích thớc cột tách UPLC Tiếp nhân quang ( Sensor ), hệ điện tử loại detector, trang thiết bị ghi đo tín hiệu sắc ký đợc phát triển hoàn thiện cho phép phát lợng chất nhỏ, cở ppb đến ppt 2.3 Phần mềm ( chơng trình ) điều khiển Khi cột tách nhỏ, lợng chất nhỏ ( nồng độ nhỏ ), thể tích mẫu nạp vào cột tách nhỏ, thời gian tách ngắn, nên phải có chơng trình điều khiển toàn hệ thống hoạt động đồng điều thiếu Vì vận hành tay chậm, ví dụ việc bơm lợng mẫu nhỏ vào cột tách, việc ghi nhận tín hiệu FlowCell, việc ghi nhận số đo, phải xẩy thời gian ngắn, thờng cỡ dới 0,1 giây Vì trình tách thời gian pic xẩy khoảng 1-10 giây xong cho sắc độ tách hỗn hợp mẫu có hàng chục chất vài phút ( 2-6 phút ) 152 Theo yêu cầu đó, hệ máy UPLC hoạt động tự động theo chơng trình từ lúc nạp mẫu trình tách kết thúc cho kết ( ghi vào đĩa hay in giấy ) Những ví dụ sản phẩm UPLC Đến thấy số hệ UPLC số hãng sản suất cung cấp thị trờng giới Các hệ UPLC Waters : Acquity Các hệ UPLC Perkin Elmer Các hệ UPLC Agilents Các hệ UPLC Shimadzu Các u nhợc điểm Phạm vi ứng dụng Đây vấn đề chính, nên vòng năm ( 2000-2004 ), riêng hãng Waters (USA) cung cấp thị trờng giơí 1000 hệ máy UPLC Trong 39% khu vực châu Mỹ, 30% châu âu, 20% châu A, lại dới 10% nớc châu lục khác Vậy u điểm UPLC ? Chúng ta nói tóm tắt ý chính: Tốc độ cao, thờng gấp 3-4 lần kỹ thuật HPLC Vì HPLC, thí nghiệm tách phải 10-15 phút, UPLC dới phút Nên tiết kiệm thời gian, hay số lần thí nghiệm tách gấp lần HPLC Độ nhạy cao, cỡ ppb ppt Độ chọn lọc cao Có khoảng rộng giá trị u mà có tách tốt ( N lớn ), ví vùng tốc độ tuyến tính u thay đổi ít, hình 5.3 Dung môi ( pha động ) tốn ít, 1/4 so với HPLC ( bảng 5.3 ) Đây vấn đề kinh tế, để giảm giá thành chi phí phân tích Bởi HPLC chi phí cho dung môi làm pha động lớn ( nhiều nhất, đến 50% chi phí chung ) Với tính nh trên, nhng giá mua hệ UPLC, đắt hệ HPLC chức cha đến 15%, khó khăn cho số sở phòng thí nghiệm nhỏ đủ kinh phí để đổi trang bị UPLC Song xét mặt kinh tế, lại mang lại nhièu lợi ích hơn, giá chi phí phân tích đáp ứng đợc thực tế ( không đắt HPLC ) Chính có đặc tính trên, nên đời nhng, UPLC đợc sử dụng nhiều phát triển nhanh, năm ( 2000-2004 ) giới có đến gần 5.000 hệ UPLC đợc dùng lĩnh vực Công nghiệp Hoá dợc kiểm nghiệm thuốc Phân tích môi trờng ( đối tợng đất, nớc, không khí, sinh học ) Phân tích thực phẩm 153 Hoá hữu hoá dầu Trong Sinh y học, Sau xem vài ví dụ ứng dung lĩnh vực khác Hình 5.5 Hình 5.6 Hình 5.7 Hef 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 Tốc độ tuyên tính, u ( mm/phút )ặ Hình 5.3 Đờng cong Van Deemter UPLC 154 Bảng 5.3 So sánh kỹ thuật HPLC UPLC Khi tách hỗn hợp mẫu Các tiêu HPLC Cột tách: XTerra C18, 50x4,6 mm 4,6 Cỡ hạt ( àm): 20 Mẫu nạp (àm): Pha động ACN/H2O :25/75 FMP ( mL/ph.): 2,0 Thời gian tách 10 phút Số đĩa, Nef: 4500 Độphângiải(USP): 3,2 Tổng MP: 22 mL LOQ : 0,1àg/mL V delay : 720 àL UPLC AcQuity, C18, 50 x2,1 mm 1,7 ACN/H2O:36/64 0,6 2,0 phút 7500 3,4 4,5 mL 0,054 àg/mL 110 àL Hình 5.4 Độ lặp lại bơm cao áp UPLC 155 Hình 5.5 Hình 5.6 156 Hình 5.7 157 158 Tài liệu tham khảo L.R Snyder and J.J Kirkland Introduction to Modern Liquid Chromatogrphy Second Publ by Wiley New York, 1981 Heinz Engelhardt Hochdruck-Flussigkeits-Chromatographie Springer_Verlag Zweite Auflage Berlin Heidelberg- New York 1977 C.F Simpson Practical High Performance Liquid Chromatography Published by