Với kết quả khảo sát các điều kiện kết tủa để loại bỏ Tris như trên, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bằng phương pháp biến tính nhiệt, sau đó kết tủa protein bằng TCA ở nồng độ 25% trong điều kiện có ủ 10 phút trong 4oC. Kết tủa protein được hòa tan trở lại trong nước cất 2 lần và đệm mẫu dùng cho điện di 2-DE. Thể tích mẫu sử dụng được tính toán dựa theo kết quả đo Bradford để đảm bảo lượng protein đưa lên thanh Strip đạt khoảng 80µg. Kích thước và dải pH dùng để khảo sát là trên thanh Strip pH 3-10, 7cm. Quy trình thí nghiệm được thực hiện như mục 2.2.5.
Kết quả điện di 2-DE kiểm tra sau khi được nhuộm bằng dung dịch Comassive Blue Brilliant R-250 và tẩy màu, được so sánh với bản điện di 2-DE tương ứng trước khi loại Tris như trong hình 16.
Hình 16: Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu quả của việc loại Tris bằng phương pháp kết tủa protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10. (A) Trước khi loại Tris; (B) sau khi loại Tris; (C) Ảnh 2- DE phóng đại của mẫu sau khi loại Tris với các vùng tiềm năng cho phân tích khối phổ.
So sánh kết quả điện di 2-DE trước và sau khi kết tủa protein bằng TCA cho thấy chiến lược phân tích trên dải pH 3-10 đã đề ra là rất hợp lý. Ở bản gel sau khi kết tủa (B), các protein
đã phân tách nhau tốt hơn, xuất hiện nhiều điểm protein hơn so với trước khi kết tủa (A) và đặc biệt là tại vùng pH 8 đã không còn xuất hiện hiện tượng các protein tập hợp thành một hàng dọc tại vùng hội tụ của Tris. Kết quả này cho thấy Tris đã được loại bỏ hoàn toàn khỏi mẫu và không còn gây ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu bằng điện di 2-DE trên dải pH 3-10. Kết quả này cũng cho phép chúng tôi lựa chọn và đánh dấu các vùng protein phù hợp để cắt gel, thủy phân và nhận dạng bằng phương pháp khối phổ (C).