Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều.docx

Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều.

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của 4 năm miệt mài học tập trên ghế giảngđường Đại học, cũng là bước khởi đầu để làm quen với công việc nghiên cứu khoa họcthực thụ Vì vậy, nó vô cùng có ý nghĩa đối với mỗi sinh viên Tuy nhiên, hoàn thànhtốt Khóa luận là một công việc không hề đơn giản, không chỉ đòi hỏi sự nỗ lực, cốgắng của bản thân người thực hiện mà còn cần đến sự động viên, cổ vũ của gia đình,bạn bè đặc biệt là sự giúp đỡ nhiệt thành của các thầy cô và cán bộ hướng dẫn Quađây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những cá nhân đã nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trongquá trình thực hiện Khóa luận.

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phan Văn Chi –Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Hoá Sinh Protein đã tạo mọiđiều kiện thuận lợi, hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mêkhoa học trong suốt quá trình thực hiện khoá luận.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Bùi Phương Thuận, Chủ nhiệmbộ môn Sinh lý thực vật và Hoá Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tựnhiên Hà Nội đã tận tình truyền thụ và trang bị cho tôi những nền tảng kiến thức vữngchắc trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể chủ động tiếp thu tốt hơn nhữngkiến thức khoa học mới khi làm khóa luận.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS Đỗ Quỳnh Hoa, người đã trựctiếp hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Bích Nhi, ThS Trần Thế Thành vì nhữngđóng góp quý báu trong quá trình hoàn thành khóa luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệSinh học và các thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh đã nhiệt tình hướng dẫn,giúp đỡ, góp ý và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập và hoàn thành khoá luận tốtnghiệp.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luônđộng viên, khích lệ và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong quá trình học tậpvà nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2008Sinh viên

Vũ Khắc Ngọc

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 2

1.1.1 Khái niệm về huyết thanh người 2

1.1.2 Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người 2

1.1.3 Chức năng của các protein trong huyết thanh 3

1.1.4 Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam 4

1.1.5 Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh 4

1.1.6 Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh 6

1.2 KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) 7

1.2.1 Giới thiệu chung 7

1.2.2 Tiến trình hoạt động của 2-DE 7

1.2.3 Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE 9

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE 9

1.2.5 Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) 10

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Hóa chất 15

2.1.3 Thiết bị 16

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh 16

2.2.2 Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau 16

2.2.3 Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford

2.2.4 Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) 18

2.2.5 Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 19

2.2.6 Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin 20

2.2.7 Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS. 20

2.2.8 Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23

3.2 Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được 24

3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford 25

3.4 Điện di 2-DE protein bền nhiệt 27

3.5 Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp 30

3.6 Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein 32

3.7 Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE 34

3.8 Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS

DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1 Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư 5

Bảng 2 Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 3 Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE 18

Bảng 4 Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC 20

Bảng 5 Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn 26

Bảng 6 Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford 27

Bảng 7 Sự biến đổi của hiệu điện thế theo thời gian 28

Bảng 8 Kết quả tính toán nồng độ protein trước và sau khi kết tủa bằng phương pháp Bradford 33

Bảng 9 Kết quả nhận dạng các protein chịu nhiệt bằng phương pháp 2DE-LC-MS/MS 36

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Hình 1 Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh 3

Hình 2 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip 8

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ Tris đến quá trình hội tụ đẳng điện của protein 10

Hình 4 Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau 11

Hình 5 Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau 13

Hình 6 Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein 14

Hình 7 Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8 22

Hình 8 Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt 23

Hình 9 Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt 24

Hình 10 Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford 26

Hình 11 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với protein tổng số 27

Hình 12 Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt 29

Hình 13 Sự hội tụ của Tris trên bản điện di 2-DE tại pH ứng với pKa của nó 30

Hình 14 Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt trên dải pH 4-7 31

Hình 15 Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát các điều kiện kết tủa với TCA 33

Hình 16 Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu quả của việc loại Tris bằng phương pháp kết tủa protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10 35

Hình 17 Kết quả nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 37

Hình 18 Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) của Haptoglobin gi|4826762 38

Hình 19 Trình tự amino acid của protein haptoglobin gi|4826762 38

Hình 20 Kết quả nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465 39

Hình 21 Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) của apoA-I gi|37499465 40

Hình 22 Trình tự amino acid của protein apoA-I gi|37499465 40

Hình 23 Kết quả nhận dạng của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 41

Hình 24 Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) của transthyretin gi|1181953 41

Hình 25 Trình tự amino acid của transthyretin với số đăng ký gi|1181953 42

MỞ ĐẦU

Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể Những thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉ ở số lượng rất lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng Trong khi một số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%-10%)…, thì ngược lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số Những khác biệt rất lớn về nồng độ này cùng với sự hạn chế về mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định lượng và định tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn và ít được chú ý trong một thời gian dài Song gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy và độ chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại với hàm lượng tới fg/mL Một số thành phần protein hàm lượng thấp trong huyết thanh đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhiều hơn.

