Phổ khối CID thu được từ nanoLC-MS/MS được phân tích bằng phần mềm Mascot v1.8. Đây là phần mềm có khả năng phân tích dữ liệu phổ MS/MS để nhận dạng protein dựa trên thuật toán Mowse được phát triển bởi MatrixScience (London, UK). Cơ sở dữ liệu được dùng để tìm kiếm trong Mascot là NCBInr, một cơ sở dữ liệu các protein không đồng nhất và toàn diện với khoảng gần 3 triệu trình tự khác nhau được cài đặt trên một máy tính HP Proliant Server. Các thông số để tìm kiếm dữ liệu được cài đặt như sau (hình 7) :
Hình 7. Hình minh họa các thông số của phần mềm Mascot v1.8
Cải biến cố định: carbamindomethyl (C) Điện tích của peptid: +2 hoặc +3. Cải biến biến đổi: oxidation (methyonine, M). Enzym: trypsin
Quá trình nhận diện protein với công cụ tìm kiếm Mascot v1.8 được lặp lại 3 lần.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt
Huyết thanh chứa một hệ protein hết sức đa dạng và phức tạp, trong đó, chỉ tính riêng 22 protein có hàm lượng cao nhất đã chiếm đến 99% lượng protein tổng số [30]. Các protein này gây nhiều cản trở cho quá trình nghiên cứu các protein có hàm lượng thấp, trong khi đó nhiều protein có hàm lượng thấp mới thực sự có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu sinh học và y học [9]. Do đó, phương pháp biến tính nhiệt được sử dụng để làm giảm bớt mức độ phức tạp của mẫu huyết thanh đồng thời giúp thu nhận thêm các protein chịu nhiệt trong huyết thanh.
Huyết thanh tổng số được trộn đều với đệm chiết ETP theo tỷ lệ thể tích 1:1 rồi ủ 10 phút ở 98oC. Sau khi đã biến tính hoàn toàn, mẫu được đưa về nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút rồi ly tâm tách pha ở 12000 vòng/phút trong 15 phút. Kết quả của quá trình xử lý nhiệt được thể hiện trong hình 8.
Hình 8. Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt. A. Huyết thanh trước khi xử lý biến tính nhiệt. B. Huyết thanh sau khi biến tính nhiệt (Phần dịch nổi là dung dịch chứa các protein bền nhiệt. Phần cặn là kết tủa của các protein không bền nhiệt đã bị biến tính)
Kết quả thu được trên ảnh cùng với việc hút chuyển dịch nổi bằng pipetman chính xác cho thấy tỷ lệ thể tích giữa phần cặn và phần dịch nổi xấp xỉ 1:1. Như vậy, có khả năng các protein bền nhiệt trong huyết thanh chưa bị pha loãng và nếu phương pháp xử lý nhiệt, thu hồi mẫu có hiệu quả thì nồng độ các protein bền nhiệt trong dịch nổi xem như tương đương với nồng độ của chúng trong huyết thanh nguyên. Hàm lượng của các protein bền nhiệt này sẽ tiếp tục được đánh giá tương đối bằng phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE và khẳng định lại bằng phép đo Bradford.
3.2. Điện di SDS-PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được
Để định lượng tương đối và đánh giá thành phần các protein bền nhiệt thu được, phần dịch nổi thu được từ huyết thanh sau khi biến tính nhiệt được chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng điện di biến tính SDS-PAGE ở nồng độ gel 12,6%, bản điện di được hiện màu bằng Comassive Blue Brilliant R-250. Kết quả điện di kiểm tra của các protein huyết thanh chịu nhiệt được thể hiện trong hình 9.
Hình 9. Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt. Đường chạy M: Thang protein marker chuẩn;
Đường chạy1: Dung dịch huyết thanh đã pha loãng 40 lần; Đường chạy 2: Dịch nổi chứa protein bền nhiệt.
Với lượng mẫu ở đường chạy số 1 là 10µl huyết thanh đã pha loãng 40 lần, ở đường chạy số 2 là 15µl dịch nổi chứa protein bền nhiệt và mức độ biểu hiện trên gel điện di, có thể thấy hàm lượng protein bền nhiệt trong huyết thanh nguyên là rất thấp so với hàm lượng protein tổng số. Ở đường chạy số 1, xuất hiện một băng lớn có kích thước khoảng 66.2 kDa, tương đương kích thước của protein Albumin trong huyết thanh, sự có mặt của Albumin sẽ cản trở việc nghiên cứu trên protein khác. Trong khi đó ở đường chạy số 2 không còn thấy xuất hiện băng lớn của Albumin chứng tỏ bằng phương pháp biến tính nhiệt, chúng tôi đã loại bỏ được hầu hết protein này. Nhờ đó sự phân tách của các protein khác rõ ràng hơn, xuất hiện nhiều băng có kích thước nhỏ hơn.
