Bradford là phương pháp định lượng protein đơn giản và chính xác trong số các phương pháp xác định nồng độ protein trong dung dịch.
Sử dụng phương pháp so màu Bradford cho phép chúng tôi xác định chính xác hàm lượng protein bền nhiệt thu được từ dịch nổi, đánh giá được tỷ lệ protein bền nhiệt so với hàm lượng protein tổng số của huyết thanh trong mẫu nghiên cứu, đồng thời cũng giúp cho việc tính toán chính xác lượng mẫu cần thiết phục vụ cho các thí nghiệm điện di 2-DE sau này.
Đường chuẩn nồng độ BSA được xây dựng từ số liệu đo OD của 7 dung dịch BSA chuẩn với các nồng độ khác nhau (từ 0,125 mg/ml đến 2 mg/ml), thí nghiệm đo được lặp lại 3 lần và lấy giá trị đo trung bình. Kết quả đo OD của các dung dịch chuẩn này được ghi lại trong bảng 5.
Bảng 5: Kết quả đo OD của các nồng độ BSA chuẩn STT Nồng độ BSA (mg/ml) OD 1 0.125 0.163 2 0.25 0.294 3 0.5 0.560 4 0.75 0.747 5 1 0.850 6 1.5 1.058 7 2 1.258
Từ kết quả đo OD các nồng độ BSA chuẩn ở bước sóng A595 nm trên máy quang phổ, chúng tôi đã sử dụng phần mềm xử lý số liệu thống kê Excel để xây dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính dạng y = ax + b nhằm xác định chính xác nồng độ protein có mặt trong các mẫu nghiên cứu. Kết quả dựng đường chuẩn và phương trình tuyến tính lý thuyết được thể hiện trong hình 10.
Hình 10: Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford
Phương trình đường chuẩn thu được có bình phương hệ số tương quan R2 = 0,9502 đảm bảo mức độ tuyến tính và xác suất tin cậy của phương trình đã đưa ra. Dựa trên phương trình này và tiếp tục tính toán trên phần mềm Excel, chúng tôi thu được kết quả xác định nồng độ protein trong các mẫu nghiên cứu, kết quả được thể hiện trong bảng 6.
Bảng 6 : Kết quả tính toán nồng độ protein trong mẫu theo phương pháp Bradford
1 Huyết thanh bền nhiệt 0.644 0.77365 2 Huyết thanh pha loãng 40 lần 1.1048 1.54724
3 Huyết thanh nguyên 61.89
Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy với phương pháp xử lý biến tính nhiệt như chúng tôi đã thực hiện thì hàm lượng protein bền nhiệt trong huyết thanh thu được từ mẫu nghiên cứu chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ so với protein tổng số, khoảng 1,25%. Kết quả này được thể hiện trong hình 11.
Hình 11: Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với protein tổng số