Một trong những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực này là nghiên cứu phân đoạn protein bền nhiệt trong huyết thanh Mặc dù chưa có được nhiều thành tựu lớn, nhưng những kết quả mới công bố gần đây cũng đã gợi ý những phương pháp thu nhận, phân tích và nhận dạng có hiệu quả các protein huyết thanh bền nhiệt, đồng thời cũng chứng minh được có những mối liên hệ nhất định giữa sự biến đổi tính bền nhiệt của các protein này với các quá trình bệnh lý, đặc biệt là đái tháo đường và ung thư Các nghiên cứu trên hệ protein bền nhiệt này hiện còn rất mới, rất tiềm năng và hứa hẹn sẽ thu được nhiều thành tựu quan trọng và có ý nghĩa trong nghiên cứu sinh - y học.

Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi sử dụng phương pháp điện di hai chiều

2-DE và khảo sát một số điều kiện thực nghiệm có liên quan để thực hiện đề tài “Phân tích

protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều” với mục tiêu thu nhận, phân

tách và bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh người Việt Nam, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trên hệ protein này, đặc biệt là trên các mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh và tìm kiếm các ứng viên chỉ thị bệnh đặc hiệu.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI

1.1.1 Khái niệm về huyết thanh người

Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi

máu chống đông đã được loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào Huyết tương là thành phần quan trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm 55-60% thể tích máu[44].

Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ

các thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ các yếu tố đông máu Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể.

Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính hữu ích cho các nghiên cứu proteomics Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8].

1.1.2 Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người

Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam protein Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9]

Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein, [30] Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do nhiễm vi sinh vật, Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát hiện chúng.

Hình 1 Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [30]

Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở người Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50- 70%), do sự tổng hợp hàng ngày ở gan (khoảng 12g) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [9, 10] IgG khoảng 5-7 mg/ml chiếm 10% Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), 2-microglobulin thông thường thay đổi từ 0 - 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [43].

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan (-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [3] Tuy nhiên, trải qua nhiều thập kỷ nghiên cứu mới chỉ có một lượng nhỏ các chỉ thị sinh học này được phát hiện và sử dụng cho mục đích chẩn đoán.

1.1.3 Chức năng của các protein trong huyết thanh

Huyết thanh đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động sống của cơ thể, là môi trường trao đổi chất của các mô và cơ quan, đồng thời cũng là môi trường phức tạp, chứa hàng nghìn loại protein với hàm lượng rất khác nhau Dựa theo chức năng, có thể phân chia protein huyết thanh các nhóm sau [4]:

Chức năng miễn dịch: Bao gồm các Ig (đó là IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) và các bổ thể

tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể như: tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên (peptide, vi khuẩn, virus,…).

Chức năng đông máu: gồm các chất đông máu và các chất chống đông (AT III, protein

C, protein S ) tham gia vào quá trình đông máu và bảo vệ cơ thể.

Duy trì áp suất keo, độ nhớt của máu: trong huyết thanh, protein tạo thành dung dịch

keo để duy trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt và tính đệm.

Chức năng xúc tác: enzyme có chức năng xúc tác cho các phản ứng của các quá trình

sinh học từ đơn giản đến phức tạp nhất

Vận chuyển các chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ chức và vận

chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt; haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol Vận chuyển các protein cần thiết để tổng hợp các tổ chức tế bào và mô.

Chức năng điều hoà: những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ (ng/ml) nhưng có

vai trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các protein ức chế đặc hiệu enzyme

1.1.4 Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam

Dựa trên quan điểm về chức năng, Putnam (1975-1987) đã phân loại các protein trong huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết từ các mô rắn, các immunoglobulin miễn dịch, các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai

Hệ thống phân loại này được thừa nhận rộng rãi và trích dẫn lại trong các nghiên cứu của Anderson (2002) [9].