Các kết quả trên cho thấy, bằng phương pháp xử lý biến tính nhiệt, chúng tôi đã thu được các protein bền nhiệt, đồng thời làm đơn giản thành phần protein trong huyết thanh. Kết quả này sẽ giúp cho các protein phân tách tốt hơn khi điện di 2-DE [22].
Ngoài ra, nếu so sánh với các phương pháp làm đơn giản mẫu protein huyết thanh khác như Aurum serum protein Mini Kit, cột sắc ký đa ái lực (Multiple Affinity Removal LC Column - Agilent), IgY-microbeads kit (Seppro), Cut off, … thì phương pháp biến tính nhiệt rõ ràng là đơn giản, dễ làm và đỡ tốn kém hơn.
3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford
Bradford là phương pháp định lượng protein đơn giản và chính xác trong số các phương pháp xác định nồng độ protein trong dung dịch.
Sử dụng phương pháp so màu Bradford cho phép chúng tôi xác định chính xác hàm lượng protein bền nhiệt thu được từ dịch nổi, đánh giá được tỷ lệ protein bền nhiệt so với hàm lượng protein tổng số của huyết thanh trong mẫu nghiên cứu, đồng thời cũng giúp cho việc tính toán chính xác lượng mẫu cần thiết phục vụ cho các thí nghiệm điện di 2-DE sau này.
Đường chuẩn nồng độ BSA được xây dựng từ số liệu đo OD của 7 dung dịch BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125 mg/ml đến 2 mg/ml), thí nghiệm đo được lặp lại 3 lần và lấy giá trị đo trung bình. Kết quả đo OD của các dung dịch chuẩn này được ghi lại trong bảng 5.
Bảng 5: Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn STT Nồng độ BSA (mg/ml) OD 1 0.125 0.163 2 0.25 0.294 3 0.5 0.560 4 0.75 0.747 5 1 0.850 6 1.5 1.058 7 2 1.258
Từ kết quả đo OD các nồng độ BSA chuẩn ở bước sóng A595 nm trên máy quang phổ, chúng tôi đã sử dụng phần mềm xử lý số liệu thống kê Excel để xây dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính dạng y = ax + b nhằm xác định chính xác nồng độ protein có mặt trong các mẫu nghiên cứu. Kết quả dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính lý thuyết được thể hiện trong hình 10.
Hình 10: Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford
Phương trình đường chuẩn thu được có bình phương hệ số tương quan R2 = 0,9502 đảm bảo mức độ tuyến tính và xác suất tin cậy của phương trình đã đưa ra. Dựa trên phương trình này và tiếp tục tính toán trên phần mềm Excel, chúng tôi thu được kết quả xác định nồng độ protein trong các mẫu nghiên cứu, kết quả được thể hiện trong bảng 6.
Bảng 6 : Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford
1 Huyết thanh bền nhiệt 0.644 0.77365 2 Huyết thanh pha loãng 40 lần 1.1048 1.54724
3 Huyết thanh nguyên 61.89
Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy với phương pháp xử lý biến tính nhiệt như chúng tôi đã thực hiện thì hàm lượng protein bền nhiệt trong huyết thanh thu được từ mẫu nghiên cứu chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ so với protein tổng số, khoảng 1,25%. Kết quả này được thể hiện trong hình 11.
Hình 11: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với protein tổng số
3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt
Điện di hai chiều là phương pháp nghiên cứu protein truyền thống, tuy nhiên đến nay vẫn có nhiều ưu thế như có thể xác định, so sánh hình ảnh tương quan của các mẫu với hàng nghìn protein ở các trạng thái khác nhau (dạng bình thường, bệnh lý, nghiên cứu mức độ biểu hiện của các protein khác nhau, đánh giá khả năng phân tách protein từ mẫu huyết thanh nguyên và huyết thanh sau khi được xử lý loại các protein hàm lượng lớn ...) [19,20,21]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu protein huyết thanh sau khi được xử lý biến tính nhiệt và thu dịch nổi đã loại bỏ được hầu hết các protein có hàm lượng lớn, kém bền nhiệt và trở nên đơn giản hơn nhiều so với mẫu huyết thanh ban đầu, tạo điều kiện cho các protein phân tách tốt hơn trên bản điện di 2-DE.
