Để tiếp tục khảo sát thành phần protein bền nhiệt trong huyết thanh trên dải pH 3-10, nhằm đánh giá toàn diện hơn hệ protein này, đặc biệt là các protein có pI nằm trong vùng pH thấp hoặc cao mà không bị ảnh hưởng bởi sự hội tụ của Tris trong quá trình điện di IEF, chúng tôi tiến hành loại bỏ Tris có mặt trong mẫu. Có nhiều phương pháp giúp loại bỏ Tris ra khỏi mẫu protein, nhưng trong điều kiện cụ thể của nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp kết tủa protein. Phương pháp này cho phép loại bỏ hầu hết các thành phần đệm, muối tự do có mặt trong mẫu, đồng thời cô đặc protein có trong mẫu, giúp người nghiên cứu chủ động hơn trong tính toán nồng độ protein sau khi hòa tan kết tủa trở lại [29].
Trong số các phương pháp kết tủa protein thì kết tủa bằng TCA (trifloracetic acid) là một trong những phương pháp phổ biến và đã chứng minh được hiệu quả trong việc làm sạch mẫu, phục vụ cho thí nghiệm điện di 2-DE [29]. Để tối ưu hóa qui trình kết tủa với TCA, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả kết tủa với các dung dịch TCA có nồng độ khác nhau ở 2 điều kiện là: (i) có ủ ở 4oC trong 10 phút và (ii) không ủ.
Protein trong dung dịch thu được sau khi biến tính nhiệt được kết tủa bằng TCA theo các bước như quy trình đã nêu ở mục 2.2.2. Kết tủa protein sau đó được hòa tan trong nước cất 2 lần và đệm mẫu dùng cho điện di biến tính SDS-PAGE. Dung dịch thu được dùng để kiểm tra bằng phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE trên bản gel có nồng độ 12,6%.
Sau khi nhuộm gel bằng dung dịch Comassive Blue Brilliant R-250 và tẩy màu, chúng tôi thu được kết quả điện di SDS-PAGE như trong hình 15.
Hình 15: Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát các điều kiện kết tủa với TCA
Đường chạy 1: Protein huyết thanh nguyên pha loãng 40 lần; Đường chạy 2 đến 5( nhóm I): Protein bền nhiệt thu được sau khi xử lý kết tủa bằng TCA trong điều kiện không ủ ở các nồng độ tương ứng tăng dần: 15% - 20% - 25% và 30%; Đường chạy 6 đến 9 (nhóm II): Protein bền nhiệt thu được sau khi xử lý kết tủa bằng TCA trong điều kiện có ủ ở 4oC trong 10 phút ở các nồng độ tương ứng giảm dần: 30% - 25% - 20% và 15%
Kết quả trên ảnh điện di khảo sát cho thấy, có 2 điều kiện kết tủa tương đối tốt là: (i) TCA nồng độ 30% trong điều kiện không ủ và (ii) TCA nồng độ 25% trong điều kiện có ủ. Tuy nhiên, kết quả điện di cũng cho thấy ở các giếng sử dụng TCA trong điều kiện có ủ sẽ thu được nhiều băng protein hơn, đặc biệt là các protein có hàm lượng thấp (băng nhỏ) và các proten có khối lượng phân tử thấp. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu với điện di 2-DE sau này.
Bảng 8: Kết quả tính toán nồng độ protein trước và sau khi kết tủa bằng phương pháp Bradford
STT Mẫu OD Hàm lượng
1 Huyết thanh bền nhiệt 0.644 0.77365 2 Kết tủa với TCA 25% 0.612 0.7199
Hiệu quả kết tủa với TCA ở nồng độ 25% và có ủ 10 phút trong 4oC được kiểm tra lại bằng số liệu đo Bradford (bảng 8)
Kết quả thu được từ phương pháp so màu Bradford cho thấy, hàm lượng protein bị hao hụt không đáng kể (khoảng 7%) so với trước khi kết tủa và có tới hơn 93% protein trong mẫu đã được thu hồi. Do đó, qua kết quả khảo sát này, chúng tôi quyết định lựa chọn phương pháp kết tủa với TCA nồng độ 25% trong điều kiện có ủ ở 4oC trong 10 phút để chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm điện di 2-DE.