1.1.5 Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh

Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [1, 9] Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi là một tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2]

Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc

mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư Những thay đổi bất thường về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý (bảng 1) Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều Ung thư gan AFP (α-fetoprotein) 3-5 ng/ml10-100g/ml

Ung thư tế bào nuôi HCG (Human Chrionic

Gonandotrophin) 5 IU/ml1 triệu IU/ml

Ung thư tuyến tiền

liệt PAP (Prostatic acid phosphatase) 0-0.2 ng/ml Tăng cao Ung thư dòng lympho β2-M (beta2-Microglobulin)3.4 ng/ml Tăng cao

Thực tế là nhiều loại protein trong huyết thanh đã được nghiên cứu trước khi chúng ta biết đến sự tồn tại của gen [9] Năm 2002 Adkins và cộng sự bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã phát hiện được 490 loại protein khác nhau trong huyết thanh [6] Năm 2004, Chan và cộng sự bằng phương pháp điện di đẳng điện, sắc ký lỏng đa chiều-khối phổ đã phát hiện được 1444 protein [13] và gần đây nhất năm 2005, theo kết quả xác định và so sánh của 35 phòng thí nghiệm trong dự án proteome huyết tương người của HUPO (Human Proteome Organization), con số này đã là 3020 Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về proteome huyết thanh thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh-y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai.

1.1.6 Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh

Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh là một trong những đối tượng nghiên cứu mới rất hấp dẫn trong nghiên cứu về huyết thanh Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác và đầy đủ cho các protein loại này Trong nghiên cứu này của chúng tôi, hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh được xem như là tập hợp các protein có khả năng chịu được nhiệt độ, vẫn giữ được hoạt tính sau khi đã được xử lý ở nhiệt độ 98oC trong 10 phút theo phương pháp của Goufman và có thể nhận ra được bằng một số phương pháp proteomics như điện di hai chiều và khối phổ [22] Các protein bền nhiệt trong huyết thanh thường là những protein có nồng độ thấp và rất thấp (có thể < 1 pmol), vượt quá giới hạn độ nhạy của các phương pháp nghiên cứu protein truyền thống Do đó, trong suốt một thời gian dài, các nghiên cứu về hệ protein bền nhiệt không được phổ biến và không theo kịp với sự tiến bộ nhanh chóng trong các nghiên cứu về hệ protein khác ở người Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng và vượt bậc về mặt kỹ thuật, các phương pháp nghiên cứu protein mới như hệ sắc ký Nano đa chiều, phương pháp nhận diện và định lượng protein bằng khối phổ đã cho phép nhà nghiên cứu thao tác trên các protein có hàm lượng nhỏ hơn 1pg nhiều lần Các phương pháp này đã mở ra triển vọng mới cho việc nghiên cứu các hệ protein hàm lượng thấp, trong đó có hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh.

Tính bền nhiệt của các protein có mối quan hệ chặt chẽ với các cấu trúc tương ứng của chúng Ngoài ra, nó còn liên quan đến những cải biến và những biến đổi sinh hóa của protein như các quá trình glycosyl hóa [31], Do đó, sự thay đổi tính bền nhiệt của protein chắc chắn có những mối liên hệ nhất định với các biểu hiện bệnh lý Nghiên cứu các protein bền nhiệt có thể giúp tìm ra những ứng viên chỉ thị bệnh hiệu quả và có độ nhạy cao.

1.2 KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE)1.2.1 Giới thiệu chung

Kỹ thuật điện di hai chiều (Two Dimensional Electrophoresis, 2-DE) là một trong những công cụ phân tách protein truyền thống và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về hệ protein [20, 36, 25] Đây là phương pháp có độ phân giải cao hơn hẳn các phương pháp phân tách protein khác hiện có như sắc ký, điện di một chiều, Hiện nay, sự phát triển của kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0,1 đơn vị pI, 1kDa về khối lượng phân tử và có thể phát hiện vệt protein có hàm lượng < 1ng Tùy thuộc vào kích thước lỗ gel và giải gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích [7] Nhờ đó mà nó ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách

các phức hợp protein trong tế bào, mô và các dịch cơ thể [23] và là kỹ thuật mạnh, không thể thay thế trong so sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh so với mô thường [2]

Mặc dù kỹ thuật điện di hai chiều 2-DE đã ra đời và giới thiệu rộng rãi từ đầu những năm 1970 nhưng phải mất một thời gian dài sau đó kỹ thuật này mới trở nên phổ biến Lý do là những khó khăn trong quá trình thực hiện IEF và đưa các protein đã được hội tụ lên gel SDS-PAGE Khi mới ra đời, kỹ thuật IEF được tiến hành trên các ống gel, rất khó thiết lập gradient pH Thêm vào đó, việc sử dụng ống gel cũng làm cho quá trình điện di chiều thứ hai trên gel SDS-PAGE khó thực hiện Khó khăn này chỉ giải quyết được khi có sự ra đời của thanh gel IPG (immobilized pH gradient) Các thanh IPG này được làm từ dẫn xuất của acrylamide, chứa một nhóm acid carboxylic tự do hoặc một nhóm amin bậc ba và là sản phẩm đồng trùng hợp với acrylamide và bis-acrylamide [39] Thanh gel IPG tạo ra một giải gradient pH cố định, liên tục và tăng dần với chiều dài khác nhau (7 cm, 11 cm, 18 cm, 24 cm) đã hạn chế sự di chuyển, trôi dạt của các hóa chất (vì chúng được gắn trên gel polyacrylamid) và sự biến thiên pH, làm cho quá trình phân tách ổn định hơn [32, 39] Ngoài ra, các thành gel này cũng có độ cứng tương đối giúp cho việc đưa các protein từ thanh IPG vào trong gel SDS-PAGE trở nên dễ dàng hơn [32]