Tuy nhiên, trong dung dịch protein thu được còn chứa đệm ETP mà các thành phần có mặt trong đó có thể gây ảnh hưởng đáng kể đến quá trình chạy điện di 2-DE.
Do đó, để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần này và tối ưu hóa kết quả của thí nghiệm điện di 2-DE, chúng tôi tiến hành khảo sát thí nghiệm này trên thanh Strip pH 3-10 với kích thước 7cm theo quy trình đã nêu ở mục 2.2.5, bản điện di được nhuộm màu bằng Comassive Blue Brilliant R-250.
Trong quá trình tiến hành điện di IEF, chúng tôi nhận thấy các thông số hiệu điện thế (Voltage) trong các bước thí nghiệm đều không đạt được như chương trình đã đặt (xem bảng 5). Tại một số thời điểm, sự gia tăng tuyến tính của hiệu điện thế bị gián đoạn kéo dài, do đó hiệu điện thế của dòng điện không đạt được các giá trị đã chọn, làm tăng thời gian chạy thí nghiệm và gây ra những ảnh hưởng không mong muốn đến kết quả điện di.
Bảng 7: Sự biến đổi của hiệu điện thế theo thời gian
(A) theo chương trình cài đặt ; (B) trong thực tế theo dõi
Voltage Time Volt - Hours Ramp
Step 1 250 20 min --- Linear
Step 2 4000 2hr --- Linear
Step 3 4000 --- 10000 V - hr Rapid
Total 5hr 14000 V - hr
A
Step 1 Step 2 Step 3
Phút thứ 8 10 15 20 90 95 105 140 180 188 3000 120 00 Voltage 17 59 23 27 140 150 207 122 364 270 127 103 6 B
Kết quả ảnh điện di 2-DE thu được (hình 12) cũng cho thấy sự phân tách protein chưa tốt, nhiều protein xuất hiện ở dạng vệt – dải (được đánh số 1, 2, 3 ở trên hình)
Hình 12: Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt. HW: vùng khối lượng phân thử cao; LW: vùng khối lượng phân tử thấp
Tất cả các đặc điểm này cho thấy đã có sự ảnh hưởng của các thành phần đệm trong mẫu đến quá trình điện di IEF, đặc biệt là rất phù hợp với các nghiên cứu về ảnh hưởng của Tris ở nồng độ cao đến điện di IEF và 2-DE (hình 3)[17], trong đó đặc trưng nổi bật là vùng hội tụ của Tris (được đánh dấu bằng mũi tên đỏ trên ảnh) ở khoảng pH 8 mà tại đó có sự tập hợp của các protein thành một hàng dọc.
Tris là một phân tử nhỏ hơi base, có pKa ở 20oC là 8,3 và có thể thay đổi theo nhiệt độ [17, 18]. Trong quá trình điện di IEF, nồng độ Tris được tăng lên nhanh chóng do có sự hội tụ tại pKa của nó, quá trình này diễn ra nhanh hơn nhiều so với sự hội tụ của các protein. Khi đó Tris sẽ tạo ra một vùng hội tụ cục bộ (local) gọi là Tris zone mà tại đó, tính dẫn điện của dung dịch tăng mạnh làm sụt giảm điện thế ở các vùng lân cận [17]. Kết quả là sự dịch chuyển trong điện trường của các protein đến điểm đẳng điện bị cản trở và phần lớn protein sẽ bị tập hợp thành một hàng dọc tại vùng hội tụ của Tris (Tris zone) (hình 13).
Hình 13: Sự hội tụ của Tris trên bản điện di 2-DE tại pH ứng với pKa của nó
Như vậy, việc sử dụng Tris ở nồng độ cao là một yếu tố cần thiết để thu được các protein bền nhiệt trong quá trình biến tính. Tuy nhiên, sự có mặt của nó trong quá trình điện di IEF có thể gây ra những ảnh hưởng không mong muốn đến sự hội tụ của các protein tại pI tương ứng của chúng.