Heyden and Son Limited 1979 Veronika R Mayer ( Laborbucher Chemie ) Praxis der Hochleitungs-Flussig-Chromatographie Otto Salle Verlag & Verlag Sauerlander Sechste Auflage 1990 Gay Aced, Hermamn J Mockel Liquid Chromatogrphie Apparative, theoretische und methodische Grundlagen der HPLC Weinheim - New York - Cambridge - Basel VCH 1991 Douglas A Skoog & James J Leary Chaper 24 An Introduction to Chromatogrphic Separation Chaper 26 High Performance Liquid Chromatogrphy In Book: Principles of Instrumental Analysis Saunders College Publishing 4th Edition 1992 Stanley Blackburn,Ph.D., C.Chem.,F.R.S.C CRC Handbook of Chromatogrphy: Amino Acids and Amines Vol I & II CRC Press, Inc Boca Raton, Florida 1983 Phạm Luận Bài giảng CĐ : Về sở lý thuýết HPLC Hanội-Amsterdam University.1987 Johann Korkisch, Ph.D Handbook of Ion Exchange Resine Their Application to Inorganic Analytical Chemistry CRC Press, Inc Boca Raton, Florida 2000 10 Agilent Company Application Notes Agilent Company 2000 11 Perkin Elmer Copmany Application Notes Perkin Elmer Copmany, 1998, 2000, 2002 159 12 Lê Huyền Dơng Luận án Tiến sỹ ĐHQG Hà nội 2000 13 Shimadzu Application Dât Book ( for Shimadzu High Performance Liquid Chromatographys ) Shimadzu, Jâpn 1999 14 Johann Korkisch, Ph.D HandBook of Inon Exchange Resin ( Their Application to Inorganic Analytical Chemistry ) Volume II NXB CRC Press, Inc Boca Raton, Florida 2000 15 Gunter Zweig, Ph.D & Joseph Sherma, Ph.D CRC Handbook of Chromatography ( Amino Acids and Amines ) Volume I NXB CRC Press, Inc Boca Raton, Florida 1987 16 Waters Corporation Ultra Performance LC Seminar October 2005 17 Waters Corporation Supplement to LC Ultra Performance LC Separation Science Redefined May 2005 -GS.TS Ph Luận < Gtr-HPLC-Thg11-2005 doc > Sửa xg-11-2005 160 Các bảng phụ lục Phụ lục I Chỉ dẫn chọn loại sắc ký 161 Phụ luc II Chỉ dẫn phổ truyên qua dung môi hũ 162 163 164 165 -GS.TS Ph Luạn < Gtr-HPLC-Thg01-2006 doc > Sửa xg01-2006 [...]... ngoài, nên sẽ đợc rửa giải ra trớc 35 Tuy có 4 loại sắc ký nh thế trong HPLC, nhng pha tĩnh chỉ có hai trạng thái là rắn hoặc lỏng Nếu pha tĩnh là chất rắn, ngời có sắc ký lỏng- rắn (LSC: liquid Solid Chromatography ) Nếu pha tĩnh là chất lỏng, thì chúng ta có sắc ký lỏng- lỏng ( LLC : Liquid Liquid Chromatography ) Nhng khi pha tĩnh là chất lỏng, thì bắt buộc nó phải đợc giữ ở trong cột tách nhờ một... cột sắc ký, khi chất tan đi từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Nếu ghi lại quá trình tách sắc ký đó của hỗn hợp chất mẫu phân tích, chúng ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic Các pic có thể tách nhau hoàn toàn, hoặc cũng có thể còn chập vào 11 nhau một phần, hay còn hoàn toàn chập vào nhau ( hình 2.1.b ) Sắc đồ đó phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột có tốt hay không tốt Nếu quá trình tách sắc ký là tốt,... 34 2.3 Pha tĩnh trong HPLC 2.3.1 Các loại pha tĩnh Cũng nh sắc ký cột ở áp suất thờng, pha tĩnh (stationary phase) trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn hợp chất phân tích Nó là những chất rắn, xốp và kích thớc hạt rất nhỏ, đờng kính cỡ hạt từ 3 - 7 micromet (àm), diện tích bề mặt riêng thờng từ 80 - 500 m2/g Pha tĩnh trong HPLC là một yếu tố quan...10 chơng II cơ sở lý thuyết của kỹ thuật hplc 2.1 Khái quát quá trình sắc ký Nói chung quá trình tách trong kỹ thuật HPLC cũng là những