1.2.2 Tiến trình hoạt động của 2-DE

Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bằng một trong các phương pháp sau: điện di gradien pH cố định (immobilized pH gradient electrophoresis, IPGE), điện di hội tụ theo điểm đẳng điện (isoelectric focusing, IEF) hoặc điện di gradien pH không cân bằng (non-equilibrium pH gradient electrophoresis, NEPHGE), trong đó phổ biến nhất là điện di IEF [2, 14] Chiều thứ hai, các phân tử protein được phân tách bằng phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamid (như điện di SDS-PAGE) (hình 2) Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, (i) chiều thứ nhất theo điện tích và (ii) chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử

Hình 2 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip [2]

Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric point) của các protein chính là cơ sở của IEF pI là giá trị pH tại đó điện tích bề mặt tổng số của protein bằng 0 (protein không di chuyển trong điện trường) Mỗi protein có một giá trị pI xác định, do đó dưới tác dụng của điện trường trong quá trình điện di IEF, các protein sẽ di chuyển và dừng lại tại vị trí có pH tương ứng với pI của chúng.

1.2.3 Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE

Điện di 2-DE là một trong những công cụ mạnh trong phân tích các hỗn hợp protein phức tạp và là phương pháp không thể thay thế trong so sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh so với mô thường [2, 32] Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được áp dụng rộng rãi và thường gắn liền với proteomics vì nó có khả năng phân tách cao, hiển thị hình ảnh so sánh tương quan, đem lại bức tranh toàn cảnh về mức độ biểu hiện khác nhau của các protein [20]

Khả năng tập hợp dữ liệu và số hóa dữ liệu cũng là một trong những yếu tố quan trọng cho phép 2-DE trở thành một phương pháp thực nghiệm có nhiều ý nghĩa trong việc xây dựng các tập hợp thông tin về một hệ proteome Nó cho phép so sánh khách quan các kết quả

nghiên cứu, điều chỉnh sự sai khác trong kết quả nghiên cứu giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau và phân loại được một số lượng khổng lồ các dữ liệu protein đã được phân tích [14].

Một trong những ưu điểm nữa của phương pháp điện di 2-DE là khả năng kết nối với các hệ thống phân tích hình ảnh gel hoàn toàn tự động Các phần mềm phân tích và xử lý hình ảnh gel như PDQuest, Proteom Weaver, Z3, Delta2D, Decyder 2D, cho phép phân tích, so sánh, định lượng , chú thích, chú giải và phân loại dữ liệu cho các protein phát hiện được Ngoài ra, các phần mềm này còn có khả năng kết nối đến các hệ thống nhặt điểm và cắt gel tự động và thủy phân các điểm protein này để phục vụ cho việc phân tích trên hệ thống khối phổ [15, 45].

Tuy nhiên, điện di 2-DE cũng gặp phải một số vấn đề trong đó phổ biến nhất là tính lặp lại tương đối của thí nghiệm điện di Kết quả điện di của cùng một mẫu có thể có những sai lệch giữa các lần chạy khác nhau [32, 35] Vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng khi sử dụng 2-DE cho mục đích so sánh sự khác biệt giữa hai mẫu khác nhau [32].

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE

Sự thành công của điện di 2-DE phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: phương pháp chuẩn bị mẫu, kích thước của thanh strip, lượng protein tải lên strip, độ nhạy của phương pháp nhuộm, trong đó quan trọng nhất là phương pháp chuẩn bị mẫu.