Nhằm loại bỏ những ảnh hưởng này của Tris, chúng tôi đã thử nghiệm nghiên cứu và đề ra 2 chiến lược như sau:
(1) Thu hẹp dải pH dùng trong điện di IEF sao cho pH < 8.
(2) Loại bỏ Tris ra khỏi mẫu bằng phương pháp kết tủa protein và tiếp tục tiến hành điện di 2-DE trên dải pH 3-10.
3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp
Do pKa của Tris là 8,3 ở 20oC nên việc lựa chọn dải pH < 8, không chứa vùng hội tụ của Tris, sẽ giúp loại bỏ ảnh hưởng của nó đến quá trình điện di. Việc thu hẹp dải pH nghiên cứu kết hợp với tăng kích thước của thanh Strip cũng giúp cho các protein phân tách nhau tốt hơn [39].
Ngoài ra, đa số các protein trong huyết thanh có pI nằm trong khoảng 4-8 [46] nên việc khảo sát các protein bền nhiệt trong huyết thanh ở vùng pH này vẫn cho những kết quả có ý nghĩa.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn thanh Strip có dải pH 4-7 và kích thước 17cm. Kết quả điện di sau khi hiện màu bằng thuốc nhuộm Comassive Blue Brilliant R-250 được thể hiện trong hình 14.
Hình 14: Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt trên dải pH 4-7. HW: vùng khối lượng phân thử cao; LW: vùng khối lượng phân tử thấp
Kết quả theo dõi cho thấy sự biến đổi hiệu điện thế theo thời gian hoàn toàn tương ứng với chương trình đã cài đặt. Đồng thời, kết quả thu được trên ảnh điện di cũng cho thấy các protein phân tách nhau khá tốt, đặc biệt là không còn thấy xuất hiện vùng hội tụ của Tris. Điều này chứng tỏ chiến lược thu hẹp dải pH đã đặt ra là hoàn toàn phù hợp, quá trình điện di IEF không bị ảnh hưởng bởi Tris trong dải pH này. Kết quả này cũng rất phù hợp và đủ điều kiện để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo, bao gồm cắt gel, thủy phân và nhận diện bằng hệ thống sắc ký lỏng Nano một chiều kết nối với khối phổ liên tục (1DnanoLC-ESI-MS/MS).
7 vùng được đánh dấu đỏ và đánh số trên hình 14 là những vùng đã được chúng tôi lựa chọn để tiến hành nhận diện bằng hệ thống phân tích khối phổ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein
Để tiếp tục khảo sát thành phần protein bền nhiệt trong huyết thanh trên dải pH 3-10, nhằm đánh giá toàn diện hơn hệ protein này, đặc biệt là các protein có pI nằm trong vùng pH thấp hoặc cao mà không bị ảnh hưởng bởi sự hội tụ của Tris trong quá trình điện di IEF, chúng tôi tiến hành loại bỏ Tris có mặt trong mẫu. Có nhiều phương pháp giúp loại bỏ Tris ra khỏi mẫu protein, nhưng trong điều kiện cụ thể của nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp kết tủa protein. Phương pháp này cho phép loại bỏ hầu hết các thành phần đệm, muối tự do có mặt trong mẫu, đồng thời cô đặc protein có trong mẫu, giúp người nghiên cứu chủ động hơn trong tính toán nồng độ protein sau khi hòa tan kết tủa trở lại [29].
Trong số các phương pháp kết tủa protein thì kết tủa bằng TCA (trifloracetic acid) là một trong những phương pháp phổ biến và đã chứng minh được hiệu quả trong việc làm sạch mẫu, phục vụ cho thí nghiệm điện di 2-DE [29]. Để tối ưu hóa qui trình kết tủa với TCA, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả kết tủa với các dung dịch TCA có nồng độ khác nhau ở 2 điều kiện là: (i) có ủ ở 4oC trong 10 phút và (ii) không ủ.
Protein trong dung dịch thu được sau khi biến tính nhiệt được kết tủa bằng TCA theo các bước như quy trình đã nêu ở mục 2.2.2. Kết tủa protein sau đó được hòa tan trong nước cất 2 lần và đệm mẫu dùng cho điện di biến tính SDS-PAGE. Dung dịch thu được dùng để kiểm tra bằng phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE trên bản gel có nồng độ 12,6%.
Sau khi nhuộm gel bằng dung dịch Comassive Blue Brilliant R-250 và tẩy màu, chúng tôi thu được kết quả điện di SDS-PAGE như trong hình 15.