quá trình tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học, lại vừa có cả tính chất lý học Nó là những cân bằng động xẩy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động Nó là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất... năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những điều kiện sắc ký nhất định của hệ pha HPLC 3 Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trng độ xốp của nó và không bị thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rã dới áp suất cao của quá trình chạy sắc ký 4 Cân bằng động học của sự tách sắc ký phải xẩy ra nhanh, thuận ngịch và lặp lại tốt Có nh thế mới thu đợc kết... các công thức tính toán trên không đúng cho quá trình rửa giải gradient, mà chỉ phù hợp cho các quá trình rửa giải với tốc độ pha động không đổi suốt trong quá trình sắc ký 2.2.11 Sự mở rộng của pic sắc ký Sự mở rộng của pic ngoài các yếu tố và điều kiện tách trong cột sắc ký quyết định, nó còn có sự đóng góp của các yếu tố khác trong toàn bộ hệ thống HPLC Ví dụ nh: Van bơm mẫu; Hệ thống ống dẫn từ... thành phần của pha động trong quá trình sắc ký, - Độ nhớt của pha động, Vì thế với một hệ pha nhất định, và trong những điều kiện sắc ký đã chọn, thì chiều cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan Chiều cao H này đợc xác định theo công thức : H L = ( Wi / tRi )2 16 (2.23) 18 Đây chính là chiều cao lý thuyết của một đĩa Nh vậy với một cột sắc ký có chiều dài là L thì số đĩa lý... yếu tố quan trọng quyết định sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu phân tích và căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, mà ngời ta chia nó ra làm nhiều loại, nh pha tĩnh loại hấp phụ, phân bố, trao đổi iôn và rây phân tử Tơng ứng với mỗi loại chất nhồi nh thế ngời ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật tách HPLC Các loại đó là: 1 Sắc ký hấp phụ Trong loại này có hai hớng... tích HPLC là phải luôn luôn gắn liền với những điều kiện thí nghiệm nhất định của hệ pha HPLC và với các loại trang thiết bị đã dùng để phát hiện và xác định nó Nói về giới hạn phát hiện của một chất, trong kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC) ngời ta thờng sử dụng hai khái niệm : Giới hạn nồng độ ( độ nhậy nồng độ ): Là nồng độ nhỏ nhất của chất tan Xi trong dung dịch mẫu bơm vào cột tách sắc ký. .. nạp lợng mẫu lớn vào cột tăch sắc ký, để đảm bảo sự phân bố chất trong hệ pha tuân theo gần nh LăngMua tuyến tính 2.2.10 Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn là một đại lợng đặc trng cho một pic sắc ký và một quá trình tách sắc ký của một hỗn hợp chất Theo qui luật phân bố Gauxơ, độ lệch chuẩn này đợc xác định bởi chiều rộng của pic sắc ký ứng với 0,607 chiều cao của pic sắc ký cực đại, Hmax (hình 2.7) Và theo ... bao gồm hai nhóm: y Sắc ký lớp mỏng áp suất cao ( HPTLC ) y Sắc ký cột lỏng áp suất cao hay sắc ký lỏng hiệu suất cao ( HPLC ) Trong nhóm HPLC, tuỳ theo chất trình sắc ký pha tĩnh ( SP ) xẩy cột... điển ), + Sắc ký lỏng hiệu suất cao ( áp suất cao: ( HPLC ) Và ( sau năm 1999 ) có sắc ký lỏng siêu áp, loại làm việc với áp suất cao từ 900-1500 bar ( UHPLC: 900-1500 bar ) Trong sắc ký cột ( có... chất trình sắc ký loại sắc ký Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ pha thờng hay pha ngợc ( NP -HPLC hay RP -HPLC ) Nếu pha tĩnh chất trao đổi ion, ta có sắc ký trao đổi ion ( IE-HPLC