Ảnh hưởng của phương pháp chuẩn bị mẫu:

Phương pháp chuẩn bị mẫu được lựa chọn phụ thuộc vào mục đích nghiên cứu và là chìa khóa thành công của thí nghiệm Các thông số như tính tan, kích thước, điện tích và điểm đẳng điện của các protein được quan tâm nhiều nhất trong quá trình chuẩn bị mẫu [37, 38] Phạm vi của phương pháp chuẩn bị mẫu bắt đầu từ sự chiết ra protein với các giải pháp hòa tan đơn giản đến những hỗn hợp phức tạp của các chất gây biến tính, chất tẩy rửa và các tác nhân khử Sự chuẩn bị mẫu có thể bao gồm những chiến lược làm giàu hoặc làm đơn giản hóa mẫu protein bằng cách chia chúng thành các phân đoạn nhỏ có tính lặp lại

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ Tris đến quá trình hội tụ đẳng điện của protein [17]. Hầu hết các thí nghiệm điện di 2-DE đều phải xác định một phương pháp chuẩn bị mẫu tối ưu Sự thay đổi nồng độ của các chất biến tính, chất tẩy rửa, các chất lưỡng tính và các tác nhân khử điển hình có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả điện di 2-DE [37, 38] Một ví dụ điển hình là ảnh hưởng của Tris ở nồng độ cao đến quá trình điện di IEF (hình 3)[17].

Ảnh hưởng của kích thước và dải pH của thanh Strip:

Thông thường việc tăng kích thước của thanh Strip và lựa chọn dải pH hẹp sẽ cho phép tăng cường sự phân tách của các protein mà điểm đẳng điện của chúng có độ tương đồng cao [39] Người ta thường sử dụng pH 3-10 trên một bản gel trước, sau đó sử dụng các dải pH hẹp gối lên nhau (sole nhau) để tăng cường độ phân giải của bản gel thu được

Hình 4 Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau [39].

Khi lựa chọn dải pH hẹp, các protein nằm ngoài vùng pH đã chọn sẽ không được tải lên thanh Strip, lượng protein quan tâm được tải lên thanh Strip nhiều hơn và do đó cho phép phát hiện được nhiều điểm protein hơn [39] (hình 4).

Ảnh hưởng của việc lựa chọn phương pháp nhuộm

Protein phân tách được bằng kỹ thuật 2-DE có thể được nhuộm màu bằng các phương pháp nhuộm truyền thống để dễ quan sát, bao gồm nhuộm bạc, Coomasie và amido đen, Trong đó, phương pháp nhuộm bạc và nhuộm huỳnh quang kiểu mới cho độ phân giải cao nhất [32].

Mặc dù có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau, nhưng không phải tất cả các phương pháp này đều phù hợp với những thí nghiệm phân tích tiếp theo Ví dụ phương pháp nhuộm

bạc và cố định bằng formalin sẽ cố định các protein trong gel và ngăn cản sự thủy phân chúng bằng enzyme khi phân tích bằng khối phổ [32].

1.2.5 Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS)

Nguyên lý chung của khối phổ

Khối phổ (Mass spectrometry-MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường Mẫu được ion hóa trở thành các phân

tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z Dữ liệu phổ khối

được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học

Cấu tạo chung của máy khối phổ

Máy khối phổ thường được cấu tạo từ các bộ phận chính sau đây: (1) bộ phận đưa mẫu; (2) nguồn ion hóa; (3) hệ thống bơm chân không; (4) bộ phận phân tích khối (mass analyzer) đo tỷ lệ m/z; (5) bộ phận đo tín hiệu (detector) xác định số lượng các ion ở mỗi giá trị m/z; (6) hệ thống phân tích dữ liệu, bao gồm máy tính cấu hình cao với các phần mềm

chuyên dụng [2].

Hình 5 Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau [2]

Kết hợp điện di 2 chiều - khối phổ (2DE-MS)

Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một trong những cách tiếp cận thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu

Hình 6 Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein [2]

Quá trình này có thể chia thành 5 giai đoạn (hình 6) Ở giai đoạn (1), hỗn hợp protein được phân tách và tinh sạch trên gel nhờ kỹ thuật 2-DE Sau quá trình điện di là sự phân tích hình ảnh các điểm protein trên gel bằng các phần mềm đặc biệt Vì phổ khối của toàn bộ protein có độ nhạy kém hơn phổ khối của peptide và chỉ riêng thông tin về khối lượng của protein là không đủ để xác định nên ở giai đoạn (2), các điểm và vệt protein quan tâm được lựa chọn, cắt và thủy phân bằng enzyme Tripsin Sự thủy phân này tạo ra các peptide được ion hóa ở đầu C, cung cấp một lợi thế để xác định trình tự các peptide Trong giai đoạn (3), các peptide được phân tách bởi phương pháp sắc ký lỏng nano hoặc sắc ký lỏng cao áp trong các ống vi mao quản và được thôi ra rất tinh tế vào trong một nguồn ESI, nơi chúng được bốc hơi, tạo thành những giọt nhỏ tích điện Ở giai đoạn (4), những peptide sau khi ion hóa được chuyển vào phổ kế và phổ khối được xác định Máy tính sẽ thiết lập một danh sách những peptide được lựa chọn cho sự phân mảnh tiếp theo bằng năng lượng thích hợp và các phép đo MS/MS sẽ được thực hiện ở giai đoạn (5) MS và hình ảnh MS/MS tiêu biểu được thu nhận để so sánh với những cơ sở dữ liệu mà kết quả là sự nhận biết các peptide/protein [2].

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Máu được thu từ những người tình nguyện tại bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội Các mẫu được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chặt chẽ về lâm sàng, có hồ sơ, bệnh án rõ ràng và có kết luận là mẫu bình thường từ các bác sỹ chuyên khoa của bệnh viện Máu toàn phần sau khi xử lý, thu huyết thanh và chia nhỏ lượng mẫu vào các eppendorf, được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.

2.1.2 Hóa chất

Tất cả các hóa chất đều có độ tinh sạch cần thiết, đảm bảo các tiêu chuẩn dành cho hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử và được sử dụng đúng theo những hướng dẫn và khuyến cáo của nhà sản xuất Một số hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.

Bảng 2 Một số hóa chất chính đã sử dụng trong nghiên cứu

Fisher Scientific Methanol (HPLC grade), Acetonitrile (HPLC grade)

Bio-Rad Hoá chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, USA), hóa chất điện di

2 chiều (strip, đệm cân bằng 1, đệm cân bằng 2…)

New England Biolab Thang protein chuẩn (Protein Marker)

TriChloroAcetic (TCA), acrylamide, bis- acrylamide, N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamine (TEMED),

Ammonium persulfate (APS), Sodium dodecyl sulfate (SDS), TriFlourAcetic (TFA), Formic acid (FA), Dithiothreitol (DTT), Amonium bicarbonate (NH4HCO3)

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị điện di 1 chiều SDS-PAGE và hai chiều 2-DE mua từ Bio-Rad (Hercules,

CA, Mỹ).

Hệ sắc ký lỏng nanoLC đa chiều từ LC Packings (LC Packings, Amsterdam, Hà Lan)

được sử dụng để phân tách Hệ sắc ký gồm một microautosampler FAMOS, bơm Ultimate micro HPLC, và thiết bị chuyển cột Swichos.

Hệ máy khối phổ QSTAR® XL, sử dụng nguồn ESI (AplliedBiosystems, MDS SCIEX,

Canada) Cột sắc ký ngược pha C18 (Vydac, Mỹ), đầu đưa mẫu Sillica PicoTip (New Objective, Mỹ).

Phần mềm Mascot v1.8 (MatrixScience, London, Anh) Phần mềm BioAnalyst QS v1.1

(Applied Biosystems, MDS SCIEX, Canada).

Ngân hàng Dữ liệu Protein NCBI (Mỹ) với hơn 4,8 triệu trình tự protein khác nhau

được cài trên hệ thống máy chủ Workstation XW6200 BASE UNIT.

Các trang thiết bị thực nghiệm cơ bản khác thuộc phòng Hóa sinh Protein, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen Quốc gia, Viện Công nghệ Sinh học.

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh

Các protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh được thu nhận lại theo phương pháp của Goufman và cộng sự năm 2006 [19].

Một thể tích (1V) huyết thanh tổng số được trộn đều với 1V đệm ETP (20 mM EDTA

pH 8.1, 0.2 M Tris-HCl pH 8.9, 7% (w/v) PEG 6000) Hỗn hợp được ủ 10 phút ở 98oC, 10 phút tiếp theo ở nhiệt độ phòng, sau đó được ly tâm tách pha ở điều kiện 12000 vòng/phút trong 15 phút Phần dịch nổi chứa các protein huyết thanh bền nhiệt được thu nhận lại và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2 Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau

Protein bền nhiệt thu nhận được theo phương pháp trình bày ở phần 2.2.1 được hòa tan trong đệm ETP có nồng độ Tris cao (~ 200mM) làm ảnh hưởng đến kết quả phân tách bằng kỹ thuật 2-DE Để loại bỏ Tris, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp kết tủa protein trong đệm chứa Tris bằng trichloroacetic acid (TCA) ở nồng độ và thời gian ủ thích hợp.

Protein trong dung dịch thu được sau khi biến tính nhiệt được kết tủa bằng TCA Quy trình thí nghiệm cụ thể như sau: (i) Bổ sung TCA vào dung dịch protein bền nhiệt với nồng độ cuối của TCA lần lượt là 15%, 20%, 25% và 30%; (ii) Hỗn hợp phản ứng trên đây được chia thành 2 nhóm không ủ và có ủ 10 phút tại 4oC; (iii) Sau thời gian đó, các hỗn hợp được ly tâm thu tủa với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút; (iv) Loại bỏ phần dịch nổi, rửa lại phần kết

tủa bằng aceton lạnh, bước thí nghiệm này được lặp lại 3 lần; (v) Làm khô kết tủa protein bằng máy biến tính nhiệt tại nhiệt độ 100oC trong 5 phút; (vi) Hòa tan lại protein trong đệm (8M

ure, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte) Dung dịch protein bền

nhiệt được bảo quản ở -80oC

2.2.3 Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford

Hàm lượng protein trong mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford với thuốc nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x của hãng Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Mỹ) Cơ sở của phương pháp là định lượng protein dựa vào đặc điểm liên kết của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 với protein [12] Trong môi trường axit, Coomassie Brilliant Blue G-250 tồn tại chủ yếu ở dạng cation màu đỏ, hấp thụ hai proton (Amax = 470 nm), còn khi thuốc nhuộm liên kết với các gốc axit amin kiềm (arginine) hoặc thơm của protein, chúng chuyển sang dạng màu xanh và không hấp thụ proton (Amax = 595 nm) Dạng liên kết thuốc nhuộm - protein được phát hiện ở bước sóng 595 nm bằng máy quang phổ Protein chuẩn được sử dụng để định lượng protein trong nghiên cứu này là albumin huyết thanh bò (BSA -Bovine Serum Albumin) Các bước thí nghiệm được tiến hành như sau:

Dựng đường chuẩn bằng cách đo OD tại các nồng độ chuẩn khác nhau của BSA

 Chuẩn bị 7 ống eppendorf với các nồng độ protein chuẩn BSA như sau: 0,125 mg/ ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,75 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml; 2 mg/ml

 Rút 20 l dung dịch BSA ở từng nồng độ kể trên trộn đều với 1ml dung dịch Bradford 1x Để phản ứng trong hỗn hợp xảy ra tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ phòng trước khi đem đo trên máy quang phổ, tại bước sóng 595 nm Lặp lại thí nghiệm từ 2-3 lần cho mỗi nồng độ BSA kể trên.

 Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch BSA và mẫu protein, ghi kết quả và dựng đường chuẩn BSA bằng phần mềm Exel của hãng Microsoft.

Xác định nồng độ protein bền nhiệt

 Bổ sung 20 l protein bền nhiệt thu được ở phần 2.2.1 hoặc 2.2.2 vào 1 ml dung dịch Bradford 1x Trộn đều hỗn hợp, để tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra trước khi đem đo trên máy quang phổ Lặp lại thí nghiệm từ 2-3 lần cho mỗi mẫu protein bền nhiệt.

 Đặt máy quang phổ ở bước sóng 595 nm, đo độ hấp thụ của các dung dịch protein bền nhiệt, ghi kết quả hấp phụ protein tại bước sóng 595, tính toán nồng độ protein dựa trên

2.2.4 Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)

Trong khóa luận này, kỹ thuật SDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi, 1970 [27] Các thiết bị, hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp.

Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau Đối với các protein có trọng lượng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%, 12.6% và 15% (w/v) thường được sử dụng Trong nghiên cứu này, SDS-PAGE được tiến hành trên gel 12.6% với các thành

phần cơ bản như ở bảng 3 cho 3 mẫu: (i) huyết thanh pha loãng 40 lần (ii) dịch nổi protein bềnnhiệt (iii) dịch hòa tan của protein bền nhiệt sau khi kết tủa

25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8

Đệm điện di 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3

Quá trình điện di được thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V

cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel Kết thúc quá trình điện di, bản

gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250 Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1%

(w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản

gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi

có thể quan sát thấy các băng protein

2.2.5 Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE)

2-DE là kỹ thuật phân tách các protein dựa trên sự khác nhau về điểm đẳng điện và khối lượng phân tử trên gel polyacrylamide Ở chiều điện di thứ nhất (điện di đẳng điện, isoelectric focusing - IEF), dưới tác dụng của điện trường, các protein di chuyển đến các vị trí pH mà tại đó điện tích tổng số của protein bằng 0, nói cách khác là di chuyển tới điểm đẳng điện pI của chúng Ở chiều điện di thứ hai (điện di biến tính SDS-PAGE), các protein tại những giá trị pH nhất định tiếp tục được phân tách theo khối lượng phân tử

Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện)

Protein huyết thanh sau khi xử lí nhiệt và loại Tris bằng phương pháp kết tủa được hòa

trong đệm (8M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte và

0.001% Bromophenol Blue) Hỗn hợp mẫu được thấm vào thanh gel dài 7cm, chứa dải pH từ 3

đến 10 hoặc 17cm, chứa dải pH từ 4 đến 7 (do hãng Bio-Rad, Mỹ cung cấp) trong thời gian từ 12 giờ đến 16 giờ Sau đó, các protein trên thanh gel được phân tách theo điểm đẳng điện trên hệ PROTEAN IEF (Bio-Rad) Thể tích mẫu sử dụng, thời gian thấm mẫu lên các thanh gel và các bước biến đổi hiệu điện thế trong quá trình điện di được cài đặt theo theo chương trình được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Bio-Rad).

Cân bằng gel

Sau quá trình điện di đẳng điện, protein trên gel được khử bằng dung dịch chứa 6 M

urea, 20% glycerol 2% SDS, 37,5 mM Tris-HCl pH 8.8, 2% DTT w/v và alkyl hóa bằng dung

dịch chứa 6 M urea, 2% SDS 37.5 mM Tris-HCl pH 8.8, glycerol 20% and 40 mM IAA

Điện di chiều hai

Các protein trong thanh gel sau khi được phân tách theo điểm đẳng điện và được cân bằng trong các dung dịch trên sẽ tiếp tục được phân tách trên gel polyarcrylamid 12.5% theo kích thước phân tử của chúng với hiệu điện thế không đổi 150 V Bản gel 2-DE được nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250 rồi tẩy màu tương tự như với bản gel SDS – PAGE ở mục 2.2.4.

2.2.6 Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin

Các vùng protein đã đánh dấu trên bản gel điện di 2-DE được cắt ra và chuyển vào ống

eppendof 1,5 ml Gel được rửa, loại thuốc nhuộm bằng dung dịch rửa (50 mM NH4HCO3, pH

8.0, 50% ACN) Sau đó, các mảnh gel được làm khô bằng 100% ACN và khử bằng DTT với

dung dịch khử chứa 5 mM DTT ở 56 0C trong 1h Sau khi khử, gel được alkyl hóa bằng IAA với dung dịch alkylation chứa 5 mM IAA trong tối, 1 giờ ở nhiệt độ phòng Enzym trypsin (loại sử dụng cho đọc trình tự, Sigma-Aldrich) được thêm vào với tỷ lệ enzym : cơ chất là 1 : 50, ở 37 0C qua đêm Sau khi thủy phân, các peptide được chiết ra khỏi gel bằng dung dịch

chiết (50% ACN, 0,1% FA) và siêu âm 20 phút Quá trình chiết peptid khỏi gel được lặp lại 3

2.2.7 Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS

Phương pháp sắc ký lỏng nhiều chiều kết hợp với khối phổ được sử dụng rộng rãi

mẫu khi đi vào phân tích bằng khối phổ MS/MS và do đó làm tăng khả năng phát hiện các thành phần protein có nồng độ thấp trong mẫu.

Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng sắc ký một chiều kết nối khối phổ 1D nanoLC-ESI-MS/MS để phân tích và nhận dạng protein do các protein đã được phân tách trước đó nhờ kỹ thuật 2-DE Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân được cô đặc muối trên cột Trap, sau đó sẽ được phân tách trên cột sắc ký ngược pha C18 Cuối cùng hỗn hợp sẽ đưa vào hệ thống khối phổ để phân tích Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng nanoLC được tổng kết trong bảng 4.

Bảng 4 Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLCSắc ký lỏng nano UltiMate™ / FAMOS/ Switchos™

(LC Packings/Dionex)

Cột ngược pha 300l x 5 mm C18 PepMap100, LC Parking, Nertherland)

Cột C18 75l ID x 15 cm, Grace Vydac, Hesperia, CA, USA

Máy khối phổ QSTARXL được vận hành ở chế độ IDA (Information Dependent Acquisition) để thực hiện việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn đối với các ion nằm trong dải khối từ 400 amu đến 1200 amu sang khối phổ liên tiếp (MS/MS) trên 3 ion phân tử có mật độ cao nhất và lớn hơn 20 được xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS v1.1 (Applied Biosystems) (Hình 7) Sai số về khối (mass tolerance) được đặt ở mức ± 0,5 Da, thời gian không thực hiện lại MS/MS đối với một mảnh là 90 giây Hiệu điện thế được đặt ở nguồn để ion hoá mẫu là 2200V

2.2.8 Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8